任思瑞 李道亮 周鴻媛 郭 婷 張宇昊,2 馬 良,2,*

(1 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2 西南大學(xué)生物學(xué)研究中心，重慶 400715)

鏈格孢霉菌屬極易污染小麥、大麥、燕麥、高粱等農(nóng)作物和番茄、柑橘、蘋果等果蔬及其制品[1-4]，其次級(jí)代謝產(chǎn)物主要有二苯-α-吡喃酮類鏈格孢霉毒素[鏈格孢酚單甲醚(alternariol monomethyl ether，AME)、鏈格孢酚(alternariol，AOH)和交鏈孢烯(altenuene，ALT)等]、四酸類鏈格孢霉毒素[細(xì)交鏈格孢菌酮酸(tenuazonic acid，TeA)和異-細(xì)交鏈格孢菌酮酸(iso-tenuazonic acid，iso-TeA)]等[5-6]。其中AME和AOH由于污染范圍廣、毒性較大而受到較高關(guān)注[7-9]。研究表明，AME和AOH對(duì)動(dòng)物體具有潛在致癌性、發(fā)育與遺傳毒性作用，且二者之間具有協(xié)同效應(yīng)[10]。但目前鏈格孢霉毒素毒性資料較為缺乏，絕大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)針對(duì)此類毒素仍沒(méi)有限量標(biāo)準(zhǔn)。2019年歐盟發(fā)布了一份監(jiān)測(cè)食品中鏈格孢霉毒素(AME、AOH、TeA)的建議草案，建議AME和AOH在加工番茄制品、芝麻、葵花籽、葵花籽油以及嬰幼兒谷類食品的基準(zhǔn)值為5～30 μg·kg-1[11-14]，這對(duì)補(bǔ)充和完善相關(guān)的毒理學(xué)資料具有重要意義。人血清白蛋白(human serum albumins，HSA)是外源性小分子進(jìn)入血液中的常見轉(zhuǎn)運(yùn)工具[15-17]。本研究體外模擬生理血液pH條件，通過(guò)穩(wěn)態(tài)熒光光譜、同步熒光光譜、3D熒光光譜和圓二色光譜方法，探究二苯-α-吡喃酮類鏈格孢霉毒素(AME、AOH)與HSA的相互作用，并對(duì)其相互作用過(guò)程中的猝滅速率常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合距離、結(jié)合作用力等信息進(jìn)行分析，初步探討鏈格孢霉毒素結(jié)構(gòu)性質(zhì)及其與人血清白蛋白相互作用后對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)變化的影響，這對(duì)補(bǔ)充和完善該類毒素的毒理學(xué)資料及其安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義，還可對(duì)該類毒素進(jìn)行有效評(píng)估、防控，為其在農(nóng)作物及其制品、飼料等農(nóng)業(yè)產(chǎn)品中限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HSA(規(guī)格>96%)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；AME(規(guī)格>99%)、AOH(規(guī)格>99%)，新加坡Pribolab公司；乙腈(色譜純)，美國(guó)Honeywell公司；Tris(分析純)，美國(guó)Bio Basic公司；HCl(分析純)，成都科龍化工試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F-380熒光分光光度計(jì)，天津港東科技發(fā)展股份有限公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)，上海美析儀器有限公司；MOS-500圓二色譜儀，法國(guó)Bio-Logic公司；SDC-6恒溫水浴循環(huán)，寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-S2恒溫水浴鍋，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；pHS-25酸度計(jì)，上海雷磁儀器有限公司；Milli-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司；QL 901渦旋振蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 熒光光譜測(cè)定方法

1.3.1.1 穩(wěn)態(tài)熒光光譜法 在1 cm光徑的熒光比色皿中進(jìn)行光譜掃描，血清白蛋白的濃度固定為5 μmol·L-1， AME/AOH的最終濃度為0、2.5、5、10、15、20 μmol·L-1[16]?？刂茩z測(cè)溫度為25、31、37℃，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，掃描速度為240 nm·min-1，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，電壓為400 V，增益為3。記錄血清白蛋白在300～550 nm波長(zhǎng)下的熒光光譜。校正后的熒光強(qiáng)度計(jì)算公式如下[18]：

(1)

式中，F(xiàn)cor為校正后的熒光強(qiáng)度；Fobs為觀測(cè)到的熒光強(qiáng)度；Aex和Aem分別為受試毒素在激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.3.1.2 3D熒光光譜法 固定血清白蛋白的濃度為5 μmol·L-1，AME和AOH最終濃度為0和20 μmol·L-1。 激發(fā)波長(zhǎng)為260～320 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為260～400 nm，掃描間隔為2 nm，掃描速度為240 nm·min-1， 激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，電壓為400 V，增益為3。測(cè)定該體系的3D熒光光譜。

