郭晨旭，劉靜波，許 睿，朱 超，張立功，錢 軍*

(1 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，蚌埠 233000；2 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤婦科；* 通訊作者,E-mail:qianjun215036@sina.com)

目前，乳腺癌已由女性第一大惡性腫瘤變?yōu)槿虻谝淮髳盒阅[瘤，乳腺癌的治療及預(yù)后與女性乃至全人類的健康息息相關(guān)。三陰性乳腺癌是乳腺癌中雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)以及人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)表達(dá)陰性的一類分子分型，盡管治療在過去的幾十年里有所改善，但相比其他分子分型乳腺癌，三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)缺少行之有效的治療靶，從而治療效果相對較差[1]。

研究證實(shí)，約90%以上的基因組產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，而長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNA)是其中不能被編碼為蛋白質(zhì)的一類，長度大于200個核苷酸[2]，有研究表明lncRNAs在細(xì)胞的增殖[3]、凋亡[4]、代謝、腫瘤耐藥[5]及相關(guān)的基因表達(dá)的生物學(xué)過程中扮演重要作用。位于人第14號染色體的被轉(zhuǎn)化生長因子β活化長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA activated by transforming growth factor β，lncRNA ATB)長度約80 kb，顧名思義可由轉(zhuǎn)化生長因子β激活后在調(diào)控腫瘤細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)上具有重要作用[6]，lncRNA ATB的異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著千絲萬縷的關(guān)聯(lián)[7-9]。而現(xiàn)階段關(guān)于lncRNA ATB與TNBC生物學(xué)特性關(guān)系的報道較少，本文旨在集中探討lncRNA ATB在TNBC細(xì)胞MDA-MB-231的發(fā)展過程中對增殖、凋亡、侵襲遷移的影響，進(jìn)而探討lncRNA ATB對MDA-MB-231細(xì)胞EMT的作用，闡述lncRNA ATB對TNBC生物學(xué)特性的作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A及人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購自中國科學(xué)院武漢細(xì)胞庫；BCA蛋白濃度試劑盒購自碧云天公司；Transwell小室購自美國Corning公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；馬血清購自德寧生物技術(shù)有限公司；DMEM/F12、1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自浙江天杭科技股份有限公司；Lipofectamine RNAiMAX試劑盒購自美國賽默飛氏爾科技公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司；E-cadherin(1∶1 000)、vimentin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)單克隆一抗及HRP(辣根過氧化物酶)抗鼠抗體(1∶3 000)購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌臨床組織標(biāo)本選取 隨機(jī)選取2020年1月至2020年12月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科行手術(shù)治療的TNBC患者組織標(biāo)本18例，術(shù)前患者未行新輔助治療，經(jīng)本院病理科病理學(xué)確診及免疫組化明確為TNBC，標(biāo)本中配對選取癌組織(Tumor)及距癌組織5 cm左右的癌旁組織(Normal)。研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會倫理批準(zhǔn)(倫科批字[2021]第165號)，患者均簽署知情同意。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 MCF-10A細(xì)胞培養(yǎng)于5%馬血清、10 μg/ml胰島素、20 ng/ml EGF、5 μg/ml氫化可的松的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，MDA-MB-231培養(yǎng)于10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2。

細(xì)胞在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，應(yīng)用Lipofectamine2000在細(xì)胞增長至50%～60%時對細(xì)胞進(jìn)行陰性小干擾RNA(siRNA，si-NC組)和lncRNA ATB小干擾RNA(si-ATB組)的轉(zhuǎn)染。在確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率后可在48 h后提取RNA和總蛋白進(jìn)行qRT-PCT及Western blot檢測。

