孟順龍 劉濤 宋超

摘要[目的]應(yīng)用抑制消減雜交（SSH） 技術(shù)，建立滅多威脅迫下羅非魚精巢SSH正反向文庫(kù)。[方法]以雄性羅非魚為試驗(yàn)動(dòng)物，采用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建羅非魚精巢組織在滅多威脅迫下的正反向SSH文庫(kù)。試驗(yàn)共獲得45條EST，成功注釋25條，其中正向文庫(kù)13條，反向文庫(kù)12條。功能明確基因按功能可分為5類，其中催化活性、細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞過(guò)程、結(jié)構(gòu)分子活性相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。整合素β1表達(dá)量上調(diào)，絲/蘇氨酸蛋白激酶pim-3、Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase、核糖體蛋白L22表達(dá)下調(diào)。[結(jié)論]研究結(jié)果可為揭示滅多威對(duì)羅非魚生殖毒性的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 滅多威；羅非魚；抑制消減雜交；cDNA文庫(kù)；精巢

中圖分類號(hào) S965.125 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）22-0074-04

Abstract[Objective]To construct forward and reserve libraries of suppression subtractive hybridization（SSH） in the testis of male tilapia under the stress of methomyl by using SSH technology.[Method]Using male tilapia as test animal，the forward and reserve libraries of SSH in the testis of tilapia under the stress of methomyl were constructed by using SSH technology.[Result]45 expressed sequence tags （ESTs） were obtained，and 25 expressed sequence tags were successfully noted，including 13 forward libraries and 12 reserve libraries.The genes with confirmed functions were classified into 5 types.Related genes with catalytic activity and cell were upregulated，while related genes with structural molecules activity and biological process were downregulated.The expression amount of integrin β1 was upregulated，while serine/threonine protein kinase pim3，Ca2+ATPase，Na+K+ATPase and ribosomal protein L22 were downregulated.[Conclusion]The research results could lay the foundation for revealing the molecular mechanism of methomyls reproductive toxicity to tilapia.

Key words Methomyl； Tilapia； Suppression subtractive hybridization； cDNA library； Testis

滅多威屬于氨基甲酸酯類廣譜殺蟲劑，具有較強(qiáng)的觸殺和胃毒作用，無(wú)內(nèi)吸傳導(dǎo)作用，是目前使用最廣泛的殺蟲劑之一。1997年世界野生動(dòng)物基金會(huì)將滅多威列為雌激素類內(nèi)分泌干擾物[1]，其對(duì)環(huán)境的生物毒性表現(xiàn)為破壞動(dòng)物間的捕食關(guān)系，威脅生態(tài)系統(tǒng)平衡等[2]。由于滅多威在水中溶解性強(qiáng)、使用量大，加上工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的不合理排放，導(dǎo)致在一些水體和食品[3]中檢測(cè)到滅多威殘留。目前，滅多威由于在環(huán)境水體中檢出率高和具有內(nèi)分泌干擾作用等特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[4-6]。

抑制性消減雜交（SSH）是具有選擇擴(kuò)增目的基因功能的差減技術(shù)[7]。豐度不同的序列能夠通過(guò)該技術(shù)將其相對(duì)含量最終達(dá)成一致，然后運(yùn)用鏈內(nèi)退火時(shí)優(yōu)先于鏈間的原理，使引物與非目的序列片段兩端無(wú)法結(jié)合配對(duì)，抑制非目標(biāo)序列片段，從而擴(kuò)增了目的基因。與其他差異基因獲得方法相比，該技術(shù)具有靈敏度高、假陽(yáng)性低、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，使其用于篩選和克隆差異表達(dá)基因。筆者以雄性羅非魚為試驗(yàn)動(dòng)物，采用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建了羅非魚精巢組織在雌激素類農(nóng)藥滅多威脅迫下的正反向SSH文庫(kù)，鑒定羅非魚精巢組織在雌激素類農(nóng)藥滅多威脅迫下差異表達(dá)基因，旨在為揭示滅多威對(duì)羅非魚生殖毒性的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以雄性尼羅羅非魚（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興養(yǎng)殖基地）作為試驗(yàn)動(dòng)物，平均體質(zhì)量為（112.24±9.48） g，平均體長(zhǎng)為（17.06±0.91） cm。在容積300 L（實(shí)際水體200 L）的水族缸中隨機(jī)放入雄性羅非魚30尾，馴養(yǎng)4周。馴養(yǎng)期間，每天08：00投喂飼料1次，投喂量按羅非魚體質(zhì)量的2%計(jì)算。暗光比為12 h∶12 h。用空氣壓縮機(jī)進(jìn)行充氧。

