周坤能 張彩娟, 夏加發(fā) 王元壘 云 鵬 馬廷臣 吳德祥 李澤福,*

(1 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/安徽省水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031；2 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，安徽 合肥 230036)

稻瘟病是水稻主要病害之一，每年發(fā)生嚴(yán)重，導(dǎo)致水稻減產(chǎn)，甚至絕收[1-2]。目前能夠有效防治稻瘟病的方法有兩種：化學(xué)防治和抗病品種選育[3-4]。在種植稻瘟病抗性較好的品種基礎(chǔ)上，結(jié)合化學(xué)防治方法，可以有效降低稻瘟病危害；選擇稻瘟病抗性好的水稻品種可以減少化學(xué)藥劑的使用，減少農(nóng)藥污染，與水稻產(chǎn)業(yè)的綠色高質(zhì)量發(fā)展相輔相成。因此，選育抗稻瘟病水稻品種具有重要意義，發(fā)掘和利用稻瘟病抗性基因和資源更是相關(guān)研究的前提[5-7]。

目前已經(jīng)在水稻中鑒定出100多個稻瘟病抗性基因位點(diǎn)，其中35個基因被克隆[8]。這些基因之間的抗病性存在較大差異，且部分基因在水稻資源中出現(xiàn)頻率低，育種利用效率低[9-11]；一些廣譜持久抗稻瘟病及適宜特定生態(tài)區(qū)的基因已被廣泛用于育種實(shí)踐[12-14]。不同種植區(qū)域水稻中蘊(yùn)含的稻瘟病抗性基因不同，其中Pikh、Pi9和Pish對廣東稻瘟病菌表現(xiàn)廣譜抗性[15]；Pita、Pib、Pi54和Pikm對江蘇稻瘟病菌表現(xiàn)廣譜抗性[16]；Pib、Pi54和Pikm對山東和黃淮區(qū)稻瘟病菌表現(xiàn)廣譜抗性[17]。通過分子標(biāo)記輔助聚合抗性基因?qū)λ镜疚敛】剐杂N具有重要指導(dǎo)意義。前人研究發(fā)現(xiàn)，通過分子聚合Pi9和Pi49位點(diǎn)能夠提高水稻兩系不育系創(chuàng)5S的稻瘟病抗性[18]；通過分子標(biāo)記分別將Pi1、Pi2、Pi33、Pigm等基因轉(zhuǎn)入空育131等粳稻品種中，能夠顯著提高受體材料的稻瘟病抗性[19-20]；將廣譜抗稻瘟病基因Pi9導(dǎo)入水稻不育系豐源A中，其抗性頻率增加2.5倍以上[21]。近期研究表明，Pita、Pib、Pi5和Pi9基因?qū)|寧和天津地區(qū)稻瘟病抗性能力較強(qiáng)[22]。長三角地區(qū)粳稻攜帶Pita、Pi5、Pi2和Pikm基因的水稻種質(zhì)抗病性增加[23]。王小秋等[24]通過對江蘇育成粳稻品種的稻瘟病抗性基因和穗頸瘟抗性之間的關(guān)系進(jìn)行研究，表明Pia、Pi5和Pita對穗頸瘟的抗性有顯著貢獻(xiàn)，Pigm及基因組合“Pia+Pita”在江蘇粳稻育種中有重要利用價值。

