王林華，歐陽樂飛，高威，段健誠，張慶起，高煥,2,3

（1.江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222001；3.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京 210014；4.連云港贛榆佳信水產(chǎn)開發(fā)有限公司，江蘇 連云港 222100）

汞的毒性極強(qiáng)，已被我國和世界衛(wèi)生組織等諸多國家和機(jī)構(gòu)列為優(yōu)先控制污染物[1,2]。人類活動(dòng)過程中向大自然排放了大量的重金屬汞及其化合物[3]。汞在自然界中主要以單質(zhì)汞、有機(jī)汞化合物和無機(jī)汞化合物三種形態(tài)存在，形態(tài)不同，毒性也不同[4]。自然界中無機(jī)汞較少，毒性相對(duì)較小，但長期暴露在其中會(huì)引起慢性中毒[4]。目前有關(guān)汞對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的毒性研究主要集中于汞對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物酶活性的影響及其機(jī)制[5]。研究表明，汞能與大西洋鮭（Salmo salar）等水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的谷胱甘肽過氧化物酶等相結(jié)合，降低其清除自由基的能力，使體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物含量升高，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6,7]。汞還能顯著影響抗氧化物酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶等酶的活性[8,9]和金屬硫蛋白[10]等蛋白的結(jié)構(gòu)和表達(dá)。Li 等[11]研究了低溫下汞脅迫下草魚抗氧化防御系統(tǒng)和基因表達(dá)情況。這些研究主要從生理響應(yīng)角度展開，但對(duì)機(jī)體的物理結(jié)構(gòu)損傷還鮮見報(bào)道。

脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）是我國特有經(jīng)濟(jì)蝦之一，以黃渤海產(chǎn)量最高。脊尾白蝦由于具有繁殖力強(qiáng)、生長快、味道鮮美和環(huán)境適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，已成為我國沿海地區(qū)重要的混養(yǎng)種類之一，其產(chǎn)量僅次于中國對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）和中國毛蝦（Acetes chinensis）[12-14]。目前關(guān)于脊尾白蝦的研究主要集中在養(yǎng)殖技術(shù)[15]和生物學(xué)特性[16]等方面，汞對(duì)脊尾白蝦影響的研究還較少，關(guān)于汞對(duì)脊尾白蝦的肌肉組織結(jié)構(gòu)影響的研究還未見報(bào)道。近年來，隨著工業(yè)的發(fā)展，水域環(huán)境受污染日益嚴(yán)峻，嚴(yán)重威脅水產(chǎn)品質(zhì)量安全[17]。養(yǎng)殖水體中重金屬污染嚴(yán)重影響?zhàn)B殖對(duì)象的生理機(jī)能和組織形態(tài)，且生物長期暴露在低濃度污染的水體中，會(huì)引起多種組織病理學(xué)變化，根據(jù)生物體的組織結(jié)構(gòu)病理變化來監(jiān)測養(yǎng)殖水體的污染程度及危害程度[18]。而肌肉組織細(xì)胞是維持肌肉組織正常功能的基本單位，一旦肌肉組織無法正常工作，會(huì)影響動(dòng)物取食和避敵能力，影響其生存能力[19]。脊尾白蝦可食用部分主要是肌肉，而肌肉質(zhì)量占全蝦質(zhì)量最多，其所含有害金屬含量百分比較高[20]。肌肉組織中的酶活力變化可以反映肌肉損傷程度[21]。本文通過檢測超氧化物歧化酶（SOD）活力，用石蠟切片和H.E.染色的方法觀察了不同濃度汞脅迫下脊尾白蝦肌纖維的變化特征，以期為揭示重金屬對(duì)甲殼類的毒害作用及其機(jī)制提供幫助。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用脊尾白蝦平均體長（4.5±0.5）cm，平均體質(zhì)量（1.5±0.5）g，來自江蘇省連云港市本地養(yǎng)殖場，經(jīng)兩周實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間鹽度26，水溫（25±1）℃，pH8.2～8.3，溶解氧在5 mg/L 以上，每天早上8 點(diǎn)和晚上6 點(diǎn)投喂餌料，自然光照。將體質(zhì)健壯、體色正常、規(guī)格一致的健康脊尾白蝦隨機(jī)分組進(jìn)行脅迫實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前24 h 停止投喂。

