王 娟，張曉燕，朱愛華，于宏波，范新丹，湯春輝，姚秀芳

(1.南通大學(xué)附屬婦幼保健院 婦產(chǎn)科，江蘇 南通 226001； 南通大學(xué)附屬如東醫(yī)院 2.婦產(chǎn)科； 4.病理科，江蘇 南通 226400；3.南通大學(xué)附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南通 226001)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)被認(rèn)為是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一，其病死率居首位。盡管臨床上常采用手術(shù)聯(lián)合化學(xué)藥物治療、放射治療等多種治療手段，但患者總的5年生存率仍較低[1]。因此，需要尋找一種潛在的、特殊的分子，以便為未來(lái)開發(fā)一種更有效的檢測(cè)及治療方法顯得尤為重要。

DNA損傷可引起細(xì)胞異常增殖、分化和凋亡，最終導(dǎo)致癌變。DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks, DSB)是最嚴(yán)重的一種DNA損傷類型，它可以被DNA DSB修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)，非同源端連接(non-homologous end-joining, NHEJ)是人類主要的DNA DSB修復(fù)系統(tǒng)[2]，而Ku70/XRCC6是此途徑所必需的[3]。Ku70參與了多個(gè)核過程，包括DNA修復(fù)、端粒維護(hù)和細(xì)胞凋亡[4]。有報(bào)道Ku70也位于細(xì)胞質(zhì)中，調(diào)控抗凋亡Bcl-2家族成員。近年來(lái)，有研究表明Ku70與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，如宮頸癌[5]、乳腺癌[6]、肺癌[4]、肝癌[7]等。

本研究通過檢測(cè)Ku70在人卵巢癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)，觀察卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移，探討Ku70在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的意義。旨在為卵巢癌尋找新的標(biāo)志物和分子治療靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本：對(duì)2004—2009年在南通大學(xué)附屬醫(yī)院治療的119例EOC手術(shù)標(biāo)本(包括61例漿液腺癌、5例黏液癌、10例子宮內(nèi)膜樣腺癌、10例透明細(xì)胞癌和33例其他類型癌)進(jìn)行免疫組化。從南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科檔案中收集119例標(biāo)本資料，并追蹤其5年生存率的結(jié)果。12個(gè)新鮮標(biāo)本在手術(shù)取出后立即用液氮冷凍，-80℃保存，用于Western blot分析，其中包括3例正常新鮮組織和9例EOC組織。所有標(biāo)本的收取均經(jīng)南通大學(xué)附屬如東醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(NO.20190062)。

1.1.2 細(xì)胞系：人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、SKOV3、OVCAR3、HO8910(上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)。

1.1.3 試劑：小鼠抗人Ku70單克隆抗體、小鼠抗人Ki-67單克隆抗體、小鼠抗人cyclin D1單克隆抗體、小鼠抗人PCNA單克隆抗體、小鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、小鼠抗人Bax單克隆抗體和兔抗人GAPDH多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)；HRP 標(biāo)記抗兔 IgG(Sigma-Aldrich公司)；CCK-8試劑(Dojindo, Kumamoto公司); Ku70-siRNA及其陰性對(duì)照control-siRNA(GenePharma公司)。所有siRNA序列如下:Ku70-siRNA#1(5′-GUGAUG UCCAAUUCAAGAUTT-3′)；Ku70-siRNA#2(5′-GC AUCUUCCUUGACUUGAUTT-3′)；Ku70-siRNA#3(5′-CUGUGGGCAUUUAUAAUCUTT-3′)；Control-siRNA(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及處理：所有細(xì)胞在1640培養(yǎng)基中增殖，培養(yǎng)基中添加10%熱滅活胎牛血清，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：HO8910細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，匯合度達(dá)到80%時(shí)，根據(jù)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒提供的說明書，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將Ku70-siRNA和control-siRNA導(dǎo)入HO8910細(xì)胞系。在無(wú)血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 6 h，然后換成 10%的完全培養(yǎng)基培養(yǎng) 48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot、CCK-8、集落形成、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和凋亡染色的流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.2 Western blot檢測(cè)蛋白：樣本組織加入蛋白裂解液，提取組織蛋白，按比例配制待測(cè)樣品，進(jìn)行 SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF(polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜)膜上，在含5%脫脂奶粉的 TBST(tris buffered saline tween，含吐溫的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液)中室溫封閉 2 h，加一抗(兔抗人Ku70多克隆抗體，1∶400)室溫孵育 2 h或4 ℃孵育過夜，用TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗室溫孵育 2 h，然后用TBST沖洗3次，每次15 min。這些條帶由增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(Pierce, Rockford, IL)顯示。使用ImageJ分析系統(tǒng)測(cè)量條帶強(qiáng)度。