1.2.3 CCK-8法檢測si-ATB對MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響 收集細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度后96孔板中每孔添加5×103細(xì)胞，分為si-NC組和si-ATB組，每組12孔，每時間段3孔以及額外1孔相同容積不含細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液為空白對照，普通培養(yǎng)(第2天常規(guī)換液)，分別在21，45，69，93 h時加入CCK-8試劑20 μl，酶標(biāo)儀分別檢測加入CCK-8試劑3 h后即24，48，72，96 h在450 nm處吸光度。增殖細(xì)胞活力計算公式為：(ODsi-ATB-OD空白)/(ODsi-NC-OD空白)×100%。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測lncRNA ATB的表達(dá) 先提取總RNA，TRIzol試劑提取后將1 μg的總RNA實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄PCR，反應(yīng)條件為95 ℃先進(jìn)行5 min的預(yù)變性，相同溫度10 s變性，55 ℃退火溫度進(jìn)行45個擴(kuò)增循環(huán)，選取GAPDH作為內(nèi)參。2-ΔΔCt表示lncRNA ATB的表達(dá)量。lncRNA ATB的引物序列如下，上游：5′-CACTTCATGAAGTTCACTC-3′，下游:5′-TAAGCCGTCATAGAGATCT-3′。GAPDH的引物序列如下，上游:5′-TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTC-3′,下游:5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測下調(diào)lncRNA ATB對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡能力的影響 兩組細(xì)胞分別接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度以取105個細(xì)胞，4 μl PI和2 μl Annexin Ⅴ-FITC加入200 μl Binding Buffer重懸的細(xì)胞，直接室溫孵育15 min，需避光處理。最后上機(jī)檢測細(xì)胞的凋亡率。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗檢測下調(diào)lncRNA ATB對MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板分別接種兩組細(xì)胞，在細(xì)胞融合至約90%劃痕時使用200 μl移液槍頭進(jìn)行劃痕，PBS沖洗3次后加入1%胎牛血清培養(yǎng)基，0 h和24 h時觀察細(xì)胞的遷移情況。細(xì)胞遷移率計算公式：遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.7 Transwell檢測下調(diào)lncRNA ATB對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響 先預(yù)處理8 μm Transwell小室，以培養(yǎng)基按8∶1的比例稀釋基質(zhì)膠，此培養(yǎng)基內(nèi)無血清，每室的上室中加入25 μl稀釋后的基質(zhì)膠后置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。siRNA轉(zhuǎn)染后48 h制作兩組細(xì)胞懸液，PBS清洗兩次，調(diào)整細(xì)胞濃度，上室加入5×104個細(xì)胞(200 μl)，下室加入600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h后PBS清洗3次后加結(jié)晶紫染色，棉簽擦拭未遷移的細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察侵襲細(xì)胞計數(shù)。

1.2.8 Western blot檢測下調(diào)lncRNA ATB對MDA-MB-231細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)量的影響 5 ml EP管收集兩組細(xì)胞，冰上操作以RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測試調(diào)整蛋白濃度，50 μg蛋白上樣電泳，將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后孵育一抗過夜，其中一抗稀釋比例為E-cadherin(1∶1 000)、vimentin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)。而后使用TBST洗膜3次，繼續(xù)HRP二抗(稀釋比例1∶3 000)孵育30 min后ECL系統(tǒng)可視化，灰度值利用凝膠成像系統(tǒng)分析。選擇GAPDH作為內(nèi)參，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 lncRNA ATB在TNBC組織及MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)情況

qRT-PCR結(jié)果顯示在TNBC組織中l(wèi)ncRNA ATB的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.05，見圖1)。同時在TNBC細(xì)胞MDA-MB-231中l(wèi)ncRNA ATB的表達(dá)也要明顯高于人乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞(P<0.05，見圖1)。

與Normal比較，* P <0.05；與MCF-10A比較，* P <0.05

2.2 CCK-8檢測lncRNA ATB對TNBC增殖的影響

siRNA沉默MDA-MB-231細(xì)胞的lncRNA ATB，qRT-PCR檢測沉默效率，相比si-NC組，si-ATB組lncRNA表達(dá)下調(diào)明顯(P<0.05，見圖2)。而CCK-8法檢測沉默后MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)相比si-NC組而言，si-ATB組的MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞存活率在48，72，96 h處明顯降低(P<0.05，見圖2)。

與si-NC相比較，* P <0.05

2.3 流式細(xì)胞儀檢測沉默lncRNA ATB后MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡水平

相比si-NC組，si-ATB組細(xì)胞凋亡率顯升高(12.24% ±1.52%vs24.33% ±2.15%，P<0.05，見圖3)。

與si-NC相比較，* P <0.05

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗、Transwell檢測lncRNA ATB對MDA-MB-231細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

在24 h時觀察細(xì)胞劃痕實(shí)驗，相比si-NC組，si-ATB組細(xì)胞遷移率明顯減弱(61.0% ±5.0%vs31.7% ±3.3%，P<0.05，見圖4)。與此同時，Transwell實(shí)驗結(jié)果顯示相比si-NC組，si-ATB組細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱(40.33 ±3.51vs15.67 ±2.52，P<0.05，見圖4)。

與si-NC相比，* P <0.05

與si-NC相比，* P <0.05

2.5 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

與si-NC組相比，si-ATB組細(xì)胞的EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)出現(xiàn)明顯變化，其中si-ATB組E-cadherin蛋白表達(dá)相比si-NC組明顯增強(qiáng)(0.63 ±0.05vs0.42 ±0.04，P<0.05，見圖6)。si-ATB組vimentin蛋白表達(dá)相比si-NC組明顯減弱(0.32 ±0.04vs0.55 ±0.05，P<0.05，見圖6)。si-ATB組N-cadherin蛋白表達(dá)相比si-NC組明顯減弱(0.38 ±0.04vs0.62 ±0.06，P<0.05，見圖6)。

