孫源遠(yuǎn) 王欣 周輝 劉弘忍

（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司 上海 200240）

隨著動(dòng)物源性組織、細(xì)胞、體液制備的生物制品逐漸增多，應(yīng)用范圍越來越廣，生物組織提取制品中潛在的動(dòng)物源性病毒感染問題愈發(fā)受到關(guān)注[1-2]。2005年國(guó)家藥品評(píng)審中心發(fā)布《生物組織提取制品和真核細(xì)胞表達(dá)制品的病毒安全性評(píng)價(jià)技術(shù)評(píng)審一般原則》，規(guī)定對(duì)生物組織提取制品生產(chǎn)工藝進(jìn)行病毒去除/滅活驗(yàn)證及有效工藝步驟的評(píng)價(jià)[3-4]。目前由動(dòng)物組織提取的生化藥制品，大多采用有機(jī)試劑提取、酸堿提純、鹽析梯度沉淀等方法對(duì)生物組織中的有效成分進(jìn)行提取，但其生產(chǎn)工藝中缺乏病毒去除/滅活的步驟，這一方面不符合現(xiàn)行藥品法規(guī)的規(guī)定，另一方面也對(duì)后續(xù)的藥品質(zhì)量埋下隱患。因此，本研究針對(duì)動(dòng)物組織提取中較為常見的工藝步驟，增加病毒去除/滅活驗(yàn)證，完善工藝質(zhì)量體系。

1 材料和方法

1.1 樣品

三批次垂體前葉粉（批號(hào)為161029、161112和170101，泰興市金葉農(nóng)副產(chǎn)品有限公司）：三批次垂體前葉沉淀前濾清液（批號(hào)為520171102、520171103和520171104）、三批次硫酸魚精蛋白粗制中間體（批號(hào)490190401-1、490190402-1和490190403-1）、三批次硫酸魚精蛋白精制中間體（批號(hào)490190401-2、490190402-2和490190403-2）均來自上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司。

1.2 指示病毒

考慮指示病毒的基因組、有無包膜和理化抗性等因素，同時(shí)結(jié)合促皮質(zhì)素和硫酸魚精蛋白的病毒滅活驗(yàn)證工藝，選擇了六種具有代表性的指示病毒（表1）。

表1 指示病毒及其理化性質(zhì)

1.3 方法

促皮質(zhì)素病毒去除/滅活工藝驗(yàn)證都選擇加熱步驟和丙酮沉淀步驟；硫酸魚精蛋白病毒去除/滅活工藝驗(yàn)證選擇酸醇處理步驟和加熱步驟。

病毒滴度測(cè)定參照消毒技術(shù)規(guī)范（2002版）“2.1.1.10病毒滅活試驗(yàn)”[5]以及《動(dòng)物病毒學(xué)》（第二版）“（四）病毒感染力的滴定”[6]的標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用微量滴定法測(cè)定。

1.3.1 促皮質(zhì)素病毒去除/滅活工藝驗(yàn)證

促皮質(zhì)素是垂體前葉粉經(jīng)過鹽酸丙酮法提取再經(jīng)丙酮沉淀得到，因此選擇了工藝中鹽酸加熱步驟和丙酮沉淀步驟作為病毒去除/滅活步驟。

1）加熱步驟 取垂體前葉粉加入7倍量（W/V）丙酮，3倍量（W/V）1 mol/L HCl溶液，攪拌溶解15 min后，將其置于（51±1）℃恒溫水浴鍋中，待樣品溫度升至50 ℃時(shí)，按25∶1（樣品-病毒，V∶V）比例分別加入指示病毒EMCV、PPV或ReoV-3，混勻后開始計(jì)時(shí)，繼續(xù)于（51±1）℃恒溫水浴鍋中保溫滅活，分別在0、5、15、30和60 min時(shí)從中取樣測(cè)定各取樣時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度。最終病毒滅活效果以樣品與起始滴度對(duì)照的病毒滴度差值計(jì)算。

