劉志成， 張鈞博， 方 正， 吳慶珊， 翁慶北，2

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550001； 2.黔南民族師范學(xué)院，貴州都勻 558000)

在真核生物基因轉(zhuǎn)錄后加工過程中，核內(nèi)小RNA(small nuclear RNA，snRNA)通過與剪接體蛋白組裝成主要剪接體(major spliceosome)和次要剪接體(minor spliceosome)，在該過程中發(fā)揮著重要的作用。snRNA作為真核生物主要剪接體的重要組分，其結(jié)構(gòu)高度動(dòng)態(tài)，形成主要剪接體的大部分催化核心，通過與其他snRNA、前mRNA底物(pre-mRNA)和超過25個(gè)蛋白質(zhì)伴侶有序的相互作用，保證mRNA剪接過程的順利進(jìn)行。

研究基因和microRNA(miRNA)在特定條件下的表達(dá)是挖掘它們生物學(xué)功能的重要手段之一。反轉(zhuǎn)錄定量PCR(reverse transcription-quantitative PCR，RT-qPCR)作為一種常用的基因表達(dá)檢測(cè)方法也廣泛應(yīng)用于鑒定各物種miRNA的表達(dá)。在RT-qPCR試驗(yàn)中，為了校正試驗(yàn)過程中由于RNA質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄效率和PCR酶擴(kuò)增效率等因素造成的試驗(yàn)誤差，通常使用肌動(dòng)蛋白基因()、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因()和18S rRNA基因等表達(dá)穩(wěn)定的管家基因作為內(nèi)參基因。但由于這些基因遠(yuǎn)大于miRNA，不適合作為miRNA RT-qPCR檢測(cè)的內(nèi)參基因。已有報(bào)道表明，snRNA在不同物種中十分保守，序列較小，且在生物體內(nèi)各種細(xì)胞中的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，因而被廣泛用于各物種miRNA RT-qPCR的內(nèi)參基因。

甜菜夜蛾()屬于鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)昆蟲，作為一種雜食性害蟲，可危害茄果類、瓜類、綠葉菜類等超過80多種農(nóng)作物，具有食量大、破壞性強(qiáng)、繁殖速度快等特點(diǎn)，對(duì)每年世界各地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失。對(duì)甜菜夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制和病原免疫機(jī)制的了解對(duì)開發(fā)有效的甜菜夜蛾防治措施具有重要意義。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)miRNA通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)影響昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育和病毒-宿主相互作用。因此，研究miRNA在甜菜夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育和抗桿狀病毒機(jī)制中的作用對(duì)該害蟲的防治具有重要意義。目前已報(bào)道多種昆蟲miRNA的表達(dá)研究中使用snRNA作為內(nèi)參基因。但迄今，甜菜夜蛾的snRNA序列及其作為內(nèi)參基因的研究尚未見報(bào)道。

