曹燕燕， 葛昌斌， 齊雙麗， 廖平安， 黃 杰， 王 君， 李雷雷， 喬冀良， 張振永

(漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院/河南省抗赤霉優(yōu)質(zhì)小麥種質(zhì)創(chuàng)制及新品種培育工程技術(shù)研究中心，河南漯河 462300)

小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要糧食作物，小麥的可持續(xù)發(fā)展關(guān)系到我國(guó)的糧食安全、人民溫飽和社會(huì)穩(wěn)定。近幾年，隨著極端天氣頻繁出現(xiàn)，低溫凍害已成為影響小麥生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因素之一。特別是春季低溫，小麥正處于拔節(jié)至孕穗期，此時(shí)小麥組織器官幼嫩、含水量大，抵抗霜凍的能力較弱；同時(shí)小麥穗分化正處于雌雄蕊分化至小花原基分化期，對(duì)低溫反應(yīng)尤其敏感，如遇低溫很容易造成傷害。黃淮麥區(qū)是我國(guó)冬小麥主產(chǎn)區(qū)之一，目前低溫冷害已成為該區(qū)主要?dú)庀鬄?zāi)害之一，發(fā)生頻率高、面積大、危害重，嚴(yán)重制約小麥生長(zhǎng)，因此對(duì)黃淮麥區(qū)的小麥品種進(jìn)行抗寒性鑒定研究具有重大意義，不僅關(guān)系到今后小麥的育種和推廣問(wèn)題，也直接關(guān)系到國(guó)家的糧食安全和社會(huì)穩(wěn)定等問(wèn)題。

小麥遭受低溫脅迫后，植株會(huì)產(chǎn)生一種應(yīng)激反應(yīng)起到保護(hù)作用，主要表現(xiàn)在小麥體內(nèi)可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量明顯增加，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與成分改變以及一些新酶的產(chǎn)生等。于晶等研究表明，抗寒性強(qiáng)的小麥品種脯氨酸和可溶性蛋白含量均高于抗寒性弱的品種；劉艷陽(yáng)等研究表明，超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量是小麥抗寒性的2個(gè)抗寒指標(biāo)；余海波研究發(fā)現(xiàn)，小麥拔節(jié)期遭受低溫脅迫后，對(duì)SOD和過(guò)氧化物酶(POD)活性、脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量、可溶性糖含量、MDA含量等都有影響；衛(wèi)秀英等的研究發(fā)現(xiàn)，抗寒性弱的小麥品種MDA含量高于抗寒性強(qiáng)的品種，而SOD活性和POD活性均低于抗寒性強(qiáng)的品種。在生產(chǎn)中，單一的生理指標(biāo)很難準(zhǔn)確反映各個(gè)小麥品種抗寒性的強(qiáng)弱，因此可結(jié)合隸屬函數(shù)法和產(chǎn)量指標(biāo)等進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

漯麥906于2019年通過(guò)河南省審定，審定編號(hào)為豫審麥20190064；漯麥47于2021年通過(guò)湖北省審定，審定編號(hào)為鄂審麥20210007；漯麥36已完成試驗(yàn)程序，即將國(guó)審。本研究以小麥新品種漯麥47、漯麥906、對(duì)照周麥18、參試新品系漯麥36、漯麥6098、漯麥956和漯麥C101共7個(gè)試驗(yàn)材料為研究對(duì)象，室外盆栽種植，至小麥拔節(jié)期連盆一起移入春化室模擬低溫處理，探索拔節(jié)期低溫對(duì)不同品種(系)小麥葉片生理生化特性的影響，并運(yùn)用隸屬函數(shù)對(duì)各品種(系)抗寒性進(jìn)行分析，結(jié)合產(chǎn)量表現(xiàn)對(duì)供試材料的抗寒性做出綜合評(píng)價(jià)，以期為小麥品種漯麥906和漯麥47，將審定品系漯麥36做出抗寒性評(píng)價(jià)以及后期示范推廣和育種親本的選擇等提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020—2021年在河南省漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田網(wǎng)室進(jìn)行，采用盆栽方法。供試材料為漯麥47、漯麥906、周麥18、漯麥36、漯麥6098、漯麥956和漯麥C101共7個(gè)品種(系)小麥，種子由漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所提供。盆栽用土為大田 0～30 cm耕層土，有機(jī)質(zhì)含量為14.13 g/kg，全氮含量為0.86 g/kg，硝態(tài)氮含量為25.56 mg/kg，速效磷含量為42.59 mg/kg，速效鉀含量為168.99 mg/kg，pH值為7.47。盆直徑30 cm，高60 cm，底部用網(wǎng)袋包裹，埋入大田，盆內(nèi)土壤表面與地面持平。播前每盆施復(fù)合基肥6 g，土壤水澆透沉實(shí)后于2020年10月15日播種。3葉期定苗，每盆留苗9株，每個(gè)品種種植9盆，其中3盆用于低溫取樣，3盆用于低溫脅迫后測(cè)產(chǎn)，3盆用于常溫對(duì)照，共計(jì)63盆。澆水量根據(jù)土壤墑情決定，每盆澆水量一致。其他管理同大田，2021年6月2日收獲。

