牟健雄,丁崇軍,唐榮慧,葉勇衡,謝 琳,李 衡

(1 四川省西昌市人民醫(yī)院骨科,西昌 615000;2 昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院骨科;* 通訊作者,E-mail:mjxzj820112@163.com)

骨肉瘤是骨腫瘤中惡性程度最高的腫瘤，嚴重威脅青少年生命健康[1]。骨肉瘤對放療和化療均不敏感，臨床治療效果很差[2]。闡明骨肉瘤的發(fā)病機制對基因治療新靶點的發(fā)現具有重要意義。

人類基因組轉錄產物中只有一小部分是具有編碼能力的RNA，絕大部分是非編碼RNA，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是非編碼RNA最重要的組成部分[3,4]。近年來研究發(fā)現，lncRNA雖然沒有開放閱讀框，但其對腫瘤細胞的惡性表型具有重要的調節(jié)作用，lncRNA異常表達能夠顯著影響腫瘤細胞的放療敏感性和化療敏感性[5-7]。AC131056.3是最新發(fā)現的一種lncRNA，其長度為486個核苷酸，AC131056.3在帕金森病患者血液白細胞中的表達異常，可能與帕金森病的發(fā)病有關[8]。目前國內外對AC131056.3在腫瘤中的表達和功能研究很少。LOGpc數據庫分析顯示，AC131056.3高表達的骨肉瘤患者總生存期明顯長于AC131056.3低表達的患者，AC131056.3可能參與調控骨肉瘤細胞的惡性行為。本研究通過觀察AC131056.3在骨肉瘤細胞系中的表達，AC131056.3對骨肉瘤細胞增殖和侵襲活力的影響，探究AC131056.3是否通過靶向miR-21-5p發(fā)揮作用，AC131056.3的作用機制研究可能為骨肉瘤治療提供新的分子靶點。

1 材料和方法

1.1 細胞株與試劑

正常成骨細胞hFOB1.19和骨肉瘤細胞Saos2、U-2OS、MG-63、143B、HOS，均購自中國科學院上海細胞庫。逆轉錄試劑盒、CCK-8試劑盒、qRT-PCR試劑盒，均購自大連寶生物公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自日本TaKaRa公司。pcDNA質粒、pcDNA-AC131056.3質粒、miR-NC mimic、miR-21-5p mimic、雙熒光素酶報告基因載體WT-AC131056.3、MUT-AC131056.3購自北京索萊寶公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、Lipofectamine 2000試劑盒購自上海吉瑪生物制藥有限公司。Transwell小室和基質膠購自美國Promega公司?？筽-Akt、p-mTOR、β-Tubulin、p-PI3K、GSK-3、PDK-1抗體及辣根過氧化酶標記的羊抗鼠二抗購自美國BD公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉染

用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基分別培養(yǎng)hFOB1.19、Saos2、U-2OS、MG-63細胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)143B、HOS細胞，培養(yǎng)參數為37 ℃、5%CO2。將對數生長期的HOS細胞以每孔5×104個接種6孔板，培養(yǎng)48 h，采用Lipofectamine 2000脂質轉染法，分別將pcDNA質粒、pcDNA-AC131056.3質粒轉染HOS細胞，命名為對照組和AC131056.3組。培養(yǎng)48 h后，qRT-PCR檢測兩組HOS細胞中AC131056.3表達。

1.3 生物信息學分析

采用GEPIA數據庫分析骨肉瘤患者總生存期和AC131056.3表達的相關性。采用DIANA-LncBase v3網站預測AC131056.3能夠互補結合的微小RNA(miRNA)。

1.4 qRT-PCR檢測對照組和AC131056.3組HOS細胞中AC131056.3和miR-21-5p的表達

用RNA提取試劑盒提取細胞中總RNA，定量RNA濃度和純度后逆轉錄，將得到的cDNA進行qRT-PCR檢測。反應條件為：97 ℃預變性4 min；97 ℃變性20 s，61 ℃退火27 s，71 ℃延伸27 s，共31次循環(huán)。AC131056.3上游引物為5′-CATGGAATTTTGTCGGTTCA-3′，下游引物為5′-TCAGTTTGCAAGAGGCAGAA-3′；miR-21-5p上游引物為5′-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3′，下游引物為5′-AACTCAAGGTTCTTCCAGTCACG-3′；GAPDH上游引物為5′-GCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物為5′-GGCAACAATATCCACTTTACCAG-3′；U48上游引物為5′-TGACCCCAGGTAACTCTGAGTGTGT-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-ΔΔCt方法計算AC131056.3相對GAPDH的表達以及miR-21-5p相對U48的表達。

1.5 CCK-8法檢測HOS細胞增殖活性

將對照組和AC131056.3組HOS細胞(4×103/孔)接種于96孔板，每組4個平行孔。培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1，2，3，4，5 d。CCK-8實驗檢測時，每孔加CCK-8試劑40 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，多功能酶標儀測定450 nm波長處的吸光度值(A)，A值越高說明增殖活性越強。