本研究從Se301細(xì)胞基因組的測(cè)序注釋數(shù)據(jù)中篩選甜菜夜蛾snRNA，克隆其全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。進(jìn)一步地分析除蟲菊提取物、高溫培養(yǎng)和甜菜夜蛾核型多角體病毒(multiple nucleopolyhedrovirus，SeMNPV)感染脅迫下snRNA的表達(dá)穩(wěn)定性。本研究旨在為甜菜夜蛾miRNA表達(dá)檢測(cè)時(shí)內(nèi)參基因的選擇提供了依據(jù)，為甜菜夜蛾miRNA功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 甜菜夜蛾、Se301細(xì)胞與SeMNPV 甜菜夜蛾幼蟲購(gòu)自河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司。甜菜夜蛾細(xì)胞系Se301細(xì)胞由荷蘭瓦赫寧根大學(xué)的Just M. Vlak教授惠贈(zèng)，SeMNPV-US1(SeMNPV美國(guó)加利福尼亞分離株)由美國(guó)加州大學(xué)Riverside分校的Brian. A. Federici 教授惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑 Grace完全培養(yǎng)基(Gibco)購(gòu)自于賽默飛世爾科技有限公司。小RNA提取試劑盒(miRNA Kit)購(gòu)于OMEGA公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)和miRNA熒光定量PCR試劑盒[miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green)]購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。高保真DNA聚合酶(PrimeSTAR Max DNA 聚合酶)和A-T克隆試劑盒(DNA A-Tailing Kit和pMD 18-T Vector Cloning Kit)購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。大腸桿菌DH5α感受態(tài)購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司。99.8%除蟲菊提取物原藥購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在25 cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種1.5×10個(gè)Se301細(xì)胞，加入Grace完全培養(yǎng)基 5 mL，置27 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約5 d，待細(xì)胞密集程度約90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 小RNA提取與cDNA合成 2020年12月分別取筆者所在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的Se301細(xì)胞1×10個(gè)或甜菜夜蛾幼蟲血淋巴150 μL，按照miRNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞或血淋巴的小RNA，微孔紫外分光光度計(jì)檢測(cè)小RNA濃度和純度后，置于 -80 ℃ 保存。以提取的小RNA為模板，利用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行miRNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.2.3 甜菜夜蛾snRNA克隆 根據(jù)甜菜夜蛾Se301細(xì)胞基因組測(cè)序數(shù)據(jù)(筆者所在實(shí)驗(yàn)室未公開發(fā)表)注釋設(shè)計(jì)甜菜夜蛾snRNA全長(zhǎng)序列擴(kuò)增引物對(duì)，-F(G T A C T T G C T T C G G C A G T A C A T A T)和-R(A A A A A T G T G G A A C G C T T C A C G A)。以Se301細(xì)胞小RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，RT-PCR 擴(kuò)增甜菜夜蛾snRNA全長(zhǎng)序列，反應(yīng)體系如下：cDNA 1 μL，-F和-R(10 μmol/L)各0.5 μL，2 × PrimeSTAR Max Premix 10 μL，ddHO補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的DNA片段，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。經(jīng)菌落PCR鑒定后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 甜菜夜蛾snRNA的多序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析 使用MEGA7軟件的Clustal W算法對(duì)甜菜夜蛾等不同物種的snRNA進(jìn)行多序列比對(duì)，GeneDoc進(jìn)行展示。使用MEGA7軟件的最大似然法(Maximum Likelihood Tree)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)抽樣檢測(cè)1 000次。

1.2.5 除蟲菊提取物處理對(duì)甜菜夜蛾Se301細(xì)胞中snRNA表達(dá)的影響 鋪1×10個(gè)Se301細(xì)胞于直徑35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，貼壁過夜。加入含除蟲菊提取物終濃度為半數(shù)致死濃度(lethal concentration 50，LC)的培養(yǎng)基溶液，孵育24 h，提取細(xì)胞小RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以不含除蟲菊提取物的培養(yǎng)基溶液培養(yǎng)細(xì)胞為空白對(duì)照，按miRNA熒光定量試劑盒說明書，熒光定量PCR方法分析snRNA表達(dá)情況。

1.2.6 高溫處理對(duì)甜菜夜蛾Se301細(xì)胞中snRNA表達(dá)的影響 鋪1×10個(gè)Se301細(xì)胞于直徑35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，貼壁過夜。分別置于 36 ℃ 和27 ℃條件下培養(yǎng)1 h后，收取細(xì)胞樣品，提取小RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR方法分析snRNA的表達(dá)情況。

1.2.7 SeMNPV感染對(duì)甜菜夜蛾snRNA表達(dá)的影響 選取發(fā)育狀態(tài)良好的4齡甜菜夜蛾幼蟲20頭，用帶有SeMNPV多角體(2×10個(gè)/幼蟲)的人工飼料喂食，以加無菌水的人工飼料喂食幼蟲為對(duì)照。72 h后收取幼蟲血淋巴，提取小RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR方法定量分析snRNA的表達(dá)情況。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)與分析 使用SPSS 21.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)分析。數(shù)據(jù)作圖采用GraphPad Prism 7軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜夜蛾U6 snRNA的克隆