1.2 低溫處理方法

2021年春季，各小麥品種生長(zhǎng)至拔節(jié)期，通過(guò)顯微鏡觀察幼穂分化，各品種進(jìn)入雌雄蕊原基分化期。將各品種6盆從大田移入春化室模擬春季低溫脅迫，春化室內(nèi)溫度設(shè)置為白天0 ℃、夜間-4 ℃，溫度誤差為0.5 ℃，空氣相對(duì)濕度為70%。采用人工光源光照，光照時(shí)間為08：00—18：00。低溫處理0、1、2、3、4 d時(shí)取主莖最上部的展開(kāi)葉用于生理指標(biāo)檢測(cè)，每個(gè)品種取3盆，3個(gè)重復(fù)。各個(gè)品種剩余3盆在低溫處理后移至自然條件下，直至收獲，用于產(chǎn)量性狀方面的調(diào)查。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

生理生化性狀的測(cè)定：每個(gè)供試材料測(cè)定3次取其平均值。采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定MDA含量；采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定SOD活性；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性；采用過(guò)氧化氫法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性；采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量；采用酸性茚三酮法測(cè)定脯氨酸含量。

產(chǎn)量因子的測(cè)定：低溫脅迫處理4 d后，將未取樣的盆栽小麥放置到大田原位置，自然條件下自然恢復(fù)生長(zhǎng)。蠟熟期后收獲，分別記載單株穗數(shù)、單株穗粒數(shù)和單株產(chǎn)量。

1.4 抗寒性評(píng)價(jià)及方法

應(yīng)用隸屬函數(shù)法評(píng)價(jià)抗寒性，計(jì)算公式如下：

(1)與抗寒性呈正相關(guān)的各指標(biāo)(SOD活性、POD活性、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量等)用公式()=(-)/(-)計(jì)算。

(2)與抗寒性呈負(fù)相關(guān)的各指標(biāo)(MDA含量) 用公式()=1-(-)/(-)計(jì)算。式中：()為第個(gè)品種、第天相對(duì)百分?jǐn)?shù)的隸屬度；表示第個(gè)品種、第天某一指標(biāo)測(cè)定值與其對(duì)應(yīng)對(duì)照值的百分?jǐn)?shù)；、為所有供試品種某一具體指標(biāo)在某一天最大值和最小值的相對(duì)百分?jǐn)?shù)值。對(duì)各個(gè)指標(biāo)所求的隸屬函數(shù)值進(jìn)行累加、求取平均值。之后按照從大到小的順序?qū)Ω鱾€(gè)品種的隸屬函數(shù)平均值進(jìn)行排序，對(duì)應(yīng)的得到各個(gè)品種抗寒性的強(qiáng)弱。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用WPS Office進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖，利用DPS 15.10的Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)拔節(jié)期小麥葉片SOD活性的影響

如圖1所示，拔節(jié)期持續(xù)低溫脅迫后，各小麥品種(系)SOD活性出現(xiàn)不同程度增加，以增強(qiáng)對(duì)逆境的適應(yīng)能力，與常溫對(duì)照相比，均差異顯著。隨著低溫持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD活性整體表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)。低溫處理1 d后，品種(系)間升高幅度存在明顯差異，漯麥906升幅最大(227.42%)，漯麥C101升幅最小(101.09%)，其余品種(系)升幅介于兩者之間；低溫處理2 d，除周麥18和漯麥C101外，其他品種(系)SOD活性出現(xiàn)下降；隨著低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)至3 d和4 d，大部分品種(系)SOD活性表現(xiàn)先上升后下降。由試驗(yàn)可知，在持續(xù)低溫脅迫下，不同小麥品種(系)SOD活性存在差異，但都有較大幅度提高，以抵御低溫脅迫對(duì)植株造成的傷害。