稻瘟病生理小種容易發(fā)生變異，不同區(qū)域的稻瘟病菌優(yōu)勢種群和優(yōu)勢生理小種差異顯著[25-26]。安徽省水稻生產(chǎn)應(yīng)用的多數(shù)品種稻瘟病抗性不強(qiáng)，稻瘟病育種研究進(jìn)展較為緩慢。對近5年安徽育成品種進(jìn)行稻瘟病抗性統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)達(dá)到抗病水平的品種比例較低(平均為5.5%)。前人通過人工接種和自然誘發(fā)鑒定分析苗瘟、葉瘟和穗頸瘟之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，上述三者之間存在顯著正相關(guān)，因此，可以根據(jù)苗瘟抗性鑒定結(jié)果推測穗頸瘟的抗性[27-28]。同時稻瘟病鑒定研究發(fā)現(xiàn)，粳稻稻瘟病抗性復(fù)雜多變，不同區(qū)域間差異較大[22-24]，稻瘟病抗性與基因之間的關(guān)系不夠明確，依靠單個或多個抗性基因提高品種抗性的目的性不強(qiáng)。鑒于此，本研究利用12個稻瘟病抗性基因分子標(biāo)記對153份長江中下游地區(qū)審定的品種或參加中間試驗(yàn)的粳稻材料進(jìn)行基因型分析，旨在明確稻瘟病抗性基因分布；并結(jié)合稻瘟病苗期人工接種鑒定，分析抗性基因與苗瘟之間的關(guān)系，評估單個基因或多基因組合的抗性，以期指導(dǎo)安徽粳稻品種的稻瘟病抗性育種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于稻瘟病抗性鑒定的粳稻材料153份，包括安徽、江蘇、浙江、山東、湖北、上海近年育成的61個粳稻品種(品系)和92份安徽省近幾年參試品種(附表1)，以原豐早和麗江新團(tuán)黑谷(LTH)為苗瘟鑒定的感病對照。12個稻瘟病基因分子檢測的陰性和陽性對照分別為Pita(LTH和武育粳27)、Pib(LTH和武育粳24)、Pikm(日本晴和揚(yáng)粳4227)、Pi54(南粳9108和寧粳8號)、Pid2(LTH和地谷)、Pid3(LTH和地谷)、Pi5(LTH和鎮(zhèn)稻88)、Pi25(LTH和地谷)、Pik(LTH和潤稻118)、Pia(LTH和鎮(zhèn)稻14)、Pb1(日本晴和鎮(zhèn)稻18)和Pizt(南粳9108和武運(yùn)粳21)。供試材料于安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所種質(zhì)資源庫保存。

1.2 稻瘟病抗性基因功能標(biāo)記

本研究對Pita、Pib、Pikm、Pi54、Pid2、Pid3、Pi5、Pi25、Pik、Pia、Pb1和Pizt共12個稻瘟病抗性基因進(jìn)行分子鑒定，所用引物參照文獻(xiàn)[5,16,24]。引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。稻瘟病抗性基因Pita、Pib和Pikm分別由兩對分子標(biāo)記共同鑒定，Pi54、Pi5和Pia根據(jù)分子標(biāo)記的多態(tài)性進(jìn)行基因鑒定，Pi25、Pid2和Pid3基因擴(kuò)增后分別利用NdeI、MIuI和BamHI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)后鑒定抗性基因，Pik、Pb1和Pizt根據(jù)擴(kuò)增條帶的有無進(jìn)行基因鑒定。

1.3 PCR檢測及酶切反應(yīng)

DNA提取采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)法：將樣品裝入96孔板，磨樣機(jī)研磨成粉，加入200 μL 2×CTAB溶液[1 mol·L-1Tris-HCl (pH值8.0) 100 mL，0.5 mol·L-1EDTA (pH值8.0) 40 mL，NaCl 81.9 g，CTAB 20 g，加ddH2O定容至1 000 mL，高溫滅菌]，混勻，65℃水浴30 min，加入100 μL氯仿?lián)u晃5 min后，1 500 r·min-1離心10 min，吸取100 μL上清至PCR板中，加入70 μL異丙醇，混勻，-20℃放置1 h，3 000 r·min-1離心15 min，去上清，沉淀用75%乙醇洗滌，通風(fēng)晾干后，加入50 μL ddH2O溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Pia、Pb1和Pizt基因的鑒定由聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，其他基因由瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR反應(yīng)體系為10 μL：10×PCR Buffer 1.0 μL，25 mmol·L-1MgCl20.6 μL，1 mmol·L-1dNTPs 0.3 μL，前后引物各0.5 μL，Taq酶0.1 μL，DNA模板20～50 ng，補(bǔ)ddH2O至10 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4 min，95℃變性30 s，退火30 s(退火溫度視引物而定)，72℃延伸 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸 5 min，4℃保存?zhèn)溆?。酶切反?yīng)體系：PCR擴(kuò)增DNA產(chǎn)物≤0.5 μg，內(nèi)切酶0.5 μL，10×buffer 1 μL，補(bǔ)ddH2O至10 μL；酶切反應(yīng)程序：將酶切反應(yīng)體系放置于PCR儀中37℃酶切30 min。