1.2.3 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)檢測(cè)蛋白表達(dá)：手術(shù)切除的組織用10%甲醛固定，石蠟包埋，在玻片上制備4 μm厚的標(biāo)本切片。切片在二甲苯中常規(guī)脫蠟，通過分級(jí)乙醇系列再水化，然后在10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH=6.0)中用高壓滅菌器加熱到121 ℃ 3 min進(jìn)行抗原回收。H2O2(0.3%)冷卻20 min后，內(nèi)源性過氧化物酶活性被阻斷。PBS(pH=7.2)沖洗后，用小鼠抗人Ku70抗體(1∶400稀釋)和小鼠抗人Ki-67抗體(1∶500稀釋)室溫孵育3 h。所有玻片均采用過氧化物酶-抗過氧化物酶法處理。PBS洗滌后，用顯色劑二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)(0.1%磷酸鹽緩沖液，0.02 %二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽和3% H2O2)孵育切片，觀察過氧化物酶反應(yīng)。切片用水沖洗后，用蘇木精進(jìn)行反染色。然后用分級(jí)酒精脫水。結(jié)果由兩位研究員采用雙盲法使用徠卡熒光顯微鏡獨(dú)立閱片。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染細(xì)胞以2×104cells/well(體積為100 μL)接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning Inc, Corning NY, USA)中，孵育24 h。然后每孔加10 μL CCK-8試劑，37 ℃的暗室中孵育1.5 h。根據(jù)廠家的技術(shù)說明，在測(cè)試波長(zhǎng)為450 nm和參考波長(zhǎng)為630 nm的情況下，使用微孔板閱讀器(Bio-Rad)測(cè)量吸光度值。

1.2.5 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染了Ku70-siRNA#1和control-siRNA 的HO8910細(xì)胞的單細(xì)胞懸液(約50個(gè)細(xì)胞)接種于培養(yǎng)皿中，14 d后集落用0.5%結(jié)晶紫染色30 min。對(duì)樣本進(jìn)行拍照，并統(tǒng)計(jì)可見集落的數(shù)量。

1.2.6 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)分析細(xì)胞凋亡：轉(zhuǎn)染Ku70-siRNA#1和對(duì)照control-siRNA的HO8910細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集。在每根試管中加入60 μL的懸浮細(xì)胞，然后在每根試管中加入60 μL的檢測(cè)試劑。在室溫下黑暗孵育20 min后，根據(jù)試劑盒提供的說明書，使用MuseTM細(xì)胞分析儀進(jìn)行凋亡檢測(cè)。

1.2.7 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白間相互作用：收集HO8910細(xì)胞并在緩沖液(50 mmol/L, Tris-HCl, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/lL EDTA, 1% NP-40, 0.5%去氧膽酸，0.1% SDS)中裂解。收集上清30 μL作為Input。剩下的液體用30 μL protein A/G agarose在4 ℃中預(yù)處理 2 h。之后,預(yù)處理的上清液分離成兩部分，分別加入6 μL鼠單克隆抗體Ku70和0.3 μL老鼠免疫球蛋白IgG在4 ℃中低速孵化過夜。然后加入30 μL protein A/G在4 ℃中低速孵育2 h，去除上清液，收集沉積物，然后使用針對(duì)Ku70和Bax的特異性抗體對(duì)免疫復(fù)合物進(jìn)行免疫印跡分析。

1.2.8 免疫熒光檢測(cè)基因表達(dá)：將轉(zhuǎn)染了Ku70-siRNA和control-siRNA的HO8910細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，加入含有10%滅活胎牛血清的1640培養(yǎng)基，放置在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。然后用PBS洗滌，在室溫下用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用PBS洗滌3次，然后用0.2% Tritonx-3%牛血清白蛋白-PBS滲透10 min。用0.1% BSA緩沖液在室溫下封閉2 h，然后在室溫下用Ku70抗體孵育2 h，PBS洗滌后，用二抗孵育細(xì)胞，用hochest進(jìn)行反染色，并用熒光顯微鏡(Leica CTR 5000)觀察。