從筆者所在課題組的甜菜夜蛾Se301細(xì)胞的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的注釋結(jié)果中篩選到了甜菜夜蛾snRNA，其序列為(5′→3′)：G U A C U U G C U U C G G C A G U A C A U A U A C U A A A A U U G G A A C G A U A C A G A G A A G A U U A G C A U G G C C C C U G C G C A A G G A U G A C A C G C A A A A U C G U G A A G C G U U C C A C A U U U U U，共107 nt。提取Se301細(xì)胞小RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增甜菜夜蛾snRNA。結(jié)果顯示，以Se301細(xì)胞cDNA和DNA為模板，PCR均擴(kuò)增出約107 nt的目的條帶，與預(yù)期大小相符(圖1)。

回收目的片段，連接pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)。使用-F/-R引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果見圖2-A。挑取陽(yáng)性克隆，重組質(zhì)粒pMD18-T-的測(cè)序結(jié)果表明克隆的snRNA與Se301細(xì)胞基因組測(cè)序注釋結(jié)果中snRNA的序列一致(圖2-B)。

2.2 甜菜夜蛾U6 snRNA的保守性與系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過MEGA7軟件對(duì)甜菜夜蛾的snRNA進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。將克隆分析得到的甜菜夜蛾snRNA與從GenBank中搜索獲得的人(NR_004394.1)、黑腹果蠅(，X06669.1)、家蠶(，AY649381.1)、小菜蛾(，KF307745.1)、褐色桔蚜(，KX638479.1)、擬南芥(，NR_141593.1)、慶網(wǎng)蛺蝶(，JX878560.1)、小鼠(，X06980.1)、四膜蟲(，X53790.1)和非洲爪蟾(，NR_033272.1)的snRNA序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果見圖3。多序列比對(duì)結(jié)果表明snRNA在不同物種中是高度保守的。

對(duì)不同物種snRNA的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，甜菜夜蛾的snRNA與家蠶、小菜蛾和慶網(wǎng)蛺蝶這3個(gè)鱗翅目昆蟲的snRNA進(jìn)化關(guān)系最近，說明甜菜夜蛾snRNA與其他鱗翅目昆蟲snRNA同源性最高。此外，鱗翅目昆蟲的snRNA的同源性與同為昆蟲綱物種的褐色橘蚜和黑腹果蠅也比較高。在系統(tǒng)進(jìn)化分析中可以看出由于甜菜夜蛾snRNA與四膜蟲snRNA的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)，其snRNA同源性最低，結(jié)果見圖4。該結(jié)果反映了甜菜夜蛾snRNA的系統(tǒng)進(jìn)化情況，進(jìn)一步證實(shí)甜菜夜蛾snRNA序列的正確性。

2.3 除蟲菊提取物處理對(duì)甜菜夜蛾Se301細(xì)胞中U6 snRNA表達(dá)的影響

分析除蟲菊提取物農(nóng)藥脅迫下，Se301細(xì)胞中snRNA的表達(dá)穩(wěn)定性。前期分析測(cè)定表明，除蟲菊提取物處理Se301的LC為0.29%(體積分?jǐn)?shù))。使用含0.29%(體積分?jǐn)?shù))除蟲菊提取物培養(yǎng)基處理Se301細(xì)胞后24 h，提取細(xì)胞小RNA，RT-qPCR檢測(cè)snRNA表達(dá)結(jié)果顯示(圖5)，除蟲菊提取物處理細(xì)胞(值為26.00)與無藥物處理的Se301細(xì)胞對(duì)照(值為24.67)中snRNA表達(dá)量相當(dāng)。表明除蟲菊提取物L(fēng)C濃度處理對(duì)Se301細(xì)胞中snRNA的表達(dá)無顯著影響(=0.057>0.05)。