1.4 稻瘟病人工接種鑒定

人工接種所用的稻瘟病菌由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所提供，為安徽省稻瘟病優(yōu)勢小種ZB13、ZB15、ZA1和安徽省金寨縣、休寧縣、潛山縣等重發(fā)地區(qū)稻瘟病菌混合菌株。稻瘟病優(yōu)勢小種培養(yǎng)：取馬鈴薯200 g，去皮切成2 cm左右小塊，加入適量ddH2O煮20 min，過濾至1 000 mL容量瓶，在濾液中加入20 g蔗糖，18 g瓊脂，邊加邊攪拌溶解，加ddH2O定容至1 000 mL，過濾后用100 mL錐形瓶分裝，封口后121℃條件下5 min高溫滅菌。將安徽省優(yōu)勢稻瘟病生理小種接入上述培養(yǎng)基中，28℃條件下黑暗培養(yǎng)3 d，挑菌落于滅菌大麥中培養(yǎng)8～10 d，待菌絲長出后，用ddH2O洗脫菌落，顯微鏡觀察菌落濃度，10×10倍鏡下每視野20～50個分生孢子為宜。

接種鑒定：將待接種的水稻材料浸種催芽，播于秧盤，3次重復(fù)；幼苗生長至3～4葉期，于傍晚開始接種，利用噴霧器裝置對幼苗進(jìn)行噴霧接種，使菌液呈水珠狀落于幼苗葉片上，遮光保濕24 h后，每1 h噴水2 min保濕。7～10 d后按照《NY/T 2646-2014水稻品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評價技術(shù)規(guī)程》[29]觀察記載稻瘟病發(fā)病情況，3次重復(fù)以感病最嚴(yán)重為鑒定結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)分析

稻瘟病抗性等級、抗感品種分布等數(shù)據(jù)利用Excel 2010軟件進(jìn)行整理和作圖。材料抗性與稻瘟病抗性基因之間的關(guān)聯(lián)分析利用SPSS 12.0完成。將稻瘟病抗性分成2個等級，5級以下(包括5級)為抗，定義為1；5級以上為不抗，定義為2，對抗性等級進(jìn)行單基因邏輯回歸分析，根據(jù)P值確定基因?qū)剐缘呢暙I(xiàn)是否在P<0.05水平顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病抗性基因分子檢測

利用12個稻瘟病抗性基因分子標(biāo)記對部分供試材料、陰性和陽性對照進(jìn)行擴(kuò)增，以鑒定供試材料中稻瘟病基因型。結(jié)果顯示，12個稻瘟病基因的分子標(biāo)記能夠有效區(qū)分是否攜帶對應(yīng)的稻瘟病抗性基因。Pita、Pib和Pikm基因分別利用2個功能標(biāo)記同時檢測鑒定其基因型；Pi54、Pia和Pi5基因根據(jù)片段的大小鑒定基因型；Pid2、Pid3和Pi25基因擴(kuò)增后利用相應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定；Pb1、Pik和Pizt基因則根據(jù)是否擴(kuò)增出目的片段鑒定。攜帶和未攜帶抗性基因如圖1所示。

注：M代表DNA標(biāo)記；(+)代表抗病品種；(-)代表感病品種。Note: M indicates DNA marker. (+) and (-) represent disease-resistant and susceptible varieties,respectively.圖1 稻瘟病抗性基因分子檢測Fig.1 Molecular detection of rice blast resistance genes

2.2 供試材料中稻瘟病抗性基因分布

利用上述12個稻瘟病功能標(biāo)記對153份粳稻品種進(jìn)行基因型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中11個抗性基因在供試材料中都有不同程度的分布，但未發(fā)現(xiàn)Pi25抗性基因的存在(圖2)。Pib基因在供試材料中占比最高，達(dá)到77.12%，其次為Pita、Pi54和Pb1，分別達(dá)到41.83%、36.60%和36.60%，Pikm、Pik、Pia、Pid3、Pi5、Pid2和Pizt基因出現(xiàn)頻率在11.76%～24.18%之間。

圖2 稻瘟病抗性基因在供試材料中的分布頻率Fig.2 Distribution frequency of resistance genes in tested materials

2.3 稻瘟病苗瘟接種鑒定

利用安徽省不同生態(tài)區(qū)的稻瘟病優(yōu)勢生理小種混合菌株對153份供試材料和陰性對照(原豐早和麗江新團(tuán)黑谷)進(jìn)行苗期人工接種鑒定。鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，材料稻瘟病抗感性狀差異顯著，能夠明確區(qū)分稻瘟病抗性等級(圖3-A～C)。對照品種麗江新團(tuán)黑谷苗瘟等級為9級，原豐早為8級，說明鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠(圖3-D、E)。根據(jù)稻瘟病苗瘟病斑大小和發(fā)病面積對供試材料進(jìn)行記錄整理(圖3-F)。