2.2 低溫脅迫對(duì)拔節(jié)期小麥葉片POD活性的影響

如圖2所示，低溫脅迫后各品種(系)的POD活性均有升高，且升高程度不同，也都與對(duì)照差異顯著(除漯麥36處理2 d與對(duì)照差異不顯著外)。低溫脅迫1 d后，各品種(系)之間以漯麥47升幅最高(111.29%)，其次為漯麥6098(109.74%)；低溫脅迫2 d，除漯麥956活性繼續(xù)增加外，其余6個(gè)品種(系)POD活性均下降；低溫脅迫3 d和4 d，各品種(系)POD活性持續(xù)上升，與對(duì)照相比，增幅為68.33%～167.19%，其中漯麥47和漯麥6098增幅最大，分別為167.19%和115.24%。說(shuō)明在長(zhǎng)期的低溫脅迫下，漯麥47和漯麥6098的POD的抗氧化能力仍持續(xù)較高，而其他5個(gè)品種(品系)的抗氧化能力稍弱，但對(duì)活性氧自由基仍有一定的清除作用。

2.3 低溫脅迫對(duì)拔節(jié)期小麥葉片CAT活性的影響

如圖3所示，低溫脅迫后各品種(系)的CAT活性均有增加，也都與對(duì)照差異顯著。低溫脅迫處理1 d后，7個(gè)小麥葉片中的CAT活性平均升高328.74%，但品種(系)間升高幅度存在明顯差異；除漯麥956和漯麥C101外，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各品種(系)CAT活性呈現(xiàn)“升高—降低—升高—升高”的趨勢(shì)；低溫處理 4 d 后，與對(duì)照相比，漯麥47增幅最高，為444.89%，漯麥C101增幅最少，為203.37%，其他材料介于兩者之間。這表明持續(xù)低溫脅迫后，各供試材料清除活性氧的能力有差異，但在低溫脅迫4 d后，除漯麥906和漯麥C101外，其他品種(系)CAT活性仍較高，可以將低溫對(duì)植物的傷害控制在一定范圍內(nèi)。

2.4 低溫脅迫對(duì)拔節(jié)期小麥葉片丙二醛活性的影響

如圖4所示，低溫脅迫后各品種(系)的MDA含量均有增加，也都與對(duì)照差異顯著。低溫脅迫 2 d，漯麥47和漯麥C101的MDA含量下降，其他5個(gè)材料MDA含量略有上升；與處理3 d相比，低溫脅迫4 d后漯麥6098、漯麥47、周麥18和漯麥906的MDA含量出現(xiàn)下降，其他3個(gè)材料MDA含量則繼續(xù)上升。這說(shuō)明低溫加速了各品種(系)膜脂過(guò)氧化，活性氧已傷害到各品種(系)，但根據(jù)MDA含量的不同，各品種(系)間受傷害的程度存在差異。

2.5 低溫脅迫對(duì)拔節(jié)期小麥葉片脯氨酸含量的影響

由圖5可以看出，低溫脅迫后各品種(系)的脯氨酸含量均有增加，也都與對(duì)照差異顯著。隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，漯麥47、周麥18、漯麥906和漯麥36的脯氨酸含量一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；與脅迫1 d相比，漯麥6098、 漯麥956和漯麥C101的脯氨酸含量呈現(xiàn)先上升后降低再上升的趨勢(shì)。由此可以看出，低溫脅迫下，各品種(系)會(huì)積累較多的脯氨酸，以維護(hù)細(xì)胞膜內(nèi)代謝的平衡和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，以減輕低溫引起的傷害，但各品種(系)間脯氨酸含量變化趨勢(shì)存在差異。

