何亮銀，吳建紹，陳卯森，黃偉卿,3，韓坤煌,3，李進(jìn)壽,3，史曉麗,3

（1.寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100；2.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；3.閩東水產(chǎn)品精深加工福建省高等學(xué)校工程研究中心，福建 寧德 352100）

大黃魚（Larimichthys crocea）主要分布于中國東海和黃海南部，以及南海雷州半島東側(cè)近海水域[1]，是我國重要海水經(jīng)濟(jì)魚類。據(jù)中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒，2019 年大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)量為225 549 t，已連續(xù)多年位居我國海水養(yǎng)殖魚類之首[2]。近年來，大黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖密度過高，水體流通不暢，水體環(huán)境日益惡劣，病害嚴(yán)重，較易多發(fā)刺激隱核蟲病、水霉病、內(nèi)臟白點病、腸炎病、爛尾病及弧菌病等，給大黃魚養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。有效控制各種病原感染已成為大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的迫切要求，免疫防治是今后養(yǎng)殖魚類病害防治的重要發(fā)展趨勢。為科學(xué)實施免疫防治，除了相關(guān)免疫制劑的研發(fā)外，深入研究魚體免疫系統(tǒng)的組成及其分子特征也必不可少。

免疫球蛋白是魚類免疫系統(tǒng)重要組成部分，在獲得性免疫中發(fā)揮重要作用[4]。近年研究表明，魚類中存在多種類型免疫球蛋白，已發(fā)現(xiàn)的有IgM、IgD和IgT/IgZ，對魚類免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)、理化特性及免疫學(xué)功能也有較為全面的研究[5]。IgM 是魚類中被發(fā)現(xiàn)最早的一類免疫球蛋白，主要以膜結(jié)合型和分泌型兩種形式存在[6]。分泌型IgM 主要以四聚體的形式分布于魚類血液和黏液中，其中每個IgM 分子由2 條分子量一般為60～81 kDa 的重鏈和2 條分子量一般為20～30 kDa 的輕鏈組成[7]。魚類免疫球蛋白IgM 的純化方法主要有鹽析法、離子交換法、親和層析法等。張偉等[4]利用飽和硫酸銨鹽析結(jié)合Protein A 親和純化方法獲得了高純度的大菱鲆（Scophthalmus maximus）IgM。目前，對硬骨魚類的IgM 特性及功能已有許多研究，包括草魚（Cienoyharyngodoni dellus）[8]、鱖（Siniperca chuatsi）[9]、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[10]和斑馬魚（Danio rerio）[11]等。

水產(chǎn)病原疫苗防治病害被廣泛認(rèn)為是一種綠色健康、安全有效的可行途徑[12]。一種疫苗研制的方式是將滅活后的病原菌免疫魚體，收獲抗血清作為一抗，以制備的抗宿主魚體IgM 抗體為二抗，酶標(biāo)抗體為三抗，以免疫印跡結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜鑒定免疫原性蛋白，并進(jìn)一步開發(fā)為亞單位疫苗或基因工程疫苗[13,14]。本研究利用鹽析結(jié)合Protein A 親和純化了大黃魚血清IgM，用SDS-PAGE 分析了純化IgM 的純度及分子量，以純化的IgM 免疫小鼠并獲得結(jié)合特性良好的抗血清，為后續(xù)應(yīng)用大黃魚IgM多抗研究魚體免疫機(jī)制和疫苗打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

用于血清制備的健康大黃魚購自寧德富發(fā)水產(chǎn)有限公司，體質(zhì)量300～400 g。用于多克隆抗體制備的Balb/c 小鼠購自吳氏實驗動物公司。

1.2 大黃魚血清的制備

將大黃魚移至MS-222 濃度為50 mg/mL 的海水中麻醉約30 s 后，用一次性5 mL 注射器尾靜脈采血，采集的靜脈血于4℃靜置過夜后，次日3 000 r/min、4℃離心10 min，取上清液凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 大黃魚血清IgM 的分離純化