1.3.1.3 同步熒光光譜法 固定血清白蛋白的濃度為5 μmol·L-1，AME和AOH濃度為0、2.5、5、10、15、20 μmol·L-1。在激發(fā)波長(zhǎng)260～320 nm條件下，收集發(fā)射波長(zhǎng)275～335 nm范圍內(nèi)的熒光光譜(Δλ=15 nm)。在激發(fā)波長(zhǎng)250～320 nm條件下，收集發(fā)射波長(zhǎng)310～380 nm范圍內(nèi)的熒光光譜(Δλ=60 nm)。掃描速度為240 nm·min-1，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，電壓為400 V，增益為3。

1.3.2 相互作用的猝滅常數(shù)計(jì)算方法 利用Stern-Volmer方程對(duì)不同溫度下(25、31、37℃)的熒光猝滅數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[19-20]。

(2)

式中，F(xiàn)0和F分別代表不存在和存在毒素時(shí)血清白蛋白的熒光強(qiáng)度；Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)(L·mol-1)；Q為受試毒素的濃度(mol·L-1)；Kq為血清白蛋白的猝滅速率常數(shù)(L·mol-1·s-1)；τ0為不存在毒素時(shí)血清白蛋白的平均熒光壽命(一般為10-8s)。

1.3.3 相互作用的結(jié)合常數(shù)計(jì)算方法 參照Sun等[21]的方法，在不同溫度下，假設(shè)蛋白質(zhì)P上有n個(gè)猝滅劑Q的結(jié)合位點(diǎn)，則有以下方程：

nQ+P→QnP

(3)

(4)

如果總的蛋白含量為P0，則有P0=QnP+P，其中P為未結(jié)合的蛋白。

(5)

F0和F分別代表不存在和存在猝滅劑時(shí)血清白蛋白的熒光強(qiáng)度；Q為受試毒素的濃度(mol·L-1)；Ka為結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

1.3.4 相互作用的熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算方法 根據(jù)van’t Hoff方程計(jì)算AOH/AME-HSA結(jié)合作用的熱力學(xué)參數(shù)ΔH和ΔS[22]。

(6)

式中，Ka為相應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)；R為氣體常數(shù)，8.314 J·mol-1·K-1；以lnKa為縱坐標(biāo)，1·T-1為橫坐標(biāo)作圖，線性擬合后可得ΔH和ΔS。各溫度下的自由能變化ΔG可由Gibbs方程計(jì)算得出：

ΔG=ΔH-TΔS

(7)

1.3.5 相互作用的結(jié)合距離測(cè)定方法 在不同溫度下，通過(guò)以下公式計(jì)算HSA(供體)和AOH/AME(受體)之間的結(jié)合距離和能量轉(zhuǎn)移效率[23]：

(8)

式中，F(xiàn)和F0為毒素存在和不存在時(shí)血清白蛋白的熒光強(qiáng)度；R0為能量轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離；r為能量供體和受體之間的結(jié)合距離。

(9)

式中，K2為偶極子的空間取向因子；N為介質(zhì)的平均折射率；φ為供體的熒光量子產(chǎn)率；J為供體熒光發(fā)射光譜和受體紫外吸收光譜的重疊積分。對(duì)于HSA，K2=2/3，N=1.336，φ=0.118。

(10)

式中，F(xiàn)(λ)為供體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度；ε(λ)為受體在波長(zhǎng)λ處的消光系數(shù)。

1.3.6 圓二色光譜測(cè)定方法 在不同溫度下，使用0.1 mm的石英比色皿，HSA濃度為10 μmol·L-1，在與AME/AOH的濃度比為1∶0、1∶1、1∶2、1∶3條件下測(cè)定圓二色譜數(shù)據(jù)。掃描間隔1 nm，帶寬2 nm，采集持續(xù)時(shí)間1 s，測(cè)定波長(zhǎng)為200～250 nm。每個(gè)樣品測(cè)定3次取平均值。使用以下公式將數(shù)據(jù)單位轉(zhuǎn)換為平均殘留橢圓率(mean residue ellipticity，MRE)[24]：

(11)

式中，MRE為平均殘留橢圓率(deg·cm2·d·mol-1)；θobs為儀器測(cè)量值(mdeg)；n為蛋白質(zhì)的殘基數(shù)，HSA為584；c為血清白蛋白的濃度(mol·L-1)；l為比色皿光徑(cm)。

通過(guò)以下公式計(jì)算HSA的α-螺旋含量：

(12)

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019收集和處理數(shù)據(jù)，使用Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AME和AOH與HSA互作類型研究