1.2 方法

根據(jù)參考文獻(xiàn)[22]，實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)汞離子濃度梯度：0 g/L（對(duì)照組）、1×10-6g/L，3×10-6g/L 和1×10-5g/L，汞（Hg2+）溶液由氯化汞（HgCl2）配置。每組設(shè)三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放22 尾蝦。實(shí)驗(yàn)期間不間斷充氧，溶解氧在5 mg/L 以上，鹽度26，水溫（25±1）℃，實(shí)驗(yàn)容器為60 L（50 cm×40 cm×30 cm）的藍(lán)色水箱。自然光照，早8 點(diǎn)和晚6 點(diǎn)清理糞便和死蝦。實(shí)驗(yàn)期間不換水，不投喂，分別在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 和96 h 記錄各組試驗(yàn)蝦的中毒癥狀及死亡情況，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取3 尾蝦，取0.2 g 肌肉組織先用液氮速凍，再放入-80℃保存，用于測定SOD活性；另取0.5 cm3肌肉組織用Bouin’s 固定液固定，用于組織切片。

1.2.1 脊尾白蝦肌肉組織中SOD 活力的測定

取0.2 g 肌肉組織加入1.8 mL 的生理鹽水，冰浴下勻漿，2 500 r/min 離心10 min，取上清液用生理鹽水按照1∶4 稀釋成2%的組織勻漿，待測。根據(jù)南京建成生物工程研究所SOD 試劑盒采用羥胺法測定SOD 活性，即每mg 組織蛋白在1 mL 反應(yīng)液中SOD 抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD 量為一個(gè)SOD 活力單位（U/mg）。

1.2.2 脊尾白蝦肌肉組織切片

迅速取出肌肉組織放入Bouin’s 固定液中固定24 h，乙醇梯度脫水，用二甲苯透明，石蠟包埋，KD-1508A 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚度為6 μm，蘇木素-伊紅染色，Nikon 90i（日本）全自動(dòng)電動(dòng)顯微鏡觀察拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用mean±SD 表示，用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 18.0 進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比較（LSD 法），差異顯著水平設(shè)為P<0.05。數(shù)據(jù)結(jié)果用Origin 2018 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度汞脅迫對(duì)脊尾白蝦肌纖維結(jié)構(gòu)的影響

不同濃度的汞脅迫后，脊尾白蝦的肌纖維變化如圖1 所示。對(duì)照組脊尾白蝦（圖1-a）肌纖維在不同區(qū)域聚集成束狀，排列緊密。在濃度為1×10-6g/L、3×10-6g/L 和1×10-5g/L Hg2+的脅迫下，脊尾白蝦肌纖維結(jié)構(gòu)在6 h、12 h、24 h 和48 h 變化不明顯。汞脅迫72 h 后，養(yǎng)殖水體中Hg2+的濃度為1×10-6g/L 時(shí)，脊尾白蝦的肌纖維變化不明顯（圖1，72-2）；而Hg2+的濃度為3×10-6g/L 時(shí)，脊尾白蝦肌纖維有溶解的現(xiàn)象（圖1，72-3）；Hg2+的濃度為1×10-5g/L時(shí)，脊尾白蝦肌纖維比3×10-6g/L 時(shí)溶解的區(qū)域更多（圖1，72-4）。脊尾白蝦經(jīng)過Hg2+脅迫96 h 后，Hg2+的濃度為1×10-6g/L 時(shí)，脊尾白蝦的肌纖維有溶解現(xiàn)象（圖1，96-2）；Hg2+的濃度為3×10-6g/L時(shí)，脊尾白蝦肌纖維比1×10-6g/L 溶解的區(qū)域更多（圖1，96-3）；當(dāng)Hg2+的濃度增加到1×10-5g/L 時(shí)，脊尾白蝦肌纖維有部分?jǐn)嗔眩▓D1，96-4）。