1.2 試驗(yàn)用水

試驗(yàn)用水為曝氣7 d的去氯自來(lái)水，水溫（25.0±0.5） ℃，溶氧量6.3～7.0 mg/L，pH為（7.0±0.5），試驗(yàn)用水符合漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB11607—89）。

1.3 主要試劑和儀器

1.3.1 主要試劑。質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于97%的滅多威原藥，購(gòu)自上海焦點(diǎn)生物技術(shù)有限公司；Oligotex mRNA試劑盒、Maxi Plasmid 試劑盒均購(gòu)自Qiagen公司；1 kb DNA Ladder、UltraPure Agarose購(gòu)自Zrbiorise公司；Taq DNA聚合酶、10 mmol/L dNTP 購(gòu)自TaKaRa公司；TRIzol Reagent提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；RT Enzyme購(gòu)自ABI公司；PCR-Select cDNA Subtraction 試劑盒購(gòu)自Clonetech公司。

1.3.2 主要儀器。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，Centrifuge 5810R）；電轉(zhuǎn)化儀（BTX，ECM630）；PCR儀（Bio-rad，MyCycler）；電泳儀（Tanon，HE-120）；凝膠成像儀（Tanon，2500）。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期急性試驗(yàn)結(jié)果（滅多威的96 h LC50為430 μg/L）、在自然水體中滅多威殘留量（0～97 μg/L）[8-10]以及美國(guó)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定滅多威最高限量（200 μg/L）[11]，試驗(yàn)采用5個(gè)濃度梯度：0、0.2、2.0、20.0、200.0 μg/L。每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)平行，在300 L水族缸中配制上述各濃度染毒液200 L，每個(gè)平行隨機(jī)放入健康雄性羅非魚20尾。采用半靜態(tài)水接觸染毒法進(jìn)行試驗(yàn)，各濃度組水缸每天更換50%的水，并添加藥物至原濃度。試驗(yàn)期48 d，前30 d為滅多威暴露試驗(yàn)階段，后18 d為清水恢復(fù)試驗(yàn)階段（無(wú)滅多威）。

為測(cè)定各試驗(yàn)組滅多威的實(shí)際含量，參照張學(xué)健等[12]以及張冰等[13]的方法進(jìn)行測(cè)定，滅多威濃度分別為0、0.2、2.0、20.0、200.0 μg/L的試驗(yàn)組最初染毒時(shí)的滅多威含量分別為0、0.23、2.12、21.50、182.00 μg/L，24 h后各濃度組滅多威含量為0、0.21、1.92、18.52、179.00 μg/L。24 h后各濃度組與染毒時(shí)的滅多威濃度相差不大。

1.5 樣品采集

在染毒的第30天對(duì)200 μg/L滅多威處理組以及對(duì)照組羅非魚進(jìn)行樣品采集。采樣前24 h，停止喂食。試驗(yàn)期間，羅非魚活躍、健康。采樣時(shí)，用250 mg/L MS-222麻醉羅非魚，對(duì)其體長(zhǎng)和體重進(jìn)行測(cè)定，迅速將羅非魚處死后采集精巢，置于RNAlater保存液中，最后在-80 ℃超低溫冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 總 RNA 提取和mRNA的分離

取出超低溫冰箱中保存的樣品，將其研成粉末。采用TRIzol Reagent提取試劑盒提取羅非魚精巢組織總RNA，具體操作按照TRIzol Reagent提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。用乙醇將總RNA沉淀后，溶于DEPC處理水中，檢測(cè)總RNA質(zhì)量和濃度。樣本mRNA經(jīng)Oligotex mRNA試劑盒分離并純化，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7 SSH文庫(kù)的構(gòu)建

SSH文庫(kù)的構(gòu)建采用PCR-Select cDNA Subtraction 試劑盒，將純化的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入反轉(zhuǎn)錄酶到cDNA第一鏈合成中，用E.coli的DNA聚合酶I進(jìn)行第二鏈的合成。 以滅多威處理組精巢組織雙鏈 cDNA和對(duì)照組雙鏈cDNA互為驅(qū)動(dòng)方或?qū)嶒?yàn)方，分別構(gòu)建SSH正反向文庫(kù)。將試驗(yàn)方雙鏈cDNA 分成2份，分別與Adaptor 1和 Adaptor 2R相連接。成功連接后，將實(shí)驗(yàn)方cDNA同驅(qū)動(dòng)方cDNA一起進(jìn)行2次分子雜交，雜交產(chǎn)物再進(jìn)行2次特異PCR。PCR產(chǎn)物進(jìn)行T/A克隆，取文庫(kù)菌液50 μL，涂于具有相應(yīng)抗性的平板上，37 ℃下培育過(guò)夜，通過(guò)菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，保存菌種。鑒定菌落以M13 F 和 M13 R 為引物，采用PCR 法鑒定陽(yáng)性克隆。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min，反應(yīng)體系為20 μL，4 ℃下保存PCR產(chǎn)物。隨機(jī)挑選64個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.8 序列比對(duì)