2）丙酮沉淀步驟 按9∶1（垂體前葉中間體濾清液-病毒，V∶V）比例分別加入指示病毒BVDV，PRV或VSV，混勻。取其中一份，加入7倍量純水，剩余五份分別按1∶7（樣品-冷丙酮，V∶V）比例加入冷丙酮，攪拌混勻后繼續(xù)于（51±1）℃恒溫液浴循環(huán)兩用槽中靜置沉淀，開始計(jì)時(shí)，分別在計(jì)時(shí)至0、5、15、30和60 min時(shí)取出一份，3 000 r/min離心（Eppendorf Centrifuge 5810R）1 min后，用移液器分離上清和沉淀，沉淀用純水復(fù)溶至原體積，分別從上清和沉淀復(fù)溶液中取樣測(cè)定病毒滴度。最終病毒滅活效果以樣品與起始滴度對(duì)照的病毒滴度差值計(jì)算。

3）盲傳三代 將各指示病毒三批次加熱保溫30 min取樣的樣品50倍稀釋度的測(cè)定細(xì)胞孔（測(cè)定為陰性的細(xì)胞孔）分別進(jìn)行盲傳三代。

1.3.2 硫酸魚精蛋白病毒去除/滅活工藝驗(yàn)證

硫酸魚精蛋白是由魚白粗品經(jīng)過酸醇提取，高溫、酸堿去除核酸最終得到，因此選取了酸醇處理和加熱步驟作為病毒去除/滅活步驟。

1）酸醇處理步驟 取粗制中間體，按每公斤粗品加入1.2 L酸醇溶液（量取98%硫酸147 mL加入純化水至2 L待用，再量取95%乙醇240 mL，加入上述硫酸溶液，再加純化水至總體積2.4 L，配制成含6%硫酸的酸醇溶液）計(jì)算加入酸醇溶液，將其置于（16±1）℃恒溫液浴循環(huán)兩用槽中，按15∶1（粗制中間體-病毒，W∶V）比例加入指示病毒PRV和VSV，攪拌混勻后開始計(jì)時(shí)，分別在計(jì)時(shí)至0、0.5、1和2 h時(shí)從中取樣測(cè)定各取樣時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度。最終病毒滅活效果以樣品與起始滴度對(duì)照的病毒滴度差值計(jì)算。

2）加熱步驟 取精制中間體，加入2.5倍重量（W∶V）的純水，將其置于（86±1）℃恒溫水浴鍋中加熱至85 ℃后，用玻棒攪拌10 min使中間體全部溶解，再按14∶1（樣品-病毒，W∶V）比例加入指示病毒PPV和ReoV-3，混勻后開始計(jì)時(shí)，分別在計(jì)時(shí)至0、10、20和30 min時(shí)從中取樣用培養(yǎng)基稀釋200倍后測(cè)定各取樣時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度。

3）盲傳三代 將各指示病毒三批次加熱保溫30 min時(shí)取樣的樣品加入50倍稀釋度的測(cè)定細(xì)胞孔（測(cè)定為陰性的細(xì)胞孔）分別進(jìn)行盲傳三代。

2 結(jié)果

2.1 促皮質(zhì)素病毒去除/滅活工藝驗(yàn)證

2.1.1 加熱法病毒滅活

三批次樣品中EMCV、PPV和ReoV-3滴度均降至檢測(cè)限1.7 logs（經(jīng)細(xì)胞毒試驗(yàn)，將培養(yǎng)基稀釋50倍，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，所以檢測(cè)限為1.7 logs）以下，滴度平均下降值≥4 logs（表2），表明該升溫過程對(duì)這些病毒具有滅活作用。

表2 加熱時(shí)間對(duì)促皮質(zhì)素中病毒滅活的影響

2.1.2 丙酮沉淀步驟病毒滅活

三批次上清和沉淀中BVDV、PRV和VSV滴度均降至檢測(cè)限1.7 logs以下（表3）。

表3 丙酮處理時(shí)間對(duì)促皮質(zhì)素中病毒滅活的影響

將三批次丙酮沉淀30 min時(shí)從上清和沉淀復(fù)溶液中分別取樣的樣品加入50倍稀釋度的細(xì)胞孔（測(cè)定為陰性的細(xì)胞孔）分別進(jìn)行盲傳三代，指示細(xì)胞（MDBK細(xì)胞、ST細(xì)胞和Vero細(xì)胞）均正常生長(zhǎng)，即盲傳三代無病變，表明BVDV、PRV和VSV均被完全滅活。這些結(jié)果表明，該工藝對(duì)脂包膜指示病毒（BVDV、PRV和VSV）均具有快速滅活作用。

