范盎然 于雪 王旭 王淑艷 陳紫微 魏鵬

摘要 目的：觀察三七總皂苷（PNS）對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)的治療作用，同時(shí)探討其可能機(jī)制。方法：通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)PCR法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，對(duì)照研究PNS對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 246.7細(xì)胞中炎性反應(yīng)調(diào)控因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α（PPAR-α）以及其下游調(diào)控的炎性反應(yīng)遞質(zhì)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、C反應(yīng)蛋白（CRP）和重組人巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF），白細(xì)胞介素6（IL-6），炎性反應(yīng)相關(guān)氧化因子誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和環(huán)氧化酶-2（COX-2）表達(dá)的影響。結(jié)果：小鼠巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)模型制備后TNF-α、CRP、M-CSF、IL-6、iNOS及COX-2水平明顯上調(diào)，三七總皂苷給藥后，細(xì)胞炎性反應(yīng)遞質(zhì)與造模組比較有顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：三七總皂苷可明顯抑制小鼠巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)效應(yīng)，其作用機(jī)制可能通過(guò)激活調(diào)控因子PPAR-α實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞? 巨噬細(xì)胞;炎性反應(yīng)模型;小鼠;三七總皂苷;機(jī)制;過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α;炎性調(diào)控因子;炎性相關(guān)氧化因子

Effects of Panax Notoginseng Saponins on Macrophage Inflammation in Mice

FAN Angran，YU Xue，WANG Xu，WANG Shuyan，CHEN Ziwei，WEI Peng

（School of Traditional Chinese Medicine，Beijing University Of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To observe the therapeutic effects of Panax notoginseng saponins（PNS）on macrophage inflammation in mice and to explore its possible mechanism.Methods：By Western Blotting test，Real-time PCR method and Elisa test，the effects of PNS on the expression of inflammatory regulatory factors PPAR-α，TNF-α，CRP and M CSF，IL 6，iNOS and COX-2 in mice macrophages were comparatively studied.Results：After the establishment of mouse macrophage inflammation model preparations，the concentrations of TNF-α，CRP，M CSF，IL 6，iNOS and COX-2 were significantly up-regulated.After administration of Panax Notoginseng Saponins，the levels of inflammatory factors were significantly lower than those in the model group，and the differences are statistically significant（P<0.001）.Conclusion：Panax notoginseng saponins could significantly inhibit the inflammatory effects of macrophages in mice，and its mechanism may be realized by activating the regulatory factor PPAR-α.

Keywords Macrophage; Inflammation model; Mouse; Panax Notoginseng Saponins; Mechanism; PPAR-α; Inflammatory regulatory factor; Inflammatory related oxidative factor

中圖分類(lèi)號(hào)：R282.6;R273 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.08.002〖HK〗

在血管中，慢性炎性反應(yīng)是引起單核-巨噬細(xì)胞募集，繼而產(chǎn)生泡沫細(xì)胞的主要原因。主要由單核細(xì)胞被炎性反應(yīng)遞質(zhì)募集、巨噬細(xì)胞進(jìn)入動(dòng)脈壁炎性反應(yīng)破損處并分泌釋放更多的炎性反應(yīng)遞質(zhì)和炎性反應(yīng)相關(guān)氧化因子，使得低密度脂蛋白（LDL）被氧化成為氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）、巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL成為泡沫細(xì)胞死亡形成斑塊脂質(zhì)核幾個(gè)過(guò)程組成。故而抑制這一最初的炎性反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的防治中顯得尤為重要，抑制巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)成為預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化方法[1-4]。