1.3.1 大黃魚血清IgM 的飽和硫酸銨粗提

以等體積的預(yù)冷無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS）稀釋大黃魚血清后，冰浴下逐滴加入預(yù)冷的飽和硫酸銨，并不斷攪拌，至溶液中硫酸銨的終濃度為50%后放置4℃過夜，次日12 000 r/min 離心30 min 后，棄上清，以適量0.02 mol/L 磷酸鈉緩沖液重懸沉淀并轉(zhuǎn)移至透析袋中。透析至檢測不到SO42-為止，透析液經(jīng)硝酸硝化后滴加氯化鋇溶液，觀測是否有硫酸鋇白色沉淀生成，以檢測SO42-。

1.3.2 大黃魚血清IgM 的親和純化

按照Hitrap Protein A HP 純化柱（GE）操作步驟，以5 倍柱體積的平衡緩沖液（0.02 mol/L 磷酸鈉緩沖液，pH 7.0）洗滌層析柱。透析液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后，上樣于層析柱中，孵育30 min 后，以平衡緩沖液將未與層析柱結(jié)合的雜蛋白洗脫完全后，再以洗脫液（0.1 mol/L 檸檬酸，pH3.5）將層析柱上的結(jié)合蛋白洗脫下來。按洗脫目的蛋白流出液∶收集緩沖液（1 mol/L Tris-HCl，pH 9.0）=1∶9 的比例將洗脫的目的蛋白保存于收集緩沖液中。

1.4 大黃魚血清IgM 的濃縮與濃度測定

洗脫蛋白裝入透析袋中用超純水透析48 h，于冷凍干燥機(jī)濃縮后，以適量PBS 重懸蛋白樣品用于濃度測定。蛋白濃度以改良型Bradford 試劑盒（上海生工）采用酶標(biāo)法測定：以梯度稀釋的BSA 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液加入Bradford 工作液后595 nm 吸光值為縱坐標(biāo)，不同BSA 標(biāo)準(zhǔn)蛋白液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；測定透析后的洗脫蛋白加入Bradford工作液后的吸光值，計算其對應(yīng)的蛋白濃度。以無菌PBS 調(diào)整目的蛋白濃度為1 mg/mL，放置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析IgM 的特性

采用Mini-Protein cell 系統(tǒng)（Bio-Rad），分別配制濃度為12%和5%的聚丙烯酰胺分離膠和濃縮膠，用于蛋白分離。經(jīng)透析后的洗脫蛋白與等體積的上樣緩沖液混勻后，沸水中煮沸5 min 后上樣，恒壓90 V 下電泳至溴酚藍(lán)從分離膠溢散，剝離分離膠進(jìn)行G250 染色并拍照。

1.6 大黃魚血清IgM 鼠源多克隆抗體的制備

濃度為1 mg/mL 的IgM 分4 次免疫8～12 周齡的Balb/c 小鼠，具體免疫程序如下：基礎(chǔ)免疫，IgM與弗氏完全佐劑1∶1 混勻至“油包水”狀態(tài)后，腹腔注射0.2 mL；兩周后進(jìn)行第1 次加強(qiáng)免疫，IgM 與弗氏不完全佐劑1∶1 混勻，腹腔注射0.2 mL；第四周和第五周分別再加強(qiáng)免疫一次，尾靜脈注射不加佐劑的IgM 蛋白0.2 mL；最后一次加強(qiáng)免疫后一周摘小鼠眼球一次性取血，全血室溫傾斜放置2 h 后，于4℃過夜，次日8 000 r/min、4℃離心10 min 獲抗血清。

1.7 鼠抗血清抗體效價測定

以0.05 M 碳酸鹽緩沖液將IgM 濃度調(diào)整至20 μg/mL，按每孔100 μL 加入96 孔酶標(biāo)版，設(shè)置3 個重復(fù)，4 ℃包被過夜；次日倒掉包被液，PBST（含0.5%Tween 20 的PBS）洗滌3 次后，加入含5%脫脂奶粉的PBST，37℃孵育1 h；PBST 洗滌三次后，每孔加入PBST 稀釋成不同濃度梯度的鼠抗血清100 μL，37℃孵育1 h；按上述步驟洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（sigma，1∶5 000）100 μL，37℃孵育45 min；洗滌后加入TMB 顯色液（碧云天）顯色至預(yù)期深淺后加入2 mol/L H2SO4終止顯色，測量酶標(biāo)儀在450 nm 下反應(yīng)液吸光值。判定P/N≥2.1 時為陽性。