通過(guò)小分子毒物對(duì)血清白蛋白內(nèi)源熒光的猝滅作用可判斷二者之間的互作類型[25]。由圖1可知，隨著AME和AOH濃度的增加(2.5～20 μmol·L-1)，HSA熒光強(qiáng)度逐漸降低，發(fā)生明顯熒光猝滅，說(shuō)明二者發(fā)生了相互作用。隨AME毒素濃度的不斷增加，HSA-AME的熒光值不斷增加并在475 nm處顯示一個(gè)新熒光峰，可能是由于二者互作發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移形成了復(fù)合物。

圖1 不同濃度AME、AOH存在下HSA的熒光發(fā)射光譜Fig.1 Fluorescence emission spectra of human serum albumins in the absence and presence of increasing concentrations of toxins

由表1可知，隨著溫度的升高，AME-HSA和AOH-HSA體系的猝滅常數(shù)(quenching constant，Ksv)值和結(jié)合常數(shù)(association constant,Ka)值及猝滅速率常數(shù)(quenching rate constant,kq)均呈下降趨勢(shì)，體系的猝滅速率常數(shù)Kq均遠(yuǎn)大于生物分子的最大擴(kuò)散速率常數(shù)(2×1010L·mol-1·S-1)[25]。表明AME、AOH與HSA發(fā)生了靜態(tài)猝滅(動(dòng)態(tài)熒光猝滅是由體系中分子碰撞造成，表現(xiàn)為Ksv隨溫度的升高而升高)，并形成了復(fù)合物。除AOH-HSA在25℃結(jié)合下的KsvKa。表明AME與HSA具有更強(qiáng)的親和力，導(dǎo)致AME在體內(nèi)具有較強(qiáng)的毒性作用，這可能是由于AME極性較低，通過(guò)疏水相互作用與蛋白質(zhì)疏水性空腔產(chǎn)生更強(qiáng)的結(jié)合能力。

表 1 不同溫度下AME/AOH-HSA相互作用的猝滅常數(shù)Table 1 The quenching constants for serum albumins and toxins interaction at different temperatures

2.2 AME和AOH與血清白蛋白互作的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合距離

由圖2和表2可知，在所研究的溫度(25、31、37℃)下，兩種毒素與HSA可形成1∶1復(fù)合物，且隨著溫度的升高，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)逐漸降低，說(shuō)明兩者結(jié)合程度逐漸降低。AME(r1=2.56 nm)和AOH(r2=2.60 nm)結(jié)合距離r<8 nm，且滿足r1

圖2 AME和AOH的紫外光譜與HSA熒光光譜的重疊圖Fig.2 The overlap of the UV absorption spectrum of toxins with the fluorescence emission spectrum of human serum albumins

表 2 AME和AOH-HSA相互作用的能量轉(zhuǎn)移參數(shù)及不同溫度下的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Table 2 Energy transfer parameters and the number of binding sites for for serum albumins and toxins interaction at different temperatures

2.3 AME和AOH與HSA互作結(jié)合過(guò)程中的作用力

由表3可知，所有相互作用體系中的ΔG均小于0，表明結(jié)合反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的；ΔH<0，ΔS<0，表明兩種毒素與HSA的結(jié)合作用力主要為氫鍵和范德華力。隨著溫度升高，AME和AOH與HSA相互作用的ΔG逐漸降低，氫鍵和范德華力削弱[27]。

表3 不同溫度下AME和AOH與HSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters for HSA and AME and AOH interaction at different temperatures

2.4 AME/AOH對(duì)HSA上結(jié)合位置微環(huán)境的影響

由表4和圖3可知，AME、AOH的加入可與HSA形成復(fù)合物，表現(xiàn)為峰1(瑞利散射峰：λex=λem)和峰2(Trp、Tyr和Phe的重疊熒光峰)熒光強(qiáng)度下降。而兩者的加入并未使Tyr殘基最大發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移，圖4-B、D顯示Trp殘基發(fā)生了藍(lán)移(AME藍(lán)移1 nm，AOH藍(lán)移1.4 nm)，表示AME和AOH可使Trp殘基微環(huán)境疏水性增加，極性降低，說(shuō)明兩者與HSA的結(jié)合位置更靠近Trp殘基，并推測(cè)可能位于結(jié)合位點(diǎn)I(亞結(jié)構(gòu)域IIA)的空腔中，可針對(duì)該結(jié)合位點(diǎn)研究AME、AOH的毒性干預(yù)措施。

2.5 AME/AOH對(duì)血清白蛋白結(jié)構(gòu)的影響

由圖4可知，隨著AME和AOH的加入，HSA的CD光譜峰形位置未發(fā)生明顯變化，表明HSA仍然以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主；與HSA∶AME=1∶0相比，在208 nm和222 nm處的峰強(qiáng)度逐漸增大，表明AME、AOH與HSA的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，使α-螺旋含量從48.93%分別減少至39.41%和44.01%，同時(shí)AME、AOH的加入會(huì)使HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在相同濃度下，AME可更大程度地改變HSA結(jié)構(gòu)。

