許超麗 劉 霄 任維賓 杜 艷 王圓夢 李 燕 司懷軍 周利斌,3,*

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2 中國科學(xué)院近代物理研究所生物物理室，甘肅 蘭州 730030；3 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；5 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)西南作物基因資源發(fā)掘與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

水稻(Oryzasativa)作為世界上最主要的糧食作物之一[1]，其新品種的選育與創(chuàng)新對世界糧食安全有著重要意義。隨著輻射技術(shù)在水稻育種中的廣泛應(yīng)用，對其誘變機(jī)理的研究也日漸增多。物理誘變育種常用的電離輻射包括X射線、γ射線、快中子及重離子束等[2]。電離輻射能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，包括刺激效應(yīng)、生理損傷以及遺傳突變等[3]。然而，目前在輻射機(jī)理、突變篩選及相關(guān)分子機(jī)制等方面的基礎(chǔ)研究報(bào)道相對較少，因此對不同類型輻射誘變機(jī)理的研究能夠更好地了解輻射對植物造成的當(dāng)代生理損傷及后代遺傳突變情況。同時(shí)，加強(qiáng)輻射品質(zhì)與誘變分子機(jī)理的研究可以為水稻高效誘變育種提供一定的理論基礎(chǔ)。

高能重離子束輻射被認(rèn)為是一種高效的物理誘變技術(shù)[4]。重離子束在水稻育種中的實(shí)用性及有效性是由于其具有傳能線密度(linear energy transfer，LET)大和相對生物學(xué)效應(yīng)(relative biological effectiveness，RBE)高等物理學(xué)及生物學(xué)特征[5]，在育種過程表現(xiàn)出突變率高[6]、突變譜廣[7]和育種周期相對較短等特點(diǎn)[8]。重離子束輻射對水稻生長發(fā)育的影響已有報(bào)道。王佳琪等[9]研究表明，碳離子束輻射不同粳稻干種子后，其發(fā)芽率和存活率存在差異，即不同品種粳稻的輻射敏感性不同；Xu等[10]利用不同能量的重離子輻射3個(gè)品種的水稻干種子，發(fā)現(xiàn)低能氮離子和中能碳離子束輻射對發(fā)芽率、存活率、苗高等當(dāng)代生物學(xué)指標(biāo)的影響不同。X射線是一種低LET輻射，通常由電子加速器加速的電子撞擊金屬靶產(chǎn)生，具有操作簡便、使用成本較低、無需使用放射源等特點(diǎn)[11]，在誘變育種中也有廣泛應(yīng)用。高能重離子束屬帶電粒子輻射，X射線屬電磁波，兩者與物質(zhì)相互作用的原理不同，輻射誘導(dǎo)的植物生理生化變化及遺傳突變也各不相同。已有研究表明，在植物誘變育種操作中，X射線單位劑量的誘變效率較重離子束低約10倍[12]。

植物經(jīng)電離輻射處理后，其生理生化改變及分子響應(yīng)過程較為復(fù)雜，研究植物經(jīng)輻射處理后的形態(tài)學(xué)及生理學(xué)改變，能夠更好地了解農(nóng)作物對不同類型電離輻射的響應(yīng)機(jī)制。前人研究多關(guān)注于輻射干種子對植物生長的影響，Zhang等[13]將粳稻和秈稻種子進(jìn)行γ輻射，發(fā)現(xiàn)秈稻比粳稻更耐受輻射。關(guān)于重離子束輻射植物幼苗的誘變效應(yīng)研究，Hase等[14]對擬南芥種子和幼苗分別進(jìn)行碳離子束輻射，發(fā)現(xiàn)干種子的突變率是幼苗的1.4～1.9倍。對水稻幼苗進(jìn)行輻射處理所產(chǎn)生的當(dāng)代損傷效應(yīng)的研究較少，關(guān)于高能碳離子束和X射線兩種不同類型電離輻射對水稻幼苗生理損傷的比較研究更是鮮有報(bào)道。因此，本研究以水稻幼苗為起始材料，以高能碳離子束進(jìn)行誘變處理，以低LET輻射的代表X射線處理為誘變參照，研究不同類型電離輻射處理對水稻生長、發(fā)育以及生理損傷的影響，以期為不同類型電離輻射誘變水稻時(shí)，輻射劑量及樣品初始狀態(tài)的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