1.2.9 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：細(xì)胞在6孔板的單層細(xì)胞中幾乎完全匯合。轉(zhuǎn)染48 h后，血清饑餓細(xì)胞12 h。然后用10 μL的移液管尖端在滿細(xì)胞的6孔培養(yǎng)板中間做劃痕，用PBS洗滌脫落的細(xì)胞，加入含有1%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，放入37 ℃，含有5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用20×物鏡的相差顯微鏡拍攝0 h和24 h時(shí)的細(xì)胞狀態(tài)。

1.2.10 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲：經(jīng)Ku70-siRNA#1和control-siRNA預(yù)處理的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶處理后重懸于不含血清白蛋白的1640培養(yǎng)基中。將細(xì)胞(約1×105個(gè)/孔)添加到24孔趨化板Transwell小室 (Corning，孔徑8 μm)的頂部腔室中，并在底部腔室中添加含有10% FBS的1640培養(yǎng)基。孵育24 h后，去除頂部(未遷移)細(xì)胞，底部(遷移)細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色可見細(xì)胞。在200倍顯微鏡下統(tǒng)計(jì)5個(gè)區(qū)域的遷移細(xì)胞數(shù)量，并測(cè)定每個(gè)腔室的平均值。所有實(shí)驗(yàn)都是重復(fù)進(jìn)行的。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Ku70在上皮性卵巢癌組織和細(xì)胞中過表達(dá)。

Ku70在腫瘤組織的表達(dá)水平高于正常組織(圖1A～B)。Ku70在4株卵巢癌細(xì)胞系中高表達(dá)，其中在HO8910細(xì)胞中表達(dá)最顯著(圖1C)。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA后HO8910細(xì)胞中Ku70的表達(dá)被抑制，其中Ku70-siRNA#1的下調(diào)效果最明顯，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1D)。Ku70在119例上皮性卵巢癌樣本中的表達(dá)情況，與預(yù)期一致，Ku70在分化差的標(biāo)本中表達(dá)高于分化好的標(biāo)本，這與Ki-67一致(圖2)。

圖1 Ku70在EOC組織和HO8910細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig 1 Expression of Ku70 in EOC tissues and HO8910 n=3)

圖2 免疫組化分析Ku70、Ki-67在119例EOC組織中的表達(dá)及分布

在上皮性卵巢癌患者組織樣本,Ku70高表達(dá)與腫瘤分期(P<0.001),腫瘤分級(jí)(P<0.05),有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)及有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P<0.05)密切相關(guān)(表1)。此外，Ku70的表達(dá)與Ki-67的增殖活性也呈正相關(guān)(r=0.642,P<0.001)(圖3)。

表1 Ku70和Ki-67在119例EOC樣本中的表達(dá) 及臨床病理特征

圖3 Ku70與Ki-67增殖指數(shù)在EOC中表達(dá)的相關(guān)性Fig 3 Relationship between Ku70 and Ki-67 prolifera- tion index expression in EOC

2.2 Ku70表達(dá)與上皮性卵巢癌患者生存率的關(guān)系

Ku70高表達(dá)的患者其5年生存率低，年齡(P<0.05)，腫瘤分級(jí)(P<0.05)， 腫瘤分級(jí)(P<0.001)，組織學(xué)類型(P<0.05)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P<0.001)，Ku70表達(dá)(P<0.001)，Ki-67表達(dá)(P<0.001)與其5年生存率密切相關(guān)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析臨床病理特征的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值，患者的5年生存率與患者年齡(P<0.001)，腫瘤分級(jí)(P<0.05)，Ki-67(P<0.05)及 Ku70 的表達(dá) (P<0.05)密切相關(guān)，Ku70的表達(dá)可以作為評(píng)估卵巢癌患者5年生存率的一個(gè)獨(dú)立因素(圖4，表2)。

圖4 根據(jù)Ku70蛋白表達(dá)情況繪制119例EOC患者 Kaplan-Meier生存曲線Fig 4 Kaplan-Meier survival curves for 119 EOC patients according to Ku70 protein expression status(long-rank test)

表2 單因素和Cox回歸分析119 EOC樣本中各種病理因素對(duì)生存率的影響

2.3 低表達(dá)Ku70可抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖

與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了Ku70-siRNA#1及Ku70-siRNA#2的HO8910細(xì)胞增殖被抑制(圖5A)。轉(zhuǎn)染Ku70-siRNA#1及Ku70-siRNA#2后，HO8910細(xì)胞形成的集落數(shù)量和大小均顯著減少(圖5C,D)。此外，Ku70-siRNA #1及Ku70-siRNA#2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中Ku70的表達(dá)顯著降低，與PCNA、cyclin D1的下調(diào)一致(圖5B)。