1.6 Transwell實驗檢測HOS細胞侵襲活力

在Transwell上室滴加基質膠，培養(yǎng)箱內凝固為膠體。將轉染后的HOS細胞(對照組和AC131056.3組)，以每孔4×104個接種至Transwell上室，給Transwell下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基700 μl，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入8%多聚甲醛固定60 min，加入2%結晶紫染色60 min，清水清洗，倒置顯微鏡下觀察，統(tǒng)計細胞侵襲數。

1.7 雙熒光素酶報告基因驗證AC131056.3與miR-21-5p的結合

將HOS細胞接種在新的6孔板，培養(yǎng)48 h后更換為不含胎牛血清的培養(yǎng)基，采用Lipofectamine 2000脂質轉染法，分別共轉染miR-21-5p mimic與WT-AC131056.3或MUT-AC131056.3、miR-NC mimic與WT-AC131056.3或MUT-AC131056.3，每組4個平行孔。培養(yǎng)48 h后裂解細胞，離心取上清，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測螢火蟲熒光素酶熒光強度和海腎熒光素酶熒光強度，兩者熒光強度比值即相對熒光素酶活性。

1.8 Western blot法檢測PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白p-Akt、p-mTOR、p-PI3K、GSK-3、PDK-1表達

在RIPA裂解液中按照100∶1的比例加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，裂解對照組和AC131056.3組HOS細胞，在SDS-PAGE凝膠中電泳，通過聚偏二氟乙烯膜轉膜。12%脫脂牛奶封閉后，加一抗工作液，稀釋度分別為p-Akt(1∶3 000)、p-mTOR(1∶2 000)、p-PI3K(1∶2 000)、GSK-3(1∶1 000)、PDK-1(1∶2 000)，4 ℃孵育14 h。回收一抗，滴加山羊抗鼠二抗，室溫孵育4 h。通過凝膠成像分析儀采集各個蛋白的條帶結果，以β-Tubulin為內參照。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 AC131056.3表達水平與骨肉瘤患者總生存期的關系

GEPIA數據庫分析顯示，骨肉瘤組織中AC131056.3高表達的骨肉瘤患者的總生存期高于低表達患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖1)。

圖1 AC131056.3表達水平與骨肉瘤患者總生存期的關系Figure 1 Relationship between the expression level of AC131056.3 and the overall survival of patients with osteosarcoma

2.2 AC131056.3在骨肉瘤細胞系中的表達水平

qRT-PCR檢測結果顯示，正常成骨細胞hFOB1.19和骨肉瘤細胞Saos2、U-2OS、MG-63、143B、HOS中AC131056.3相對表達分別為1.02±0.19，0.55±0.12，0.30±0.05，0.71±0.11，0.66±0.07和0.12±0.05。與正常成骨細胞比較，骨肉瘤細胞系中AC131056.3表達均下降(P<0.05)，其中HOS細胞中AC131056.3的表達最低(P<0.01，見圖2)。

與hFOB1.19細胞相比，* P <0.05，* * P <0.01

2.3 轉染pcDNA-AC131056.3質粒對HOS細胞AC131056.3表達的影響

qRT-PCR檢測顯示，轉染pcDNA-AC131056.3質粒后，AC131056.3組和對照組HOS細胞中AC131056.3相對表達分別為10.69±3.16和1.07 ±0.22，差異具有統(tǒng)計學意義(t=6.09，P<0.01)，表明過表達AC131056.3的HOS細胞構建成功。

2.4 過表達AC131056.3對HOS細胞增殖活力的影響

CCK-8法分別檢測AC131056.3組和對照組HOS細胞的增殖活力，結果顯示，與對照組比較，AC131056.3組HOS細胞在第2，3，4，5天的吸光度A值顯著降低(P<0.05,見圖3)，說明過表達AC131056.3可抑制HOS細胞的增殖活力。

與對照組比較，* P <0.05，* * P <0.01

2.5 過表達AC131056.3對HOS細胞侵襲活力的影響

Transwell實驗顯示，AC131056.3組和對照組HOS細胞侵襲數分別為(30.25 ±11.52)個和(68.54 ±14.81)個，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.98，P<0.01，見圖4)，說明過表達AC131056.3能抑制HOS細胞侵襲活力。

與對照組比較，* * P <0.01

2.6 生物信息學預測AC131056.3的靶基因

采用DIANA-LncBase v3網站預測顯示，AC131056.3可能與miR-21-5p互補結合，結合位點和突變位點見圖5。

圖5 生物信息學網站預測AC131056.3的靶基因Figure 5 Prediction of the target gene of AC131056.3 by bioinformatics website