2.4 高溫處理對(duì)甜菜夜蛾Se301細(xì)胞中U6 snRNA表達(dá)的影響

檢測(cè)高溫培養(yǎng)(36 ℃)對(duì)Se301細(xì)胞中snRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明，Se301細(xì)胞在36 ℃和27 ℃培養(yǎng)1 h后，細(xì)胞snRNA的表達(dá)量相當(dāng)，值分別為25.04和25.06(圖6)。表明36 ℃高溫處理1 h對(duì)Se301細(xì)胞中snRNA表達(dá)無顯著影響(=0.935>0.05)。

2.5 SeMNPV感染對(duì)甜菜夜蛾U6 snRNA表達(dá)的影響

進(jìn)一步探究生物脅迫SeMNPV病毒感染對(duì)甜菜夜蛾snRNA表達(dá)的影響。收集SeMNPV病毒感染4齡甜菜夜蛾幼蟲72 h后的血淋巴，提取小RNA，RT-qPCR檢測(cè)snRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，SeMNPV病毒感染對(duì)甜菜夜蛾血淋巴中snRNA的表達(dá)無顯著影響(=0.345>0.05)，其中，SeMNPV感染甜菜夜蛾試驗(yàn)組的值為24.03，未感染的甜菜夜蛾對(duì)照組值為23.70，結(jié)果見圖7。

3 討論與結(jié)論

snRNA作為主要剪接體的重要組分，在各種真核生物細(xì)胞中的表達(dá)較為穩(wěn)定，常被用作昆蟲等物種miRNA表達(dá)檢測(cè)的內(nèi)參基因。本研究克隆甜菜夜蛾的snRNA序列，分析其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系以及在不同脅迫條件下的表達(dá)穩(wěn)定性，為其作為內(nèi)參基因的使用提供依據(jù)。

本研究克隆獲得全長(zhǎng)為107 nt的甜菜夜蛾snRNA序列。與已報(bào)道的果蠅等其他物種序列相同，甜菜夜蛾snRNA 3′末端為5個(gè)U的特殊終止序列，符合RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特征。由于基因轉(zhuǎn)錄后加工的可變剪接在真核生物中是普遍存在的，snRNA作為主要剪接體的重要組分，在不同真核生物中的進(jìn)化保守性高。進(jìn)化分析表明甜菜夜蛾snRNA與家蠶、小菜蛾和慶網(wǎng)蛺蝶這3個(gè)鱗翅目昆蟲及同翅目昆蟲褐色橘蚜的snRNA親緣關(guān)系最近。目前昆蟲snRNA序列克隆報(bào)道尚不多，snRNA在夜蛾科及昆蟲綱中的保守性和進(jìn)化關(guān)系有待更多物種的snRNA序列分析研究。

選擇在不同生理和環(huán)境條件下都能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?qū)Χ糠治鼋Y(jié)果的準(zhǔn)確性十分重要。封冰等研究發(fā)現(xiàn)小菜蛾snRNA在幼蟲各發(fā)育階段和馬拉硫磷等9種農(nóng)藥的脅迫下能穩(wěn)定表達(dá)。已報(bào)道snRNA作為內(nèi)參基因用于果蠅、家蠶、草地貪夜蛾和褐飛虱等昆蟲miRNA表達(dá)檢測(cè)。本研究利用除蟲菊提取物處理、36 ℃高溫培養(yǎng)和SeMNPV感染處理，細(xì)胞或幼蟲受脅迫條件下，甜菜夜蛾snRNA表達(dá)均未受到顯著影響，能穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)果表明甜菜夜蛾snRNA適合作為內(nèi)參基因用于甜菜夜蛾細(xì)胞和昆蟲miRNA表達(dá)定量檢測(cè)的內(nèi)參基因，以校正因樣品處理和試驗(yàn)操作等原因造成的試驗(yàn)誤差。進(jìn)一步可分析snRNA在甜菜夜蛾不同發(fā)育時(shí)期、不同組織細(xì)胞、不同病原菌侵染和不同時(shí)相等條件下的表達(dá)穩(wěn)定性。