三七是臨床常用的中藥材，具有活血化瘀、消腫止痛的作用，臨床廣泛用于心腦血管疾病的治療[5-6]。三七總皂苷是三七的有效活性成分，臨床不少其有效治療動(dòng)脈粥樣硬化的報(bào)道，但其作用機(jī)制目前尚無(wú)統(tǒng)一定論。我們以小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 246.7作為模型，用動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因子ox-LDL造成巨噬細(xì)胞炎性模型，檢測(cè)抗動(dòng)脈粥樣硬化因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α），炎癥遞質(zhì)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、C反應(yīng)蛋白（CRP）和重組人巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、白細(xì)胞介素6（IL-6），炎性相關(guān)氧化因子誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和環(huán)氧化酶-2（COX-2），并采用檢測(cè)炎性反應(yīng)遞質(zhì)TNF-α，試劑盒法檢測(cè)三七總皂苷對(duì)ox-LDL刺激RAW 246.7細(xì)胞的NO釋放的影響，由此探討三七總皂苷（Panax Notoginseng Saponin，PNS）的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 246.7細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。數(shù)量：1×106個(gè)，以10% DMEM+90%胎牛血清凍存于液氮。

1.1.2 藥物

三七總皂苷，購(gòu)自北京百諾威公司，批號(hào)：110870，共100 mg。

1.1.3 試劑及儀器

DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基（Hyclone，批號(hào)：MD207-050），F(xiàn)BS胎牛血清（PAA，批號(hào)：FBS500-S），ox-LDL（北京協(xié)生生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：38293）及LDL（北京協(xié)生生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：31342），SYBR Green realtime PCR混合液（Takara，日本，批號(hào)：RR420A）。自動(dòng)平衡離心機(jī)（湘儀公司，TDZ5-W型），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本SANYO公司，BC-J80/160S型），單人凈化工作臺(tái)（蘇州凈化，SW-CJ-1BU型），DU800核酸蛋白測(cè)定儀（BECKMAN COULTER，美國(guó)，DU800型），熒光定量PCR儀（ABI，美國(guó)，7300型），微孔板化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（Berthold，德國(guó)，OrionII型），冷凍離心機(jī)（SIGMA，美國(guó)，Sigma3K15型），Trizol（Invitrogen，美國(guó)，批號(hào)：15596-026），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Toyobo，日本，批號(hào)：QRA-201）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

將小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放置在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。傳代接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞穩(wěn)定融合至80%時(shí)，培養(yǎng)液中加入ox-LDL，使其終濃度為50 μg/mL。

1.2.2 給藥方法

將成模細(xì)胞分為2組，模型組及給藥組，將PNS預(yù)先加入到完全培養(yǎng)基中干預(yù)1 h，預(yù)先加入到完全培養(yǎng)基中干預(yù)1 h，隨后加入給藥組RAW264.7孵育8 h，每組設(shè)復(fù)孔。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)TNF-α、CRP、IL-6、iNOS和COX-2表達(dá)水平變化：干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞上清液，置離心管中用2 000 r/min離心20 min，吸取上清液，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)TNF-α、CRP、IL-6、iNOS和COX-2蛋白的水平，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)PPAR-α、M-CSF蛋白水平變化：干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液，室溫下靜置10 min后將細(xì)胞置于4 ℃ 2 000 r/min離心20 min，取出上清液，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物公司，批號(hào)：2839392）測(cè)定各樣本的蛋白濃度并計(jì)算出上樣量。經(jīng)電泳SDS-PAGE凝膠將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），滴加PPAR-α、M-CSF及β-actin一抗（購(gòu)自美國(guó)CST公司，濃度均按照1∶1 000稀釋?zhuān)?，脂奶粉封閉PVDF膜2 h，用PBS洗滌PVDF膜3次，5 min/次，加入HRP-二抗，置于室溫輕搖1 h后取出再用PBS洗滌3次。最后進(jìn)行曝光、顯影、定影、拍照和統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件分析，檢測(cè)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三七總皂苷給藥后細(xì)胞炎性反應(yīng)遞質(zhì)的變化