粳稻(OryzasativasspJaponica)Kitaake是日本特早熟品種，也是水稻研究的模式物種，從播種至開花平均僅需52個(gè)生育日。本研究中水稻材料源自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)西南作物基因資源發(fā)掘與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 樣品制備

試驗(yàn)于2021年4月進(jìn)行，選取無病害、飽滿度一致且同一批次的Kitaake水稻種子進(jìn)行萌發(fā)，將水稻干種子置于濃度為3%的過氧化氫溶液中，消毒30 min后用去離子水沖洗3～5次，然后置于含濕潤濾紙直徑90 mm圓形培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)5 d，其中1～4 d置于無光照恒溫培養(yǎng)箱(32℃)中萌發(fā)，后移至光照培養(yǎng)間(溫度為28～30℃，光周期光/暗為14/10 h，光強(qiáng)為250 μmol·m-2·s-1)中生長1 d。選取萌發(fā)一致的幼苗置于有濕潤濾紙的35 mm圓形培養(yǎng)皿中，室溫下進(jìn)行輻射處理。

1.3 輻射處理

對5日齡幼苗進(jìn)行輻射處理，高能12C6+束流由中國科學(xué)院近代物理研究所蘭州重離子研究裝置(Heavy Ion Research Facility in Lanzhou，HIRFL)提供，能量為80.55 MeV·u-1，LET為34 keV·μm-1，劑量率約為60 Gy·min-1，輻射劑量分別為5、10、15、20、25、30、40 Gy。X射線輻射處理采用X-RAD255 X射線輻照儀(Precision X-Ray，美國)進(jìn)行，劑量率約為6.5 Gy·min-1，輻射劑量分別為10、20、30、40、50、60、80 Gy。對照置于與處理組相同的環(huán)境條件下但不進(jìn)行輻射處理。

1.4 輻射后培養(yǎng)

輻射后將幼苗立即轉(zhuǎn)移至水培盒中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：純水培養(yǎng)2 d，1/4×營養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，1/2×營養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，1×營養(yǎng)液(Coolaber營養(yǎng)液：1 000×硅酸鈉，1 000×大量元素微量元素混合液，1 000×鐵鹽，1 000×鈣鹽)進(jìn)行培養(yǎng)，水培盒置于光照培養(yǎng)間中。40 d后隨機(jī)選取部分植株進(jìn)行插秧種植，種植于直徑為20 cm花盆中，每盆3株。

1.5 測定指標(biāo)與方法

1.5.1 營養(yǎng)生長時(shí)期形態(tài)指標(biāo)的測定 對輻射處理后6 d的植株進(jìn)行根長和芽長測定。根長為從根尖到幼苗底部的距離，芽長為幼苗底部到芽尖的距離，相對根長=處理組平均根長÷對照平均根長×100%。每組處理選取20～30棵幼苗進(jìn)行數(shù)碼拍照并使用Image J軟件測量長度。

1.5.2 生殖發(fā)育時(shí)期形態(tài)指標(biāo)的測定 在植株成熟后，對植株株高、分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率以及千粒重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。株高：從根部到植株頂端最長葉的長度；分蘗數(shù)：從水稻基部數(shù)水稻分蘗個(gè)數(shù)；結(jié)實(shí)率：每株選取10穗，結(jié)實(shí)率=實(shí)粒數(shù)/總粒數(shù)×100%；千粒重：用于統(tǒng)計(jì)育性的所有種子的重量，并換算為千粒重。每組均測定6株單株。

1.5.3 光合作用指標(biāo)的測定 輻射后第30天對植株進(jìn)行葉綠素含量測定，3株水稻混合取樣，取樣部位為新鮮水稻嫩葉距葉尖3～8 cm處。用乙醇提取法[15]測定葉片葉綠素含量。根據(jù)公式計(jì)算葉片單位鮮重的葉綠素a(chlorophyll a，Chla)、葉綠素b(chlorophyll b，Chlb)和總?cè)~綠素(total chlorophyll)含量。輻射后第30天，對植株進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)測定，使用3～4 株水稻葉片混合測定，先將水稻暗適應(yīng)20 min，選取植株第一、第二葉的距葉尖5～10 cm部位進(jìn)行活體檢測，用DUAL-PAM-100型葉綠素?zé)晒鈨x(Walz，德國)在黑暗的環(huán)境中檢測，并記錄光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大光化學(xué)量子產(chǎn)量值(maximum photochemical efficiency,Fv/Fm)以及有效光化學(xué)量子產(chǎn)量值[actual photochemical efficiency，Y(Ⅱ)]。

