李 青， 葛傳龍， 歐陽(yáng)力劍， 金志梅， 楊 欽

(1.貴州省典型高原濕地生態(tài)保護(hù)與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州畢節(jié) 551700； 2.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)工程學(xué)院，貴州畢節(jié) 551700)

云貴高原位于我國(guó)西南部，是我國(guó)四大高原之一，海拔在400～3 500 m間。貴州草海國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于云貴高原中部頂端，是一個(gè)典型的高原濕地生態(tài)系統(tǒng)。鯽魚(yú)不僅是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，而且由于其多生活于水域的中下層，具有極強(qiáng)的低氧耐受性，是公認(rèn)的低氧耐受力極強(qiáng)的魚(yú)類之一。作為草海的優(yōu)勢(shì)魚(yú)種，鯽魚(yú)在長(zhǎng)期高原低氧環(huán)境中，進(jìn)化出特有的身體機(jī)能以維持機(jī)體O平衡，彌補(bǔ)機(jī)體的缺氧反應(yīng)。

低氧誘導(dǎo)因子HIF是由和亞基組成的一種異質(zhì)二聚體的轉(zhuǎn)錄因子，參與了動(dòng)物缺氧應(yīng)激的適應(yīng)和生存過(guò)程，在維持機(jī)體氧穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。和亞基均包含基本的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)基序和PAS結(jié)構(gòu)域。在常氧條件下，脯氨酰羥化酶PHD通過(guò)氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域ODD中2個(gè)保守的脯氨酸殘基的羥基化作用，使靶蛋白HIF亞基羥基化，隨之羥基化的HIF亞基被VHL蛋白識(shí)別并泛素化，介導(dǎo)蛋白降解。HIF激活細(xì)胞中一系列缺氧誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄，以應(yīng)對(duì)缺氧環(huán)境。在脊椎動(dòng)物中HIF至少有3個(gè)亞型，分別為HIF1、HIF2和HIF3。魚(yú)類中的研究已經(jīng)證明，HIF1主要在無(wú)氧呼吸中間體的氧氣攝取和運(yùn)輸中起關(guān)鍵作用，而HIF2在血管和紅細(xì)胞的生成發(fā)揮重要作用。目前，關(guān)于HIF亞型的研究已在多種魚(yú)類中開(kāi)展，而在耐低氧的鯽魚(yú)中的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道?；诖耍狙芯炕谇捌趯?duì)草海鯽魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，利用生物信息學(xué)技術(shù)和PCR，克隆獲得了鯽魚(yú)中HIF 2個(gè)亞型和的全長(zhǎng) cDNA序列，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和功能分析。此外，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了鯽魚(yú)中和mRNA在不同組織中的表達(dá)情況，以期為進(jìn)一步深入探究鯽魚(yú)耐低氧分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2018年在貴州威寧縣草海采集鯽魚(yú)[體長(zhǎng)(14.98±4.25) cm；體質(zhì)量(68.71±5.25) g]，取其腸、肝臟、鰓、心臟、腎臟、肌肉、脾臟、精巢、卵巢和全血組織樣品，放入RNA Later(Tiangen)中，采樣點(diǎn)：26°51′24.15″N，104°12′31.57″E，海拔：2 168.09 m。另采集3尾鯽魚(yú)帶回實(shí)驗(yàn)室，取其肝臟組織，液氮冷凍后置于-80 ℃低溫冰箱保存，用于后續(xù)RNA提取。

1.2 鯽魚(yú)Ca-HIF1α和Ca-HIF2α全長(zhǎng)的克隆與生物信息學(xué)分析

提取鯽魚(yú)肝臟組織總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA(TaKaRa PrimeScript Ⅱ 1st Stramd cDMA Synthesis Kit)。從鯽魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選和基因片段，使用DNAstar SeqMan軟件對(duì)篩選的目的片段進(jìn)行拼接。根據(jù)拼接獲得的和基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，由表1可知，對(duì)拼接獲得序列的正確性進(jìn)行驗(yàn)證，克隆獲得和基因的全長(zhǎng)cDNA序列。利用DNAMAN軟件分析和基因全長(zhǎng)cDNA序列中開(kāi)放閱讀框及其編碼的氨基酸序列，SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)分析和基因編碼氨基酸序列的功能域，ExPASy(http：//web.expasy.org/protparam)分析和基因編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)(pI)。