去除EST有效序列載體以及接頭序列后，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比對(duì)，分析對(duì)比序列所具有的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 總 RNA 提取 使用TRIzol Reagent試劑盒，提取滅多威處理組和對(duì)照組的羅非魚精巢組織總RNA，并進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。從圖1可以看出，18S和28S兩條清晰條帶均位于1 000 bp以上，無(wú)基因組污染，即提取的RNA質(zhì)量較好。

2.2 雙鏈 cDNA 的合成與酶切

電泳檢測(cè)羅非魚雙鏈cDNA（圖2），并且將Rsa I酶切前后的雙鏈 cDNA條帶進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)Rsa I酶切后的片段明顯變小，條帶下移，酶切效果好，能夠滿足后續(xù)用于構(gòu)建文庫(kù)的試驗(yàn)要求。

2.3 差異片段陽(yáng)性克隆的篩選

將消減雜交后的片段連接到pMD18T載體上，構(gòu)建了滅多威脅迫下羅非魚精巢組織正反向消減cDNA文庫(kù)。隨機(jī)挑取36個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR篩選鑒定，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，重組率大于95%，載體中的片段長(zhǎng)度為100～500 bp。

2.4 陽(yáng)性克隆測(cè)序及分析

隨機(jī)挑選64個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，得到45條EST，將測(cè)序成功的序列除去載體和接頭序列，最后進(jìn)行GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)同源性比對(duì)，對(duì)相同序列進(jìn)行對(duì)比和拼接后成功注釋得到25條基因序列，其中正向文庫(kù)13條，反向文庫(kù)12條。功能確定基因序列結(jié)果如表1所示。

3 討論

在該試驗(yàn)雌激素類農(nóng)藥滅多威脅迫下羅非魚精巢組織SSH正向文庫(kù)中，低密度脂蛋白受體、17α-羥化酶/17，20-裂解酶表達(dá)量上調(diào)。低密度脂蛋白受體（LDLR）是細(xì)胞表面糖蛋白，它參與了卵巢、睪丸等甾源性組織的脂蛋白代謝過(guò)程。低密度脂蛋白經(jīng)受體LDLR途徑，攝取膽固醇在細(xì)胞內(nèi)用于類固醇激素合成、細(xì)胞增殖等。17α-羥化酶/17，20-裂解酶是體細(xì)胞色素P450c17酶，在膽固醇合成途徑中控制性類固醇激素的合成[14]。對(duì)魚類而言，P450c17酶在精巢中表達(dá)較多，而在卵巢中表達(dá)較少[15]。魚類性類固醇激素睪酮、11-酮基睪酮等則是體內(nèi)膽固醇的衍生物，它們通過(guò)影響生精細(xì)胞和支持細(xì)胞活性，在精子發(fā)生過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[16]。滅多威有環(huán)境雌激素內(nèi)分泌干擾作用[1]，可能對(duì)羅非魚類固醇激素的分泌有影響。孟順龍[17]研究發(fā)現(xiàn)，在高濃度滅多威脅迫下羅非魚血清睪酮和11-酮基睪酮含量顯著降低。在環(huán)境雌激素滅多威脅迫下，精巢組織中低密度脂蛋白受體蛋白、17α-羥化酶/17，20-裂解酶表達(dá)量上調(diào)，可能是因羅非魚精巢組織脂蛋白代謝或類固醇激素分泌受滅多威的干擾，從而引起機(jī)體的反饋機(jī)制，使得低密度脂蛋白受體、17α-羥化酶/17，20-裂解酶表達(dá)量上調(diào)。