1.5.4 抗氧化酶活性指標(biāo)的測定 輻射后6、24、72 h對20 Gy高能碳離子束及40 Gy X射線處理組幼苗地上部分和根分別取樣，未輻射組為對照，稱量鮮重后液氮快速冷凍，并置于-80℃冷凍保存，用于后續(xù)抗氧化系統(tǒng)的分析?？寡趸富钚詼y定：過氧化物酶(peroxidase，POD)活性，采用愈創(chuàng)木酚法在470 nm波長下檢測吸光值；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，采用氮藍(lán)四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)光化學(xué)還原法在560 nm波長下檢測吸光值；過氧化氫酶(catalase，CAT)活性，采用過氧化氫分解法在240 nm波長下檢測光密度[16]。

1.5.5 遺傳物質(zhì)多態(tài)性分析 水稻抽穗后，取主穗旗葉進(jìn)行遺傳物質(zhì)多態(tài)性的分析，以對照組單株水稻的基因組DNA為材料，使用CTAB法[17]提取主穗旗葉的DNA，并于-20℃條件下保存?zhèn)溆?。利用簡單重?fù)間序列(inter-simple sequence repeat，ISSR)進(jìn)行DNA多態(tài)性檢測，共選用UBC系列引物29條(引物來源：University of British Columbia)進(jìn)行條帶擴(kuò)增；檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，選取擴(kuò)增條帶數(shù)多、穩(wěn)定和條帶清晰的引物用于后續(xù)研究，PCR擴(kuò)增后，使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，設(shè)置電壓為110 V，時(shí)間為40 min，電泳完成后使用紫外凝膠系統(tǒng)成像，并進(jìn)行多態(tài)性條帶統(tǒng)計(jì)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。差異顯著性分析使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差(One-way ANOVA)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，采用Duncan’s test；兩組均值比較采用Student t-test檢驗(yàn)。使用Origin軟件、Excel 2016軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高能碳離子束和X射線輻射對水稻幼苗生長發(fā)育的影響

由圖1可知，兩種輻射根長和苗高都隨輻射劑量的增加，整體呈現(xiàn)降低趨勢。對于高能碳離子束輻射處理組，根長在輻射劑量為15 Gy時(shí)比對照顯著降低25.42%(圖1-A)；而對于苗高，輻射劑量為5 Gy時(shí)與對照相比顯著降低(圖1-B)，表明地上部分對輻射的響應(yīng)較根部更為敏感。對于X射線輻射組，根長在輻射劑量為20 Gy時(shí)與對照相比顯著降低21.02%；苗高在輻射劑量為10 Gy時(shí)與對照相比顯著增加7.38%(圖1-C)，這可能與低劑量輻射對植株的刺激效應(yīng)有關(guān)[18]；然而輻射劑量到20 Gy后一直呈降低趨勢(圖1-D)。

水稻植株的生長需要完整、強(qiáng)大的根系來吸收水分和無機(jī)鹽，從而為植株積累養(yǎng)分，以供植株正常的生長發(fā)育。據(jù)圖1計(jì)算可知，在高能碳離子束輻射劑量為20 Gy、X射線輻射劑量為40 Gy時(shí)，植株的相對根長最為接近，分別為69.54%和 68.53%。這兩個(gè)劑量處理下水稻根部未完全受損，幼苗可以生長，并且與對照相比其根長又顯著降低，因此選擇這兩個(gè)劑量進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 高能碳離子束和X射線輻射對水稻主要農(nóng)藝性狀的影響