造模后，細(xì)胞中的炎性反應(yīng)遞質(zhì)TNF-α、CRP和M-CSF、IL-6，炎性相關(guān)氧化因子iNOS和COX-2表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而三七總皂苷給藥后，細(xì)胞炎性反應(yīng)遞質(zhì)與造模組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 三七總皂苷給藥對(duì)細(xì)胞炎性反應(yīng)遞質(zhì)TNF-α蛋白水平的影響

PNS給藥后，RAW264.7細(xì)胞中的炎性反應(yīng)遞質(zhì)TNF-α蛋白比較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 三七總皂苷給藥對(duì)細(xì)胞NO釋放量的影響

炎性刺激下，細(xì)胞對(duì)NO的釋放量升高，而PNS可以有效地使RAW264.7的NO釋放水平降低，趨于正常。見(jiàn)圖3。

2.4 三七總皂苷給藥后細(xì)胞炎性調(diào)控因子PPAR-α的變化

RAW264.7在受到刺激產(chǎn)生炎性反應(yīng)時(shí)，伴隨炎性調(diào)控因子PPAR-α的表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而給予PNS治療后，炎性調(diào)控因子PPAR-α的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

慢性炎性反應(yīng)是一個(gè)重要的公共健康問(wèn)題，是多種疾病的潛在誘因，它引發(fā)的疾病可累積多個(gè)器官。如發(fā)生在血管的慢性炎性反應(yīng)，是動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的重要誘因。由于其發(fā)展時(shí)間長(zhǎng)，病程緩慢，慢性炎性反應(yīng)往往不容易被人所察覺(jué)。在治療上，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)采取的抗炎消炎治療并不能很好的解決此類(lèi)炎性問(wèn)題，還會(huì)帶來(lái)各種不良反應(yīng)，嚴(yán)重降低患者的滿意度，不適宜長(zhǎng)期使用。近年來(lái)，中醫(yī)藥得到了廣泛的普及。三七是其中最常用的中藥，因?yàn)樗淖饔靡驯欢鄠€(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：如促進(jìn)血液

循環(huán)、血管保護(hù)[7]，神經(jīng)功能改善[8]，降低氧化應(yīng)激[9]，以及抗炎作用。三七總皂苷（Panax Notoginseng Saponin，PNS）是三七的主要有效成分。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，PNS在心血管疾病中具有重要的作用[10-11]?，F(xiàn)在它的部分產(chǎn)品可作為在中國(guó)和世界范圍內(nèi)的非處]方藥。

[10]Chen S，Liu J，Liu X，et al.Panax notoginseng saponins inhibit ischemia-induced apoptosis by activating PI3K/Akt pathway in cardiomyocytes[J].J Ethnopharmacol，2011，137（1）：263-270.

[11]Yue QX，Xie FB，Song XY，et al.Proteomic studies on protective effects of salvianolic acids，notoginsengnosides and combination of salvianolic acids and notoginsengnosides against cardiac ischemic-reperfusioninjury[J].J Ethnopharmacol，2012，141（2）：659-667.

[12]王文曉，于靜，王攀峰，等.急性冠脈綜合征患者不同調(diào)脂方案的成本-效果分析[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2019，14（8）：26-29，57.

[13]宋明慧.瑞舒伐他汀對(duì)急性冠脈綜合征介入術(shù)后腦鈉肽、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、可溶性細(xì)胞黏附分子、心型脂肪酸結(jié)合蛋白的影響[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2018，13（8）：70-73.

[14]Gerits N，Kostenko S，Moens U.In vivo functions of mitogen-activated protein kinases：conclusions from knock-in and knock-out mice[J].Trans Res，2015，16（10）：281-314.

[15]Baker RG，Hayden MS，Ghosh S.NF-κB，inflammation，and metabolic disease[J].Cell Metab，2011，13（1）：11-22.

[16]Fan JS，Liu DN，Huang G，et al.Panax notoginseng saponins attenuate atherosclerosis via reciprocal regulation of lipid metabolism and inflammation by inducing liver X receptor alpha expression[J].J Ethnopharmacol，2012，142（3）：732-738.