A.down-regulating Ku70 inhibited cell proliferation by CCK-8 assay; B.down-expressed Ku70 inhibited the expression of cell-cycle-related proteins like cyclin D1 and PCNA; C,D.inhibition of Ku70 expression could inhibit the proliferation of HO8910 cells by colony formation assay; *P<0.05 compared with control-siDNA

2.4 Ku70表達(dá)缺失誘導(dǎo)卵巢腫瘤細(xì)胞凋亡

與control-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，Ku70-siRNA#1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡百分率顯著升高(圖6A)。Ku70參與了Bax (Bcl-2家族之一)凋亡通路，這與研究結(jié)果一致(圖6B,C)。免疫熒光分析證實(shí)Ku70確實(shí)位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中(圖6D)。

A.inhibiting Ku70 promotes apoptosis of HO8910 cells by flow cytometry; B.Western blot was used to detect the protein levels of Bcl-2 and Bax when inhibiting Ku70 compase with control; C.interaction of Ku70 and Bax was demonstrated by co-immunoprecipitation assay; D.blue nucleus, green cytomembrane located by immunofluorescence(×200)

2.5 下調(diào)Ku70表達(dá)可減緩卵巢腫瘤細(xì)胞的遷移

Ku70的下調(diào)表達(dá)可以通過使被劃傷HO8910細(xì)胞的“傷口”更慢地愈合，從而減少傷口愈合過程(圖7A)。同時(shí)，在Transwell 小室實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，Ku70的下調(diào)表達(dá)抑制了細(xì)胞向底腔的遷移(圖7B)。

A.effect of Ku70 knockout on the migration of HO8910 cells by wound healing assays(×40); B.Transwell assays were used to detect the effect of Ku70 knockout on the migration of HO8910 cells(×200); *P<0.05 compared with control

3 討論

上皮性卵巢癌(EOC)被認(rèn)為是最致命的婦科腫瘤之一，雖然臨床采用手術(shù)、化學(xué)治療和放射治療等綜合治療手段，但其在婦科惡性腫瘤中病死率仍最高[1]。此外，EOC具有高復(fù)發(fā)率和多藥耐藥性，患者5年生存率低[8]。因此，更好地了解EOC的分子機(jī)制有助于靶向化療藥物的研發(fā)。

NHEJ被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要的DNA修復(fù)途徑，而Ku70是參與NHEJ的主要因子。Ku70的失調(diào)使細(xì)胞對(duì)DNA損傷敏感，突變和染色體畸變的積累導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和過度細(xì)胞增殖，增強(qiáng)基因組不穩(wěn)定引發(fā)腫瘤[2,9]。研究表明，Ku70與細(xì)胞增殖、凋亡和遷移有關(guān)[7,10-11]。本研究通過集落形成、CCK-8、PCNA、cyclin D1檢測(cè)，初步提示Ku70下調(diào)表達(dá)可能通過細(xì)胞周期過程降低EOC細(xì)胞增殖。此外，流式細(xì)胞儀分析顯示， 降低Ku70的表達(dá)可能促進(jìn)EOC細(xì)胞凋亡。通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小孔實(shí)驗(yàn)測(cè)定Ku70誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的能力。以上結(jié)果提示，Ku70的過表達(dá)可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

一些研究證實(shí)，Ku70也位于細(xì)胞質(zhì)中，通過隔離癌組織線粒體中的Bax來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，而當(dāng)Ku70從Bax釋放時(shí)，Bax可以轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中，觸發(fā)細(xì)胞色素C的釋放，導(dǎo)致caspase依賴的細(xì)胞凋亡[4]。本研究中，免疫組化和免疫熒光顯示Ku70位于EOC細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，這與報(bào)道[12]一致。流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)分析顯示，下調(diào)Ku70可誘導(dǎo)EOC細(xì)胞凋亡。Western blot顯示，在Ku70-siRNA#1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，促凋亡的Bax表達(dá)增加，抗凋亡的Bcl-2表達(dá)減少。免疫共沉淀顯示Ku70與Bax在EOC中相互作用。以上結(jié)果提示，Ku70可能是EOC中Bax凋亡通路抑制細(xì)胞凋亡的重要原因。

綜上所述，抑制Ku70表達(dá)可延緩EOC細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Ku70可能通過參與NHEJ的DSB修復(fù)機(jī)制，調(diào)控細(xì)胞周期及caspase依賴的細(xì)胞途徑發(fā)揮作用。Ku70可能是卵巢癌等腫瘤的重要治療靶點(diǎn)。