2.2.1 高能碳離子束和X射線輻射對水稻株高、分蘗數(shù)的影響 由于40 Gy高能碳離子束和80 Gy X射線輻射處理，使得水稻幼苗受到嚴(yán)重?fù)p傷而生長停滯，故無法進(jìn)行主要農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計(jì)分析。由圖2可知，兩種不同類型的電離輻射處理對成熟后水稻的株高影響不大，僅發(fā)現(xiàn)15 Gy高能碳離子束輻射處理組株高較對照略有增加且差異顯著，其余各劑量的處理組與對照組相比均無顯著性差異(圖2-A)；所有X射線輻射處理組與對照組的株高均無顯著性差異(圖2-C)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)輻射處理水稻幼苗后，其成熟期植株的各處理組間分蘗數(shù)差異較大。總體來看，在高能碳離子束輻射組中，不同劑量處理組之間的水稻分蘗數(shù)較對照無顯著性差異(圖2-B)；而在X射線輻射組中，與對照相比，輻射劑量為50、60 Gy時(shí)，分蘗數(shù)顯著和極顯著增加(圖2-D)?？芍赬射線輻射處理下，較高的劑量對水稻植株分蘗能力造成了影響。

2.2.2 高能碳離子束和X射線輻射對水稻結(jié)實(shí)率、千粒重的影響 高能碳離子束和X射線輻射水稻幼苗的結(jié)實(shí)率、千粒重從整體上與對照相比呈下降趨勢。由表1可知，高能碳離子束輻射劑量為5、10 Gy時(shí)，結(jié)實(shí)率及千粒重與對照相比無顯著差異，15 Gy時(shí)出現(xiàn)顯著降低，由于輻射處理組各單株有較大差異，導(dǎo)致出現(xiàn)特例，在輻射劑量為20 Gy時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著。由表2可知，輻射的水稻幼苗經(jīng)10、20、30 Gy X射線處理后，其結(jié)實(shí)率及千粒重與對照相比均無顯著差異，在輻射劑量達(dá)到40 Gy后出現(xiàn)下降，且差異極顯著，40 Gy X射線處理組的結(jié)實(shí)率不足對照組的50%。50、60 Gy的X射線輻射對水稻的生殖發(fā)育造成了嚴(yán)重的影響，造成M1植株的不育，無法產(chǎn)生后代。

2.3 高能碳離子束和X射線輻射對水稻葉片光合作用的影響

2.3.1 高能碳離子束和X射線輻射對水稻葉片葉綠素含量的影響 由圖3可知，20 Gy高能碳離子束處理下，水稻葉片中Chla、Chlb和總?cè)~綠素的含量與對照相比均無顯著差異；在40 Gy X射線處理下，葉片中Chla、Chlb和總?cè)~綠素的含量較對照均極顯著提高。表明在根長抑制相似的情況下，經(jīng)X射線輻射的水稻幼苗在處理后第30天，葉片中光合色素積累多，植株的光合作用能力強(qiáng)。

注： 不同小寫字母表示不同輻射劑量之間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant differences among different irradiation does at 0.05 level.圖1 高能碳離子束(A、B)和X射線(C、D)輻射對水稻幼苗根長和苗高的影響Fig.1 Effects of high-energy carbon ion beam(A、B) and X-rays(C、D) radiations on the root length and seedling height of rice

注：*表示與對照相比差異顯著(P<0.05)；**表示與對照相比差異極顯著(P<0.01)。下同。Note:* means significant difference between treatments and control at 0.05 level. ** means extremely significant difference between treatments and control at 0.01 level. The same as following.圖2 高能碳離子束(A、B)和X射線(C、D)輻射對水稻株高及分蘗數(shù)的影響Fig.2 Effect of high-energy carbon ion beam(A、B) and X-ray(C、D) radiations on rice plant height and number of tillers

表1 高能碳離子束輻射對水稻結(jié)實(shí)率、千粒重的影響Table 1 Effects of high-energy carbon ion beam radiation on rice fertility and thousand-grain weight

表2 X射線輻射對水稻育性、千粒重的影響Table 2 Effect of X-ray radiation on rice fertility and thousand-grain weight