表1 Ca-HIF1α和Ca-HIF2α基因序列擴(kuò)增和qRT-PCR引物序列

1.3 HIF1α和HIF2α序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

利用Clustal X軟件比對(duì)鯽魚(yú)與其他物種的和基因亞型翻譯的氨基酸序列的同源性，并用MEGA 4.0軟件進(jìn)行同源與聚類分析，采用鄰接法NJ構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，500次自舉(Bootstrap)重復(fù)檢驗(yàn)進(jìn)化樹(shù)的置信度。表2為各物種序列登錄號(hào)，來(lái)自GenBank。

表2 序列比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)物種信息

1.4 鯽魚(yú)Ca-HIF1α和Ca-HIF2α mRNA表達(dá)模式分析

分別提取腸、肝臟、鰓、心臟、腎臟、肌肉、脾臟、精巢、卵巢和全血組織的RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA(TaKaRa SYBR Premix Ex)，根據(jù)和基因全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，鯽魚(yú)-基因作為內(nèi)參，由表1可知引物序列，每個(gè)樣本設(shè)計(jì)3個(gè)平行重復(fù)，使用BioRad CFX96TM Real-Time PCR檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)和mRNA在不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Bio-Rad CFX Manager軟件分析熔解曲線，通過(guò)2-ΔΔ分析和mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件中的One-way ANOVA對(duì)和mRNA在鯽魚(yú)不同組織相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯽魚(yú)HIF-1α和HIF-2α cDNA序列分析

克隆獲得鯽魚(yú)中和cDNA全長(zhǎng)序列(GenBank NO.：MW916102，MW916103)，將其分別命名為和。由圖1可知，全長(zhǎng)共有3 867 bp，其中，5′UTR為295 bp，3′UTR為1 247 bp，開(kāi)放閱讀框2 322 bp，編碼774個(gè)氨基酸。由圖2可知，cDNA全長(zhǎng)共4 647 bp，其中5′UTR為175 bp，3′UTR為 2 023 bp，開(kāi)放閱讀框2 460 bp，編碼820個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)和基因編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分別為85.844、91.228 ku，等電點(diǎn)為5.12和6.20。SMART在線分析見(jiàn)圖3。由圖3可知，二者具有HLH、PAS和PAC結(jié)構(gòu)域，此外，多序列比對(duì)結(jié)果顯示二者還具有ODD、N-TAD 和C-TAD功能域。

2.2 HIF1α和HIF2α亞型的同源性分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

多序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，鯽魚(yú) Ca-HIF1α 第27個(gè)氨基酸是絲氨酸(S)，而Ca-HIF2α相對(duì)應(yīng)的第25個(gè)氨基酸是半胱氨酸(C)。Ca-HIF1α和Ca-HIF2α氨基酸序列不僅具有ODD、N-TAD和C-TAD 3個(gè)結(jié)構(gòu)域，且ODD結(jié)構(gòu)域具有2個(gè)保守的脯氨酸(P)位點(diǎn)，其中，1個(gè)是LxxLAP位點(diǎn)，該位點(diǎn)的序列并沒(méi)有發(fā)生突變。此外，C-TAD結(jié)構(gòu)域均具有保守的天冬酰胺(N)位點(diǎn)，表明Ca-HIF1α 和Ca-HIF2α結(jié)構(gòu)域的保守性。進(jìn)化樹(shù)顯示，Ca-HIF1α和Ca-HIF2α分別與其他物種中相應(yīng)的亞型聚為一支。但Ca-HIF1α是先與花斑裸鯉、納木錯(cuò)裸鯉、扁咽齒魚(yú)、黃河裸裂尻魚(yú)、齊口裂腹魚(yú)、鯉魚(yú)的HIF1α聚為一支后，再與南亞野鯪的HIF1α聚為一支，最后與白鰱、草鯉魚(yú)和團(tuán)頭魴的HIF1α聚在一起。與之不同，白鰱、草鯉魚(yú)和團(tuán)頭魴HIF2α先聚為一支，南亞野鯪、齊口裂腹魚(yú)、花斑裸鯉、納木錯(cuò)裸鯉、黃河裸裂尻魚(yú)和扁咽齒魚(yú)聚為一支，然后2支匯聚，最后再與Ca-HIF2α聚在一起，提示Ca-HIF2α比Ca-HIF1α進(jìn)化得要快。