2.6 低溫脅迫對(duì)拔節(jié)期小麥葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

如圖6所示，各供試品種(系)在拔節(jié)期遭受低溫脅迫后，可溶性蛋白質(zhì)含量均有不同程度增加，除漯麥36外，其他6個(gè)均與對(duì)照呈顯著性差異。低溫脅迫1 d后，各品種(系)之間以漯麥6098升幅最高(100.07%)，周麥18升幅最低(43.98%)，其他供試材料介于兩者之間；與低溫脅迫2 d相比，低溫脅迫 3 d，漯麥6098、周麥18和漯麥906可溶性蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)下降，其他4個(gè)持續(xù)上升；與低溫脅迫3 d相比，低溫持續(xù)脅迫4 d，漯麥6098、周麥18和漯麥C101可溶性蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)上升，其他4個(gè)品種(系)出現(xiàn)下降，漯麥6098表現(xiàn)顯著差異。由此可知，低溫脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，不同品種(系)間可溶性蛋白含量差異越大。

2.7 拔節(jié)期低溫脅迫對(duì)小麥籽粒產(chǎn)量構(gòu)成因素的影響

由表1可知，與CK相比，小麥在拔節(jié)期受到低溫脅迫4 d后，各供試材料不孕小穗數(shù)顯著升高，單株分蘗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)小穗數(shù)、千粒質(zhì)量和單穗產(chǎn)量均減少，不孕小穗數(shù)增加。其中漯麥47單株減產(chǎn)率最低，為39.57%，漯麥956減產(chǎn)率最高，達(dá)到75.73%。綜合產(chǎn)量各因素變化數(shù)據(jù)，在本試驗(yàn)環(huán)境下，拔節(jié)期低溫脅迫對(duì)小麥不孕小穗數(shù)和單穗產(chǎn)量影響較大，而對(duì)結(jié)實(shí)小穗數(shù)和穗粒數(shù)影響比較小。

表1 拔節(jié)期低溫脅迫對(duì)單株小麥產(chǎn)量的影響

2.8 小麥品種抗寒性的隸屬函數(shù)值綜合分析

從表2可知，在低溫脅迫下，品種間隸屬函數(shù)值差異非常明顯，同一品種(系)不同指標(biāo)的隸屬函數(shù)值也存在差異。每一品種(系)各項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)的隸屬值的平均綜合值越高，表明該品種(系)的抗寒性越強(qiáng)。根據(jù)綜合值，將7個(gè)供試品種(系)可分為3類：第Ⅰ類為漯麥6098、漯麥47、周麥18和漯麥906，屬于抗寒性強(qiáng)的品種(系)；第Ⅱ類為漯麥36和漯麥C101，屬抗寒性較好的品系；第Ⅲ類為漯麥956，屬抗寒性弱的品系。試驗(yàn)結(jié)果與各品種(系)的單株減產(chǎn)率基本一致，且與田間各品種(系)的抗寒性表現(xiàn)基本一致。

表2 低溫脅迫下小麥葉片各生理指標(biāo)的隸屬值

3 討論與結(jié)論

持續(xù)低溫脅迫下，當(dāng)保護(hù)酶的清除能力不能及時(shí)清除多余的氧自由基時(shí)，就會(huì)引起膜脂不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化，產(chǎn)生膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA，膜脂過(guò)氧化的程度隨溫度降低加重，同時(shí)與低溫脅迫時(shí)間呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中，低溫脅迫1 d后，各供試材料的MDA含量相比于對(duì)照，均顯著上升，表明低溫脅迫后，各供試材料抗氧化能力雖有所增強(qiáng)，但仍不能及時(shí)清除活性氧，引起膜脂過(guò)氧化，對(duì)小麥造成傷害；隨著低溫脅迫的持續(xù)，各供試材料MDA含量變化有升有降，說(shuō)明各個(gè)品種(系)對(duì)低溫的適應(yīng)調(diào)節(jié)能力存在差異；低溫脅迫4 d與脅迫 3 d 相比，抗寒性強(qiáng)的4個(gè)品種(系)漯麥6098、漯麥47、周麥18和漯麥906，MDA含量出現(xiàn)下降，說(shuō)明抗寒性強(qiáng)的品種，在持續(xù)低溫脅迫后，能夠通過(guò)自身調(diào)節(jié)使質(zhì)膜透性部分修復(fù)。