注：A～C：抗病材料和感病材料的表現(xiàn)；D、E：麗江新團(tuán)黑谷和原豐早苗瘟接種表型；F：苗瘟病級劃分，1～9為苗瘟病級。Note: A～C: Phenotype of disease-resistant materials and susceptible materials. D,E: Phenotype of seedling blast of LTH and Yuanfengzao. F: Classification of seedling blast,1～9 indicates seedling blast grade.圖3 苗瘟人工接種鑒定表型Fig.3 Phenotype of seedling blast by artificial inoculation

2.4 供試材料苗瘟抗性分析和抗性資源篩選

根據(jù)安徽省稻瘟病苗瘟分級標(biāo)準(zhǔn)對供試材料進(jìn)行抗性分析，結(jié)果顯示153份材料中，抗病(0

圖4 153份粳稻材料苗瘟抗性分析Fig.4 Resistance analysis of seedling blast in 153 japonica rice materials

2.5 稻瘟病抗性基因與苗瘟之間的關(guān)系

稻瘟病抗性基因分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，153份供試材料中有5份材料不含有檢測的任何抗性基因，少數(shù)材料含有7～8個基因，具有2～5個抗性基因的品種最多(圖5-A)。進(jìn)一步通過關(guān)聯(lián)分析鑒定攜帶的抗病基因數(shù)目與苗瘟抗性之間的相關(guān)性，結(jié)果表明隨著基因數(shù)目增加，苗瘟抗性略有提高，但未達(dá)到顯著水平(P=0.16)(圖5-B)，說明稻瘟病抗性與含有的抗性基因數(shù)目無顯著相關(guān)性。

圖5 粳稻材料中稻瘟病抗性基因數(shù)分布(A)和品種攜帶抗病基因數(shù)與病級間的關(guān)系分析(B)Fig.5 Distribution of gene number carried by tested varieties (A) and correlation analysis of the resistance gene number and disease grade (B)

圖6 稻瘟病單個基因平均抗性(A)及其回歸分析(B)Fig.6 Average resistance of single gene to rice blast (A) and its logistic regression analysis (B)

抗病性分析表明含有Pi5基因的品種平均抗性最好，病級為4.86，其次為Pia，病級為4.90，然后依次為Pizt(4.94)、Pikm(5.05)、Pik(5.14)等(圖6-A)。單基因回歸分析結(jié)果表明，檢測的稻瘟病抗性基因均能夠不同程度地增加稻瘟病抗性，但達(dá)到顯著水平的只有Pi5(P=0.01)和Pia(P=0.04)(圖6-B)。

2.6 優(yōu)異稻瘟病抗性基因組合

為探索提高水稻稻瘟病抗性的基因或基因組合，本研究分析了含有單個基因或多個基因的品種稻瘟病抗病性，結(jié)果如圖7所示。Pita/-基因組合平均病級為6.12，Pi5/-基因組合平均病級為5.00，Pia/-基因組合平均病級為4.91；在Pi5/-基因組合中加入Pita基因后病級為5.50，在Pia/-基因組合中加入Pita基因后病級為4.92，表明Pita不能增加Pi5/-和Pia/-基因組合的抗病性；Pia與Pi5組成的基因組合Pia/Pi5/-病級為3.75，稻瘟病抗性增加；同時發(fā)現(xiàn)，2個品種中含有Pia/Pi5/Pik/Pikm/-基因組合，其病級為2.50，明顯優(yōu)于Pia/Pi5/-基因組合，說明Pik和Pikm基因可能增加Pia/Pi5/-基因組合的抗病性。此外，還發(fā)現(xiàn)4個品種中含有Pita/Pik/Pikm/Pb1/-基因組合亦表現(xiàn)出較好的抗病性，平均病級為4.25。

注：- 表示不帶有相應(yīng)的抗病基因。Note: - means the absence of the specific resistance gene.圖7 不同稻瘟病基因組合的抗性分析Fig.7 Resistance analysis of different rice blast gene combinations