2.2 不同濃度汞脅迫脊尾白蝦SOD 活力的變化特征

不同濃度汞脅迫下，脊尾白蝦SOD 活力的變化特征如圖2 所示。不同濃度Hg2+脅迫后，隨時(shí)間的變化，脊尾白蝦肌肉組織中的SOD 活力先下降后上升，24 h 時(shí)達(dá)到最低值，各濃度汞脅迫組（1×10-6g/L、3×10-6g/L 和1×10-5g/L）的最低值分別為6.65 U/mg、6.42 U/mg 和6.89 U/mg。本研究表明，與空白對(duì)照組相比，在72 h 之前，各Hg2+濃度脅迫組的脊尾白蝦肌肉組織中SOD 活力顯著下降（P<0.05），而在72～96 h 時(shí)，各Hg2+濃度脅迫組的SOD 活力明顯上升。Hg2+的濃度為1×10-6g/L 時(shí)，在96 h 時(shí)SOD活力達(dá)到最高，為24.639 U/mg，而Hg2+的濃度為3×10-6g/L 和1×10-5g/L 時(shí)，在72 h 時(shí)SOD 活力達(dá)最高，分別為21.744 U/mg 和25.780 U/mg。與對(duì)照組相比，在6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 和96 h 時(shí)，脅迫組（1×10-6g/L、3×10-6g/L 和1×10-5g/L）與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）。

3 討論

3.1 重金屬對(duì)水生動(dòng)物機(jī)體物理損傷的影響

重金屬主要是通過水生動(dòng)物的呼吸、吞食和皮膚進(jìn)入體內(nèi)，通過一系列化學(xué)反應(yīng)將重金屬轉(zhuǎn)變成水溶性高且易于排出體外的化合物[23]。但是，有研究表明，水生動(dòng)物中肌肉組織中的重金屬比鰓、胃腸和肝臟更難排出體外[24]，而更容易積累在肌肉組織中。肌原纖維會(huì)隨重金屬處理時(shí)間的延長出現(xiàn)斷裂[25,26]。脊尾白蝦肌肉組織不僅給人類提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也承擔(dān)著運(yùn)動(dòng)功能。因此，脊尾白蝦的肌肉損傷影響了食品的品質(zhì)和安全，也降低其運(yùn)動(dòng)功能和免疫功能[27]。Lourduraj 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，重金屬可使蟹的肌肉等組織畸形，隨重金屬濃度升高，損害程度加強(qiáng)。背角無齒蚌（Anodonta woodiana）經(jīng)過Cu2+脅迫后，腎臟組織出現(xiàn)腺上皮細(xì)胞分布散亂，甚至破碎等現(xiàn)象[29]。隨著銅鎘的濃度增加，鯽（Carassius auratus）的肌纖維溶解和斷裂，嚴(yán)重?fù)p傷肌肉組織[27]。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，可能是隨著汞對(duì)脊尾白蝦脅迫時(shí)間的增加，汞在脊尾白蝦體機(jī)體內(nèi)的濃度升高，肌纖維受損，導(dǎo)致肌纖維受損，出現(xiàn)溶解和斷裂現(xiàn)象。而李濤[21]研究結(jié)果表明，鯽受重金屬污染，脾臟組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而肌肉組織沒有病理學(xué)特征。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同，這可能與物種差異和養(yǎng)殖環(huán)境的影響有關(guān)。