脯氨酸通過(guò)其亞氨基促進(jìn)蛋白質(zhì)水合而成為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，可溶性蛋白的增多有利于維持低溫狀態(tài)時(shí)酶的構(gòu)象，因此脯氨酸是植物抗寒生理中的一個(gè)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，在低溫脅迫1 d后，各供試品種(系)脯氨酸含量均有不同程度增加，均與對(duì)照呈顯著性差異。隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，漯麥47、周麥18、漯麥906和漯麥36的脯氨酸含量一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；與脅迫處理1 d相比，漯麥6098、漯麥956和漯麥C101的脯氨酸含量呈現(xiàn)先上升后降低再上升的趨勢(shì)。說(shuō)明漯麥47、周麥18、漯麥906和漯麥36這4個(gè)品種(系)在持續(xù)低溫脅迫下可以通過(guò)積累較多的脯氨酸來(lái)提高自身抗寒性。

可溶性蛋白作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)，作用主要是為了調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透壓的平衡、維持細(xì)胞正常的生理代謝活動(dòng)。研究表明，植株細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量的高低與其自身抗寒性存在密切的關(guān)系。低溫脅迫后植株體內(nèi)可溶性蛋白含量升高，以提高植物在低溫下的滲透調(diào)節(jié)能力和代謝功能，進(jìn)一步提高植株的抗寒能力。本試驗(yàn)中低溫持續(xù)脅迫4 d后，漯麥6098、周麥18和漯麥C101可溶性蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)上升，與脅迫處理3 d相比，漯麥6098表現(xiàn)顯著性差異。說(shuō)明這3個(gè)供試材料在長(zhǎng)期低溫脅迫下，通過(guò)提高體內(nèi)可溶性蛋白的含量來(lái)增強(qiáng)自身的抗寒能力，漯麥6098表現(xiàn)更突出。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，其他試驗(yàn)材料可溶性蛋白含量存在差異。

拔節(jié)期低溫凍害對(duì)小麥穗部發(fā)育和單株產(chǎn)量影響較大，不孕小穗數(shù)顯著提高，穗粒數(shù)減少，千粒質(zhì)量降低，且各材料間單穗產(chǎn)量下降幅度不同。本試驗(yàn)中漯麥47單株減產(chǎn)率最低，為39.57%，漯麥956減產(chǎn)率最高，達(dá)到75.73%。綜合各產(chǎn)量因素變化數(shù)據(jù)得出，拔節(jié)期低溫脅迫對(duì)小麥單株產(chǎn)量和不孕小穗數(shù)影響較大，而對(duì)結(jié)實(shí)小穗數(shù)和穗粒數(shù)影響相對(duì)較小。

通過(guò)隸屬函數(shù)綜合值分析評(píng)價(jià)小麥拔節(jié)期的抗寒性，供試材料被分為3類。漯麥6098、漯麥47、周麥18和漯麥906，屬于抗寒性強(qiáng)的品種(系)；漯麥36和漯麥C101，屬抗寒性較好品系；漯麥956，屬抗寒性弱的品系。這是檢測(cè)各材料幾個(gè)生理生化指標(biāo)綜合反應(yīng)的結(jié)果，能夠較準(zhǔn)確地反映出各品種(系)間抗寒性的差異，再結(jié)合各材料的產(chǎn)量指標(biāo)，來(lái)綜合評(píng)價(jià)各供試材料的抗寒性，更加準(zhǔn)確。

拔節(jié)期是小麥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的重要時(shí)期，也是對(duì)低溫敏感的時(shí)期。低溫脅迫下，植物細(xì)胞多種生理生化指標(biāo)發(fā)生改變以適應(yīng)低溫條件和進(jìn)行自我調(diào)節(jié)。小麥應(yīng)對(duì)低溫逆境脅迫涉及一系列復(fù)雜因素，既有外部因素，也有內(nèi)部因素。本研究根據(jù)試驗(yàn)需要，篩選了7個(gè)供試材料，研究了拔節(jié)期持續(xù)低溫脅迫下生理生化指標(biāo)和產(chǎn)量的變化，為收集和鑒定抗寒性小麥種質(zhì)資源提供依據(jù)。目前分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅猛，植物耐受低溫脅迫機(jī)制的研究也從生理生化水平向分子水平轉(zhuǎn)變，下一步將開(kāi)展相關(guān)抗凍基因表達(dá)等方面的研究，將分子育種手段有效融合到常規(guī)育種中，為培育抗寒、耐倒春寒的小麥新品種提供技術(shù)支撐。