黏附連接主要是將相鄰的2個(gè)細(xì)胞通過(guò)黏附分子而連接在一起，其中生精細(xì)胞則是通過(guò)黏附連接與支持細(xì)胞相連接。當(dāng)黏附分子的數(shù)量改變或與胞質(zhì)內(nèi)的接頭蛋白的關(guān)系發(fā)生改變后，將使得細(xì)胞之間的黏附發(fā)生改變[18]。在該試驗(yàn)SSH正向文庫(kù)中，整合素β1表達(dá)量上調(diào)。整合素α6和整合素β1是生精上皮中2個(gè)重要的黏附分子，它們可以在支持細(xì)胞表面構(gòu)成異源二聚體[19]，與精細(xì)胞表面層黏連蛋白相互作用，參與構(gòu)成生精上皮的頂面ES[20]。因此，精巢組織中整合素β1表達(dá)上調(diào)，可能是因環(huán)境雌激素滅多威對(duì)羅非魚精巢組織黏附性造成影響而引起的反饋機(jī)制，使得整合素β1表達(dá)上調(diào)，以維持精巢組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

在羅非魚精巢組織SSH反向文庫(kù)中，絲/蘇氨酸蛋白激酶pim-3表達(dá)下調(diào)。絲/蘇氨酸蛋白激酶pim-3具有磷酸化凋亡蛋白Bad，發(fā)送細(xì)胞生存信號(hào)的生物學(xué)作用。線粒體外膜的促凋亡蛋白 Bax 在凋亡蛋白Bad的作用下形成同源二聚體，增加線粒體膜通透性，釋放細(xì)胞色素Cytc，并激活Caspase，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[21]。Bad的活性形式是非磷酸化的，Bad磷酸化后失去活性，能夠抑制細(xì)胞凋亡[22-23]。因此，絲/蘇氨酸蛋白激酶pim-3表達(dá)下調(diào)，可能限制凋亡蛋白Bad磷酸化。在該試驗(yàn)SSH反向文庫(kù)中，質(zhì)膜Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase表達(dá)下調(diào)。在正常情況下，細(xì)胞質(zhì)膜中離子濃度呈現(xiàn)一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，能夠維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、正常生理功能。Ca2+-AT-Pase、Na+-K+-ATPase對(duì)細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)上Ca2+、Na+、K+離子穩(wěn)態(tài)具有重要的調(diào)節(jié)作用，它們?cè)谥鲃?dòng)運(yùn)輸中具有特定的離子運(yùn)載功能，以維持組織或器官細(xì)胞膜上離子平衡。在滅多威脅迫下，Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase表達(dá)下調(diào)，這可能影響其對(duì)羅非魚精巢組織細(xì)胞膜上離子濃度的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞膜上離子濃度的失衡，影響精巢組織細(xì)胞的正常生理功能。

在羅非魚精巢組織SSH反向文庫(kù)中，核糖體蛋白L22表達(dá)下調(diào)。李紅艷[24]發(fā)現(xiàn)在果蠅胚胎、幼蟲S2細(xì)胞中敲除 L22對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生影響。孫凱等[25]發(fā)現(xiàn)L22表達(dá)沉默時(shí)細(xì)胞周期蛋白D1顯著降低，相應(yīng)的細(xì)胞增殖受到顯著抑制。這說(shuō)明核糖體蛋白L22與細(xì)胞增殖周期有密切聯(lián)系。因此，在滅多威脅迫誘導(dǎo)糖體蛋白L22表達(dá)下調(diào)，可能對(duì)精巢組織細(xì)胞增殖周期造成影響。另外，還有磷脂酶A2差異表達(dá)基因下調(diào)。磷脂酶A2主要水解甘油磷脂，參與磷脂代謝。磷脂酶A2表達(dá)下調(diào)，可能影響精巢組織的磷脂代謝過(guò)程。

4 結(jié)論

采用抑制消減雜交（SSH）技術(shù)，構(gòu)建了羅非魚精巢組織在雌激素類農(nóng)藥滅多威脅迫下的正反向SSH文庫(kù)，并獲得8條功能確定基因序列。

對(duì)部分重要的差異表達(dá)基因的鑒定和分析表明，在環(huán)境雌激素滅多威脅迫下，羅非魚精巢組織脂蛋白代謝或類固醇激素分泌受到干擾，引起機(jī)體防御機(jī)制，誘導(dǎo)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白、17α-羥化酶/17，20-裂解酶表達(dá)量上調(diào)；誘導(dǎo)整合素β1表達(dá)量上調(diào)，以維持精巢組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；絲/蘇氨酸蛋白激酶pim-3表達(dá)下調(diào)，可能限制凋亡蛋白Bad磷酸化。Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase、核糖體蛋白L22表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞膜上離子平衡以及精巢組織細(xì)胞增殖可能受到影響。

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