表4 HSA和AME/AOH相互作用前后的3D熒光特征參數(shù)Table 4 Three-dimensional fluorescence spectral characteristics for serum albumins and toxins interaction

圖3 不同濃度的AME和AOH存在下HSA的同步熒光光譜Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of human serum albumins in the absence and presence of increasing concentrations of AME and AOH

注：A：HSA-AME；B：HSA-AOH；HSA濃度：10 μmol·L-1；AME和AOH濃度：0、10、50 μmol·L-1。Note: A: HSA-AME. B: HSA-AOH. The concentration of HSA: 10 μmol·L-1. The concentrationof AME and AOH: 0,10,50 μmol·L-1.圖4 不同比例AME和AOH存在下HSA的圓二色光譜Fig.4 CD spectra of human serum albumins in the absence of toxins

3 討論

鏈格孢霉毒素是一種廣泛存在于農(nóng)產(chǎn)品及其相關(guān)制品中的一類毒素，研究其與人血清白蛋白的結(jié)合方式及結(jié)合位點(diǎn)，可以進(jìn)一步了解該毒素在體內(nèi)的代謝作用。本研究發(fā)現(xiàn)，AME/AOH與HSA之間會(huì)發(fā)生相互作用，并形成一種1∶1復(fù)合物，表明毒素在進(jìn)入體內(nèi)后有與人體內(nèi)血清白蛋白結(jié)合的可能，并隨著血液轉(zhuǎn)運(yùn)到身體的其他器官、組織中，發(fā)揮毒性作用。本研究還發(fā)現(xiàn)兩種毒素與HSA在色氨酸殘基附近結(jié)合，位于結(jié)合位點(diǎn)I(亞結(jié)構(gòu)域IIA)的空腔中，對(duì)其結(jié)合位置的確定可為鏈格孢霉毒素減毒技術(shù)的研究提供參考。此外，對(duì)比發(fā)現(xiàn)AME與HSA之間有更強(qiáng)的結(jié)合力，反映出AME可能在體內(nèi)有更長(zhǎng)的半衰期并發(fā)揮持續(xù)毒性作用，比AOH更易轉(zhuǎn)運(yùn)到機(jī)體各處。Ma等[28]和Li等[29]分別利用玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)與血清白蛋白[牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和HSA]發(fā)生互作，發(fā)現(xiàn)兩種毒素均通過(guò)靜態(tài)機(jī)制猝滅血清白蛋白熒光，并通過(guò)疏水作用力和靜電相互作用發(fā)生互作，且會(huì)改變血清白蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這與本研究中AOH和AME可改變HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果相似。這些研究表明，不同真菌毒素與血清白蛋白之間會(huì)發(fā)生不同的交互作用，有利于深層次探索真菌毒素毒性，但鏈格孢霉毒素的具體結(jié)合位置、結(jié)合方式及體內(nèi)毒性還需進(jìn)一步深入研究。

目前鏈格孢霉毒素在農(nóng)作物及其制品中的限量標(biāo)準(zhǔn)尚不完善。本研究明確了二苯-α-吡喃酮類鏈格孢霉毒素與HSA之間的互作過(guò)程及機(jī)理，有利于進(jìn)一步了解該類毒素進(jìn)入體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等毒動(dòng)力過(guò)程，補(bǔ)充和完善鏈格孢霉毒素相關(guān)毒理學(xué)資料，并為該類毒素在農(nóng)作物及糧食制品中限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)，對(duì)有效防治該類毒素在農(nóng)業(yè)中的污染，減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)利用穩(wěn)態(tài)熒光光譜、3D熒光光譜、同步熒光光譜以及圓二色光譜等方法研究AME和AOH與HSA的相互作用，結(jié)果表明，AME和AOH通過(guò)靜態(tài)猝滅與HSA發(fā)生相互作用，以氫鍵和范德華力作用形成1∶1復(fù)合物，且兩種毒素的結(jié)合會(huì)使HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)以及色氨酸殘基微環(huán)境改變，結(jié)合位點(diǎn)更可能位于色氨酸殘基所在的空腔(HSA亞結(jié)構(gòu)域IIA 結(jié)合位點(diǎn)I)；其中AME對(duì)HSA的猝滅程度更大，結(jié)合距離也更近，AME與HSA之間表現(xiàn)出更強(qiáng)的親和力，表明其在體內(nèi)可能會(huì)有更長(zhǎng)的毒性作用時(shí)間。