注：NS表示對照與輻射處理間無顯著差異；**表示對照與輻射處理間差異極顯著(P<0.01)。C-Control表示高能碳離子束處理組的對照，C-20 Gy表示高能碳離子束輻射處理劑量為20 Gy；X-Control表示X射線處理組的對照；X-40 Gy表示X射線輻射處理劑量為40 Gy。Note: NS means no significant difference among Control and irradiation treatments. ** means significant difference at 0.01 level among Control and irradiation treatments. C-Control represents the control of the high-energy carbon ion beam treatment group. C-20 Gy represents the high-energy carbon ion beam radiation treatment dose of 20 Gy. X-Control represents the control of the X-ray treatment group. X-40 Gy represents the X-ray radiation treatment dose of 40 Gy. 圖3 高能碳離子束和X射線輻射對水稻葉片綠素含量的影響Fig.3 Effect of high-energy carbon ion beam and X-ray radiation on the chlorophyll content of rice leaves

2.3.2 高能碳離子束和X射線輻射對水稻葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響 由表3可知，40 Gy X射線處理組Fv/Fm值較對照顯著降低，20 Gy高能碳離子束則無顯著變化，表明水稻葉片PSⅡ最大光能利用能力與所受的輻射類型相關(guān)。

2.4 高能碳離子束和X射線輻射對水稻幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響

由圖4可知，經(jīng)高能碳離子束輻射后，水稻幼苗地上部分抗氧化酶活性整體高于根系，根系SOD活性在輻射處理后6、24、72 h出現(xiàn)先上升后下降再上升的波動(dòng)，地上部分SOD活性僅在輻射處理后72 h出現(xiàn)顯著上升(圖4-A)。POD活性無論是根系還是地上部分都隨著輻射后時(shí)間延長呈上升趨勢(圖4-C)。根系CAT活性在輻射后6 h出現(xiàn)一個(gè)峰值；而在芽中，CAT活性在輻射后24 h出現(xiàn)顯著降低，到72 h時(shí)又升高(圖4-E)。

表3 高能碳離子束和X射線輻射的水稻葉片綠素?zé)晒馓卣鞅容^Table 3 Comparison of chlorophyll fluorescence characteristics of rice leaves irradiated by high-energy carbon ion beam and X-ray

經(jīng)X射線輻射處理水稻幼苗，根系SOD活性在處理后24 h出現(xiàn)峰值，到72 h時(shí)活性又下降至與對照無顯著差異；而地上部分SOD活性在處理后6、24、72 h與對照相比均無顯著差異(圖4-B)。根系的POD活性在處理后24 h出現(xiàn)峰值，到72 h時(shí)活性又下降；而地上部分的POD活性隨著處理后時(shí)間延長呈逐漸上升趨勢，并且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)與前一時(shí)間點(diǎn)相比酶活性均顯著提升(圖4-D)。根和芽CAT活性變化趨勢大致相同，均表現(xiàn)為在輻射后6、24 h與對照相比無顯著差異，在72 h時(shí)活性顯著下降(圖4-F)。

2.5 碳離子束和X射線輻射對水稻旗葉遺傳物質(zhì)多態(tài)性的影響

本研究共使用了UBC系列的29條引物，其中10條引物被用于數(shù)據(jù)分析。由表4可知，在高能碳離子束輻射下，10條引物共擴(kuò)增出95條條帶，平均每條引物擴(kuò)增出9.5條條帶，其中25條為多態(tài)性條帶，占擴(kuò)增條帶總數(shù)的29.31%，其中UBC840產(chǎn)生的多態(tài)條帶百分比最高(83.3%)，UBC887和UBC889引物未產(chǎn)生多態(tài)條帶。由表5可知，在X射線輻射下，10條ISSR引物共擴(kuò)增出了92條條帶，平均每條引物擴(kuò)增出9.2條條帶，其中33條為多態(tài)性條帶，占擴(kuò)增條帶總數(shù)的37.76%，其中UBC890產(chǎn)生的多態(tài)條帶百分比最高(62.50%)，UBC886和UBC889引物產(chǎn)生多態(tài)條帶百分比最低(20.00%)。表明高能碳離子束輻射和X射線輻射均影響了水稻旗葉的遺傳物質(zhì)多態(tài)性，其中經(jīng)過X射線輻射處理的多態(tài)率較高。

表4 高能碳離子束輻射水稻幼苗ISSR多態(tài)率分析Table 4 Analysis of ISSR polymorphism rate of rice seedling irradiated by high-energy carbon ion beam

表5 X射線輻射水稻幼苗ISSR多態(tài)率分析Table 5 Analysis of ISSR polymorphism rate of rice seedlings irradiated by X-ray