3 討論

稻瘟病生理小種復(fù)雜多變，解析稻瘟病抗性基因與稻瘟病之間的關(guān)系對指導(dǎo)水稻抗性育種以及品種推廣具有重要意義[24,30]。本研究通過對153份粳稻品種(品系)進(jìn)行稻瘟病苗期人工接種鑒定，發(fā)現(xiàn)中抗以上(≤4級)材料比例較低，為24.84%；中感材料(4

通過對153份粳稻材料的12個稻瘟病基因型分析發(fā)現(xiàn)，不含抗性基因的材料有5份，同時含有7和8個抗性基因的材料各1份，90%以上的材料含有2～6個抗性基因。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)攜帶的抗病基因數(shù)與苗瘟抗性之間無顯著相關(guān)性。不含抗性基因的5份材料中只有1份為8級感病，另外4份材料為4～6級中感；含有7和8個抗性基因的材料苗瘟等級分別為6和7級，不能達(dá)到中抗以上水平，這與關(guān)聯(lián)分析結(jié)果一致。通過對單個基因與苗瘟之間的抗性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Pid3、Pik、Pi5、Pikm、Pia和Pizt基因能夠提高苗瘟抗性，但達(dá)到顯著水平的只有Pi5和Pia，說明依靠單個抗性基因很難解決粳稻苗瘟的抗病問題。此外，本研究發(fā)現(xiàn)含有相同抗性基因的材料苗瘟抗性存在差異，如品種鎮(zhèn)糯20含有Pita、Pib和Pi54基因，苗瘟抗性為6級，含有相同基因的糯稻品系苗瘟為9級；秀水121含有Pita、Pib、Pik和Pikm基因，苗瘟抗性為2級，同樣含有相同基因的水稻品系苗瘟為5級。推測這可能與材料的背景有關(guān)，或有其他稻瘟病基因參與調(diào)控。

稻瘟病生理小種變異快，水稻品種的抗性在種植幾年后即喪失，新的廣譜抗性基因不能被充分利用。王軍等[16]通過分析江蘇省粳稻品種抗稻瘟病基因型與穗頸瘟抗性關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Pita、Pib、Pi54和Pikm對江蘇稻瘟病菌表現(xiàn)廣譜抗性；然而，王小秋等[24]研究結(jié)果表明，Pita和Pib在江蘇粳稻品種中的比例均超過50%，但在稻瘟病抗性5級以下品種中的比例不足30%。同時有研究發(fā)現(xiàn)，“Pita+Pi5”以及“Pita+Pia”基因組合能夠顯著增加江蘇粳稻材料的稻瘟病抗性[24]。這與本研究結(jié)果有所不同，本研究發(fā)現(xiàn)Pita不能顯著增加Pi5/-和Pia/-基因組合的抗病性(圖7)，這可能由于安徽和江蘇地區(qū)稻瘟病生理小種有所差異。本研究發(fā)現(xiàn)，含有“Pia+Pi5”基因組合的品種苗瘟抗性明顯較好；在“Pia+Pi5”基因組合的基礎(chǔ)上加入Pik和Pikm基因，苗瘟抗性更好。此外，含有“Pita+Pik+Pikm+Pb1”基因的材料也具有較好的苗瘟抗性。這些研究表明，“Pia+Pi5”、“Pia+Pi5+Pik+Pikm”和“Pita+Pik+Pikm+Pb1”基因組合對安徽稻瘟病生理小種抗性較好。通過檢測，未在供試材料中發(fā)現(xiàn)廣譜抗稻瘟病基因Pigm，將該基因?qū)刖酒贩N中可能對提高抗病性有重要作用[24,31]。以上研究結(jié)果為安徽粳稻品種稻瘟病抗性改良提供參考依據(jù)，并為下一步研究稻瘟病基因型與穗頸瘟抗性關(guān)系奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過分析153份粳稻材料中的稻瘟病基因型，及其與安徽稻瘟病優(yōu)勢混合生理小種的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Pi5和Pia基因?qū)γ缥量剐载暙I(xiàn)較顯著，“Pi5+Pia”基因組合抗性高于Pi5和Pia單個基因，在“Pi5+Pia”基因組合基礎(chǔ)上，加入Pik和Pikm基因，抗性再次增加，此外，“Pita+Pik+Pikm+Pb1”基因組合對安徽稻瘟病生理小種亦有較好的抗性。

附表1 供試材料清單Table S1 Materials list

附表1(續(xù))

附表1(續(xù))