與si-NC相比較，* P <0.05

3 討論

乳腺癌是危害女性健康最大的殺手之一，近年來已有很多學(xué)者證實(shí)了lncRNAs在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[10-12]，其在乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、耐藥等過程中均扮演重要的角色。lncRNAs具有高度的細(xì)胞類型特異性和多種生物學(xué)功能，有望能夠成為乳腺癌的新分子靶點(diǎn)?，F(xiàn)階段為驗證lncRNAs的功能，通?？梢允褂肦NA干擾、反義寡核苷酸、小分子抑制劑來靶向下調(diào)lncRNAs的表達(dá)，進(jìn)而檢測表觀遺傳學(xué)的改變。眾所周知，乳腺癌分為4種分子亞型，這種異質(zhì)性和復(fù)雜性恰恰是某些乳腺癌患者預(yù)后不佳的關(guān)鍵原因，一些lncRNAs在多種非TNBC細(xì)胞中異常表達(dá)，能夠通過ceRNA作用激活相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路來發(fā)揮生物學(xué)功能，目前已有研究顯示在管腔亞型轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，干擾lncRNA MALAT1的表達(dá)可以顯著防止腫瘤的轉(zhuǎn)移和增殖[13]。又例如HOTAIR[14]、lincROR[15]、BCAR4[16]，這些lncRNAs的過表達(dá)能夠促進(jìn)其他非TNBC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明這其中的機(jī)制可能在從轉(zhuǎn)錄到翻譯的不同水平上均有調(diào)節(jié)和功能，同時也可調(diào)控諸如TGF-β、NK-κB、STAT3等信號通路來影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。與此同時，與促進(jìn)轉(zhuǎn)移的lncRNAs相比，也有一部分是參與抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的，例如NKILA[17]、ANCR[18]等，這些lncRNAs的下調(diào)促進(jìn)了乳腺癌的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。越來越多的證據(jù)的表明lncRNAs可能成為乳腺癌轉(zhuǎn)移的一個有前途的生物標(biāo)記物。

綜合以上，使用lncRNAs作為乳腺癌治療的主要靶點(diǎn)，已經(jīng)引起了廣泛的研究關(guān)注。而目前在臨床治療上TNBC因其缺少相對應(yīng)的靶向治療的目標(biāo)而尤為難治，所以目前從分子靶向?qū)用鎸ふ襎NBC的治療策略顯得尤為重要。故以此為突破口，我們試圖尋求治療TNBC的可能的潛在靶點(diǎn)。

首先，我們在TNBC的癌組織中發(fā)現(xiàn)lncRNA ATB的表達(dá)量明顯高于癌旁組織，說明lncRNA ATB的表達(dá)可能參與了TNBC的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)而我們通過選擇相應(yīng)的TNBC的細(xì)胞系MDA-MB-231進(jìn)行細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，在調(diào)低lncRNA ATB后觀察各細(xì)胞表型的改變。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ATB的表達(dá)后，CCK-8實(shí)驗顯示si-ATB組的細(xì)胞增殖能力明顯低于si-NC組，這表明下調(diào)lncRNA ATB的表達(dá)后能夠抑制MDA-MB-231的增殖。進(jìn)一步，本研究通過流式細(xì)胞儀技術(shù)發(fā)現(xiàn)si-ATB組的細(xì)胞凋亡率明顯高于si-NC組，這說明細(xì)胞增殖的不足可能由于細(xì)胞的凋亡增多引起。

其次，我們在說明了lncRNA ATB抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖且促進(jìn)其凋亡的同時，也探討了lncRNA ATB是否能對MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力有所影響。劃痕實(shí)驗和Transwell結(jié)果顯示在lncRNA ATB被下調(diào)后MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯下降。那么我們繼續(xù)應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，眾所周知，發(fā)生了EMT的細(xì)胞尤其是惡性腫瘤細(xì)胞的特征性表型蛋白E-cadherin蛋白是下降的，而vimentin蛋白和N-cadherin蛋白是升高的，這會引起細(xì)胞黏附能力的減弱，進(jìn)而細(xì)胞有更強(qiáng)的活動性，發(fā)生更強(qiáng)的遷移和轉(zhuǎn)移[19]。而Western blot結(jié)果顯示相比si-NC組而言，si-ATB組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)發(fā)生了上升而vimentin蛋白、N-cadherin蛋白的表達(dá)發(fā)生了下降，這同EMT的發(fā)生過程是相反的。因此從蛋白機(jī)制層面，我們認(rèn)為調(diào)低lncRNA ATB影響TNBC生物學(xué)特性的其中一個機(jī)制可能是逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

最后，我們得出結(jié)論，lncRNA ATB可能成為評估乳腺癌預(yù)后的指標(biāo)，從機(jī)制層面說明lncRNA ATB的過表達(dá)可能會使得TNBC患者具有高度的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。而在細(xì)胞的層面上調(diào)低lncRNA ATB的表達(dá)能夠增加TNBC細(xì)胞的凋亡進(jìn)而減弱其增殖能力。與此同時調(diào)低lncRNA ATB可能會參與TNBC細(xì)胞EMT的逆轉(zhuǎn)過程，繼而來減弱TNBC細(xì)胞的遷移、侵襲的能力，從而可能減弱TNBC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。