注：不同小寫字母表示根部差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示地上部分差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant differences in the roots,and different uppercase letters indicate significant differences in the shoot (P<0.05).圖4 高能碳離子束(A、C、E)和X射線(B、D、F)輻射對水稻幼苗SOD、POD、CAT活性的影響Fig.4 Effects of high-energy carbon ion beam(A、C、E) and X-ray(B、D、F) radiation on SOD,POD and CAT activity of rice seedlings

3 討論

輻射作為一種有效的物理誘變手段，能夠影響植物生長發(fā)育、造成損傷并產(chǎn)生突變。前人研究表明，相比于X射線、γ射線等低LET電離輻射，重離子束輻射植物具有對M1代的生理損傷輕的特點(diǎn)[19]。梅曼彤等[20]研究表明，高LET重離子能更有效地抑制水稻種子萌發(fā)、幼苗生長，降低當(dāng)代植株的結(jié)實(shí)率，程維民等[21]和楊瑰麗等[22]也證實(shí)了這一點(diǎn)。已有研究表明，與γ射線相比，重離子束輻射對水稻干種子的致死率及突變率有所不同[23]。本研究使用兩種不同類型的輻射處理水稻幼苗，對當(dāng)代損傷效應(yīng)進(jìn)行研究，結(jié)果表明兩種輻射處理在較短時(shí)期內(nèi)抑制了幼苗的生長，不論是經(jīng)高能碳離子束還是X射線輻射處理，隨輻射劑量的增加，水稻的根長和苗高整體呈現(xiàn)降低趨勢。此外，研究還發(fā)現(xiàn)水稻幼苗存在低劑量輻射的刺激效應(yīng)。由于兩種輻射在植物體內(nèi)能量沉積的方式不同，即LET不同，在造成相同損傷的情況下，對應(yīng)的輻射劑量不同，表明輻射處理后在根長抑制相似的情況下，X射線的輻射劑量(40 Gy)大約是高能碳離子束輻射劑量(20 Gy)的2倍，即高能碳離子束對水稻幼苗根長抑制的RBE約為2[24]。

前人研究指出，水稻干種子經(jīng)輻射處理后，株高會(huì)隨著劑量的增加而下降[25]。而本研究中，輻射劑量的增加并未顯著影響存活植株的株高，表明在一定劑量范圍內(nèi)，水稻幼苗經(jīng)輻射處理后，存活植株的營養(yǎng)生長未受到輻射太大的影響，在表型上無顯著變化，Xu等[10]在碳離子束輻射水稻干種子研究中發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。此外，在本研究中，在較高劑量的X射線輻射下，存活植株的分蘗能力、結(jié)實(shí)率及千粒重都受到了極大的影響，表現(xiàn)為水稻分蘗數(shù)顯著增加，結(jié)實(shí)率及千粒重顯著降低，這與劉寶海等[26]的研究結(jié)果類似。推測是控制分蘗的基因受到的損傷在生長過程中無法完全自我修復(fù)或產(chǎn)生了生殖生長紊亂，導(dǎo)致水稻無效分蘗數(shù)增加，不斷消耗養(yǎng)分，影響有效分蘗的生長，進(jìn)而使水稻產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響并造成M1植物育性下降甚至不育。

光合作用是植物特有的生理功能，其中葉綠素的生物合成受到多種因素的影響[27]。本研究中，40 Gy X射線輻射處理水稻幼苗后，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)，葉綠素含量顯著提高，說明40 Gy輻射在一定時(shí)間內(nèi)提高了水稻光合作用。在20 Gy高能重離子束輻射處理水稻幼苗后，其葉綠素含量相比對照并未出現(xiàn)顯著性差異。健康植物葉片的Fv/Fm值在0.80～0.85之間波動(dòng)，X射線處理組的Fv/Fm值較對照雖有顯著降低，但仍在正常值的范圍內(nèi)，說明植株健康。Y(Ⅱ)值可作為評價(jià)植物脅迫程度的指標(biāo)[28]。本研究表明，在兩種輻射處理中Y(Ⅱ)值都未出現(xiàn)顯著變化，說明在輻射后第30天水稻植株可正常生長。