本研究中，在72 h 和96 h 時(shí)，各個(gè)組均與48 h及以前的肌肉結(jié)構(gòu)有一定差異，這可能是汞對(duì)脊尾白蝦肌肉組織的損傷不僅存在劑量效應(yīng)，還存在時(shí)間效應(yīng)，即隨著汞濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長，肌肉組織的損傷程度均明顯加重，這與王蘭[25]和涂葉綠[27]等的研究結(jié)果一致。

3.2 不同濃度汞脅迫脊尾白蝦SOD 活力的變化特征

氧通過還原反應(yīng)生成一些活性氧（ROS）代謝物，如超氧陰離子自由基（O2-）和羥自由基（HO-）等[30]。一般情況下，機(jī)體代謝需要少量ROS 來參與，但是也存在清除ROS 的過程，因此生物體內(nèi)ROS 含量在一定范圍內(nèi)保持動(dòng)態(tài)平衡[30,31]。當(dāng)生物體受到環(huán)境脅迫時(shí)，機(jī)體ROS 產(chǎn)生過多，超過機(jī)體本身的清除能力，導(dǎo)致機(jī)體受損。水產(chǎn)動(dòng)物在進(jìn)化過程中形成了有效的抗活性氧系統(tǒng)[32,33]，包括酶和非酶系統(tǒng)，酶系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等[34]。汞可以通過抑制水產(chǎn)動(dòng)物的抗氧化酶活性來影響其防御機(jī)制[5]，而SOD 是抗活性氧的第一道防線，廣泛存在于生物體當(dāng)中[35,36]。SOD 通過將O2-歧化成O2和H2O2來清除超氧陰離子，保持ROS 系統(tǒng)的平衡，這對(duì)機(jī)體預(yù)防損傷和抗氧化有重要作用[30,37,38]。脊尾白蝦受到汞脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的酶來抵抗體內(nèi)的重金屬離子，其中SOD 能歧化超氧陰離子自由基產(chǎn)生H2O2，清除機(jī)體有害自由基[39]。Morcillo 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，汞等重金屬會(huì)導(dǎo)致硬骨魚細(xì)胞產(chǎn)生過量的活性氧，導(dǎo)致抗氧化酶系統(tǒng)失去平衡，引起細(xì)胞凋亡。

管越強(qiáng)等[41]研究表明，肌肉SOD 活力隨低氧脅迫時(shí)間延長先降低后升高，在8 h 達(dá)到最低，9.5 h之后有所上升，這與本實(shí)驗(yàn)SOD 活力變化相似。而呼光富等[31]研究表明，隨著鎘脅迫時(shí)間延長，肝胰腺和觸角腺的SOD 活力先上升后下降，48 h 時(shí)達(dá)到最高，在72 h 時(shí)最低，但是仍然高于對(duì)照組。這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果有所不同，這可能是汞脅迫使脊尾白蝦體產(chǎn)生大量O2-被超氧化物歧化酶還原成H2O2，O2-的減少和H2O2的大量產(chǎn)生，導(dǎo)致SOD 活性下降[31]。SOD 活性隨著汞脅迫時(shí)間的延長而有上升趨勢(shì)，可能是在過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的作用下，H2O2被分解成O2和H2O，抑制解除，使得脊尾白蝦機(jī)體內(nèi)的ROS 處于動(dòng)態(tài)的平衡之中[37]，SOD 活力的變化反應(yīng)機(jī)體清除O2-能力。

不同濃度的汞脅迫對(duì)脊尾白蝦SOD 活力和肌肉組織有毒性作用，并存在一定的“時(shí)間-效應(yīng)”關(guān)系。SOD 活性間接反應(yīng)了機(jī)體清除自由基的能力；隨著脅迫時(shí)間延長，脊尾白蝦機(jī)體內(nèi)汞的濃度升高，肌纖維開始溶解和斷裂。上述結(jié)果表明，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，尤其是汞排放量較高的區(qū)域，需要特別關(guān)注汞脅迫對(duì)脊尾白蝦的生長和食用安全性的不利影響。