2.2 硫酸魚精蛋白病毒去除/滅活工藝驗(yàn)證

2.2.1 酸醇處理步驟病毒滅活

三批次粗制中間體中加入酸醇溶液后再加入指示病毒，攪拌混勻后立即取樣，三批次樣品中PRV滴度均降至檢測(cè)限1.50 logs（經(jīng)細(xì)胞毒試驗(yàn)，將培養(yǎng)基稀釋100倍，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，所以檢測(cè)限為1.50 logs）以下，滴度平均下降值≥4.52 logs；取樣后剩余染毒樣品于（16±1）℃水浴攪拌保溫，經(jīng)攪拌保溫滅活0.5 h，三批次樣品中VSV滴度均降至檢測(cè)限1.50 logs以下，滴度平均下降值≥ 4.30 logs（表4）。

表4 酸醇處理時(shí)間對(duì)硫酸魚精蛋白中病毒滴度的影響

將三批次酸醇處理1 h時(shí)取樣的樣品加入100倍稀釋度的細(xì)胞孔（測(cè)定為陰性的細(xì)胞孔）分別進(jìn)行盲傳三代，指示細(xì)胞（ST細(xì)胞/Vero細(xì)胞）均正常生長(zhǎng)，即盲傳三代無病變，表明指示病毒PRV和VSV均被完全滅活。這些結(jié)果表明，酸醇處理對(duì)脂包膜指示病毒PRV和VSV均具有快速滅活作用。

2.2.2 加熱步驟病毒滅活

三批次精制中間體中加入純水后升溫至85 ℃，攪拌溶解后再加入指示病毒，混勻后立即取樣，三批次樣品中PPV和ReoV-3滴度均降至檢測(cè)限1.80 logs（經(jīng)細(xì)胞毒試驗(yàn)，將培養(yǎng)基稀釋200倍，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，所以檢測(cè)限為1.80 logs）以下，其中PPV滴度平均下降值≥4.08 logs，ReoV-3滴度平均下降值≥4.23 logs（表5）。

表5 加熱時(shí)間對(duì)硫酸魚精蛋白中病毒滴度的影響

將三批次加熱20 min時(shí)取樣的樣品加入200倍稀釋度的細(xì)胞孔（測(cè)定為陰性的細(xì)胞孔）分別進(jìn)行盲傳三代，指示細(xì)胞（ST細(xì)胞/LLC-MK2細(xì)胞）均正常生長(zhǎng)，即盲傳三代無病變，表明指示病毒PPV和ReoV-3均被完全滅活。這些結(jié)果表明，加熱步驟對(duì)非脂包膜指示病毒PPV和ReoV-3也具有快速滅活作用。

3 討論

本文三種動(dòng)物源性生物組織提取制品經(jīng)病毒去除/滅活工藝，病毒滴度下降值可達(dá)到4 logs，為有效的病毒去除/滅活工藝，達(dá)到了《生物組織提取制品和真核細(xì)胞表達(dá)制品的病毒安全性評(píng)價(jià)技術(shù)評(píng)審一般原則》的安全標(biāo)準(zhǔn)。說明丙酮處理和加熱法是在生產(chǎn)工藝中有效的病毒去除/滅活的方法。

病毒去除/滅活方法驗(yàn)證還須基于原始工藝步驟，其重要的原則是盡可能不改變?cè)脊に?，因此本研究的幾種方法并不是適用于全部的動(dòng)物組織提取制品，除了本研究驗(yàn)證的去病毒方法，通常動(dòng)物組織提取中還有S/D法[7-8]、巴氏消毒法[9]、色譜柱及納米膜過濾法[10]等有效去除/滅活病毒的方法，可以針對(duì)不同工藝體系進(jìn)行去病毒驗(yàn)證，以保證藥品生產(chǎn)的質(zhì)量。

鑒于動(dòng)物組織提取制品的特殊性（其來源多為動(dòng)物內(nèi)臟或組織），所以除了針對(duì)其工藝進(jìn)行去病毒工藝步驟的選擇和驗(yàn)證，同時(shí)也要積極地改進(jìn)工藝步驟，采用層析，超濾等本身具有病毒去除/滅活特性的步驟來達(dá)到藥品質(zhì)量的安全性；另一方面，藥品生產(chǎn)企業(yè)也同時(shí)要把好粗品來源的關(guān)口，積極主動(dòng)地進(jìn)行原料商的審查，從粗品來源保證藥品的質(zhì)量。

致謝：感謝王小良，吳娟對(duì)本研究中病毒測(cè)定的貢獻(xiàn)。