植物體內(nèi)存在不同類型的抗氧化酶，抗氧化酶活性可以反映植物的抗氧化能力[29]。本研究中，水稻幼苗地上部分與地下部分抗氧化酶活性變化有很大差異，其中地上部分SOD活性在高能碳離子束輻射后72 h時(shí)顯著提高，可能是因?yàn)镾OD的合成通路被激活，在輻射處理后72 h時(shí)提高了SOD的表達(dá)量。地上部分POD活性隨著輻射后時(shí)間的延長顯著提高，植物抗氧化酶活性的提高可緩解脅迫帶來的膜過氧化損傷[30]。植物體內(nèi)過氧化物酶與光合作用、呼吸作用等代謝密切相關(guān)，能清除體內(nèi)的H2O2，維持活性氧代謝平衡[31]、保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，從而在一定程度上緩解或抵御逆境脅迫。水稻幼苗經(jīng)兩種不同輻射處理后，3種抗氧化酶活性的變化趨勢不盡相同，但在抗氧化酶系統(tǒng)的共同作用下，能夠有效清除ROS的產(chǎn)生，將水稻體內(nèi)的自由基維持在正常水平。

ISSR作為一種有效的基因指紋技術(shù)，對確定水稻品種間遺傳變異和品種快速鑒定有較大價(jià)值[32]。本研究表明，高能碳離子束和X射線輻射均能誘發(fā)水稻M1植株遺傳物質(zhì)多態(tài)性的變化。其中，X射線輻射引起的水稻當(dāng)代基因組DNA的平均遺傳多態(tài)性高于碳離子束輻射，認(rèn)為這與X射線輻射對M1代造成的損傷更為嚴(yán)重有關(guān)。馮慧[33]研究表明，經(jīng)碳離子束輻射獲得的M1和M3代擬南芥基因組DNA的平均多態(tài)率均高于γ射線，這與本研究中高能碳離子束輻射水稻幼苗M1代遺傳多態(tài)性較低結(jié)果相反，這與誘變操作選取的物種及樣品的起始狀態(tài)均相關(guān)。在植物的誘變育種操作中，多數(shù)采用種子。種子是由多細(xì)胞構(gòu)成，在受輻射處理后，多數(shù)情況下僅是個(gè)別細(xì)胞發(fā)生突變，因此，存活的植株是由帶突變基因的細(xì)胞和未突變基因的細(xì)胞所組成[34]。本研究以水稻幼苗為材料進(jìn)行輻射誘變操作，其構(gòu)成的植株以及后代是否存在突變嵌合現(xiàn)象還需要進(jìn)一步研究。此外，了解不同電離輻射對水稻植株所產(chǎn)生的當(dāng)代生物學(xué)效應(yīng)，開展輻射誘變機(jī)理研究，可為水稻種質(zhì)創(chuàng)新提供更佳翔實(shí)的數(shù)據(jù)積累。未來將從多角度出發(fā)，進(jìn)一步對水稻不同生長時(shí)期及更多農(nóng)藝學(xué)性狀展開研究，從而為育種工作者提供更加高效、更加多樣化的誘變技術(shù)方法。

4 結(jié)論

植物對電離輻射的響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，不僅與輻射的類型、劑量有關(guān)，也與樣品所處的生理狀態(tài)相關(guān)。本研究結(jié)果表明高能重離子束和X射線輻射處理水稻Kitaake幼苗后，在具有相同生物學(xué)效應(yīng)下，植物對兩種類型電離輻射所產(chǎn)生的生理響應(yīng)不同。在較短時(shí)間內(nèi)，兩種輻射對幼苗的根及芽的抗氧化系統(tǒng)存在顯著影響。高能重離子束輻射對水稻的葉綠素含量和Fv/Fm值均無顯著影響；X射線輻射可增加水稻的葉綠素含量，降低Fv/Fm值。20 Gy高能碳離子束輻射組水稻幼苗ISSR多態(tài)率為29.31%，40 Gy X射線輻射處理水稻幼苗ISSR多態(tài)率為37.76%?？傮w而言，高能碳離子束輻射水稻幼苗所產(chǎn)生的當(dāng)代損傷效應(yīng)低于X射線處理，推薦的誘變劑量區(qū)間為：高能碳離子束20～30 Gy，X射線30～40 Gy。