2.7 雙熒光素酶報告基因法驗證AC131056.3靶向miR-21-5p

雙熒光素酶報告基因法顯示，與共轉染WT-AC131056.3+miR-NC mimic相比，共轉染WT-AC131056.3+miR-21-5p mimic的HOS細胞熒光素酶活性明顯降低(t=6.93，P<0.01)；與共轉染MUT-AC131056.3+miR-NC mimic相比，共轉染MUT-AC131056.3+miR-21-5p mimic的HOS細胞熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計學意義(t=0.90，P>0.05，見圖6)，說明AC131056.3可靶向結合miR-21-5p。

與miR-NC比較，* * P <0.01

2.8 過表達AC131056.3對miR-21-5p表達的影響

qRT-PCR檢測顯示，對照組和AC131056.3組HOS細胞中miR-21-5p表達分別為1.05±0.28和0.21±0.05，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.76，P<0.01)，說明過表達AC131056.3靶向下調miR-21-5p的表達。

2.9 過表達AC131056.3對PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達的影響

Western blot檢測顯示，與對照組相比，AC131056.3組PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、GSK-3、PDK-1表達顯著降低(見圖7)，說明過表達AC131056.3能夠抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路轉導。

圖7 過表達AC131056.3對HOS細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達的影響Figure 7 Effect of AC131056.3 overexpression on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway proteins in HOS cells

3 討論

骨肉瘤是骨科常見的骨腫瘤，其早期癥狀不顯著，確診時已處于中晚期，骨肉瘤患者5年生存率很低[9]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在表觀遺傳水平影響靶基因的轉錄、穩(wěn)定、乙酰化修飾等過程，在細胞的生理和病理活動方面起到關鍵調控作用[10-12]。lncRNA被證實與腫瘤包括骨肉瘤的發(fā)生、進展具有相關性[13]。既往研究報道，lncRNA BCRT1在骨肉瘤組織標本和細胞系中顯著上調，其表達升高誘導骨肉瘤細胞周期和增殖，促進細胞的上皮間充質轉化和炎癥介質的分泌[14]。與正常組織和細胞系相比，骨肉瘤組織和細胞系中的lncRNA TUSC7表達下調，lncRNA TUSC7過表達可以抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，在體外和體內促進骨肉瘤細胞的凋亡[15]。順鉑耐藥細胞系中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1表達水平顯著升高，敲除lncRNA FOXD2-AS1明顯抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并加速骨肉瘤細胞的凋亡[16]。以上研究均提示lncRNA參與調節(jié)骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展，探究特異性表達的lncRNA可能為骨肉瘤的臨床治療提供新的靶點。

本研究通過檢索GEPIA數據庫顯示，AC131056.3高表達的骨肉瘤患者總生存期明顯長于AC131056.3低表達的患者，AC131056.3高表達的骨肉瘤患者預后較好，說明AC131056.3可能參與介導骨肉瘤的發(fā)生進展。國內外關于AC131056.3對骨肉瘤惡性生物學行為的影響尚未見報道。本研究結果證實，在骨肉瘤細胞Saos2、U-2OS、MG-63、143B、HOS中AC131056.3低表達，說明其可能發(fā)揮抑癌基因的角色。通過質粒轉染過表達AC131056.3，細胞實驗證實其過表達顯著抑制HOS細胞的增殖和侵襲活力，確定了AC131056.3的抑癌基因屬性。lncRNA主要作為競爭性內源RNA，通過吸附特定miRNA，減少其表達，從而參與疾病的病理進程[17]。例如lncRNA SOX21-AS1通過吸附miR-7-5p，負調控miR-7-5p的表達，從而促進骨肉瘤細胞的增殖和轉移[18]。

本研究DIANA-LncBase v3網站預測顯示，AC131056.3可能靶向調控miR-21-5p。研究顯示，miR-21-5p在肺癌、卵巢癌、食管癌等腫瘤組織和細胞系中高表達，能夠促進腫瘤細胞的增殖、轉移，抑制細胞的自噬和凋亡，與腫瘤的淋巴結轉移、組織學分級、預后惡化相關[19-22]。miR-21-5p在骨肉瘤組織和細胞系中顯著高表達，在骨肉瘤細胞中扮演原癌基因的角色，顯著促進骨肉瘤細胞的增殖和侵襲速率[23,24]。經雙熒光素酶報告基因法證實，AC131056.3與miR-21-5p確實存在相互結合位點。同時，過表達AC131056.3后，HOS細胞中miR-21-5p表達顯著降低，證明miR-21-5p表達受AC131056.3調控。miR-21-5p促進骨肉瘤細胞和侵襲是通過正調控PI3K/Akt/mTOR信號通路表達實現[25]。本研究結果顯示，HOS細胞中過表達AC131056.3后，PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達明顯降低，間接證明AC131056.3通過調控miR-21-5p表達發(fā)揮作用。

綜上所述，骨肉瘤中AC131056.3高表達的患者總生存期高于低表達患者，骨肉瘤細胞系中AC131056.3顯著低表達，上調AC131056.3通過負向調控miR-21-5p表達，影響PI3K/Akt/mTOR信號通路轉導，顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖和侵襲。AC131056.3/miR-21-5p分子軸可能為骨肉瘤治療提供了新的靶點。