2.3 Ca-HIF1α和Ca-HIF2α mRNA在鯽魚(yú)不同組織中的表達(dá)

由圖5可知，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)結(jié)果顯示，和mRNA在所有被檢測(cè)的組織中均有表達(dá)，其中，mRNA在所有組織中的相對(duì)表達(dá)量均高于mRNA的表達(dá)量。此外，mRNA在肝臟、鰓和精巢組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，全血、心臟、腎臟、肌肉、脾臟和卵巢組織中的相對(duì)表達(dá)量次之，在腸組織中的相對(duì)表達(dá)量最低。與之相似，mRNA在肝臟、鰓和全血組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，卵巢、精巢、脾臟、心臟、腎臟和肌肉組織中的相對(duì)表達(dá)量次之，在腸組織中的相對(duì)表達(dá)量最低。

3 討論

3.1 鯽魚(yú)中Ca-HIF1α和Ca-HIF2α基因序列與系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究克隆獲得鯽魚(yú)中基因2個(gè)亞型的全長(zhǎng)cDNA序列，對(duì)序列比對(duì)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)顯示二者分別與其他物種中的HIF1α和HIF2α聚為一支。因此，將其分別命名為和。與其他物種中的同源蛋白一樣，Ca-HIF1α和Ca-HIF2α均具有HLH、PAS-A、PAS-B、PAC、N-TAD和C-TAD 6個(gè)結(jié)構(gòu)功能域，表明組成HIF1α和HIF2α的主要結(jié)構(gòu)域是高度保守的。與巨鯛()和HIF1α相關(guān)研究結(jié)果一致，Ca-HIF1α第27個(gè)氨基酸是絲氨酸(S)，Ca-HIF2α對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的第25個(gè)氨基酸是半胱氨酸(C)，HIFα中HLH結(jié)構(gòu)域中還原性半胱氨酸的存在主要與介導(dǎo)動(dòng)物的氧敏感性有關(guān)，此不同之處導(dǎo)致Ca-HIF2α在DNA結(jié)合過(guò)程中可能比Ca-HIF1α對(duì)氧化還原更敏感。Ca-HIF1α與Ca-HIF2α結(jié)構(gòu)上的這些區(qū)別可能導(dǎo)致二者具有各自獨(dú)特的功能，且Ca-HIF2α在系統(tǒng)進(jìn)化中比Ca-HIF1α要快。然而，Ca-HIF1α和Ca-HIF2α在ODD結(jié)構(gòu)域均具有2個(gè)保守的脯氨酸(P)，且與人類中的HIFα同源蛋白相似，保有了LxxLAP位點(diǎn)，LxxLAP位點(diǎn)的突變是動(dòng)物適應(yīng)高原低氧環(huán)境的重要標(biāo)志，這可能與鯽魚(yú)是耐低氧動(dòng)物有關(guān)。此外，Ca-HIF1α和Ca-HIF2α在C-TAD結(jié)構(gòu)域均具有天冬酰胺，2個(gè)保守的脯氨酸主要參與了蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，天冬酰胺主要參與誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，這些殘基的保守性，表明其在促進(jìn)魚(yú)類和哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)錄活性方面具有功能保守性。

3.2 鯽魚(yú)不同組織中Ca-HIF1α和Ca-HIF2α mRNA水平表達(dá)差異分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在常氧條件下，和mRNA在所檢測(cè)組織(腸、肝臟、鰓、心臟、腎臟、肌肉、脾臟、精巢、卵巢和全血)中均有表達(dá)，與巨鯛()、斑馬魚(yú)、齊口裂腹魚(yú)()和軟刺裸鯉()中研究結(jié)果相一致，和mRNA在鰓組織中的表達(dá)量均最高。此外，與巨鯛()相似，mRNA在鯽魚(yú)肝臟和精巢組織中的表達(dá)量均很高。而mRNA在卵巢組織中表達(dá)量較高，mRNA在卵巢組織中的表達(dá)量較低。與同時(shí)耐低氧的草魚(yú)中結(jié)果不同，和mRNA在鯽魚(yú)的腎臟組織中表達(dá)量均不高。和mRNA在鯽魚(yú)腸組織中的低表達(dá)，可能是由于腸道組織水平的日常變化，二者參與了腸道穩(wěn)態(tài)的維持。以上結(jié)果說(shuō)明-在維持機(jī)體氧穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮至關(guān)重要作用，但和這2個(gè)亞型mRNA水平的表達(dá)差異性表明二者在調(diào)控氧穩(wěn)態(tài)方面具有分工。此外，二者在精巢、卵巢和全血組織中的表達(dá)，推測(cè)其可能參與介導(dǎo)了血細(xì)胞和生殖細(xì)胞的發(fā)育。