1.8 大黃魚IgM 鼠源抗血清結(jié)合特性分析

將純化的大黃魚血清IgM 經(jīng)SDS-PAGE 分離后，恒壓30 V 下作用90 min 轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，在37℃條件下以含5%脫脂奶粉的PBST 封閉1 h。根據(jù)上節(jié)測定的抗血清效價，PVDF 膜經(jīng)PBST 洗滌后置于稀釋后的抗血清中，37℃孵育1 h，陰性對照樣品置于按相同倍數(shù)稀釋的健康小鼠血清中孵育。PVDF 膜經(jīng)清洗后置于以PBST 稀釋的辣根過氧化酶酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（Sigma，1∶5 000）抗體中，37℃孵育45 min，經(jīng)PBST 洗滌后加入TMB 顯色液（碧云天），顯色后用超純水清洗終止反應(yīng)，拍攝記錄反應(yīng)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃魚血清IgM 的親和純化

利用Protein A 親和層析柱純化經(jīng)飽和硫酸銨粗提后的IgM 時，樣品可分為兩部分：一是未能與層析柱中Protein A 結(jié)合的蛋白，直接被平衡緩沖液洗脫下來（圖1，峰1）；另一部分是能與層析柱中Protein A 結(jié)合的蛋白，被洗脫緩沖液洗脫下來（圖1，峰2）。

2.2 SDS-PAGE 分析大黃魚血清IgM

SDS-PAGE 檢測純化的大黃魚IgM 純凈度和分子量結(jié)果顯示，經(jīng)飽和硫酸銨粗提后的血清樣品中除主要成分IgM 外，仍包含較多雜質(zhì)（圖2，泳道1）。利用Protein A 親和層析柱純化得到的蛋白樣品純度很高，包含兩條主要蛋白條帶，比照標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker，Quantity One 軟件測定這兩條帶分子量分別約為75 kDa 和28 kDa（圖2，泳道2），分別與多數(shù)魚類IgM 的重鏈和輕鏈相符合，可判定純化得到的蛋白為大黃魚IgM。

2.3 大黃魚血清IgM 的濃度測定

使用Bradford 試劑盒測定純化后IgM 濃度，使用BSA 標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的擬合方程為y=0.002x+0.419（R2=0.989）（圖3）。對純化IgM 經(jīng)蒸餾水透析48 h，冷凍干燥后經(jīng)PBS 重懸，稀釋5 倍后測得溶液吸光值為0.956，計算原蛋白液濃度為1.343 mg/mL。

2.4 大黃魚血清IgM 鼠源多克隆抗體效價測定

分離純化后的大黃魚血清IgM 蛋白調(diào)整濃度為1 mg·mL-1后免疫Balb/C 小鼠，制備鼠抗大黃魚血清IgM 血清，用間接ELISA 測定抗血清效價。ELISA 檢測結(jié)果顯示，隨著鼠源抗血清稀釋倍數(shù)增加，P/N 值逐漸降低。當(dāng)稀釋倍數(shù)小于20 000 時，P/N>2.1，而當(dāng)稀釋倍數(shù)大于30 000 時，P/N<2.1，表明試驗制備的鼠抗血清效價較高，達(dá)20 000（圖4）。

2.5 Western blotting 分析鼠源多克隆抗體結(jié)合特性

Western-blotting 分析制備的鼠抗大黃魚IgM多抗的結(jié)合特性結(jié)果顯示：以健康小鼠代替鼠源抗血清的陰性對照組無顯色條帶（圖5，泳道2），實驗組（圖5，泳道3）在約75 kDa 和28 kDa 左右出現(xiàn)與大黃魚血清IgM 的重鏈和輕鏈（圖5，泳道1）位置一致的條帶，由此可以確定，制備的鼠抗血清可以特異性結(jié)合大黃魚血清IgM。

3 討論

3.1 大黃魚血清IgM 的純化

鹽析法、凝膠過濾法、親和層析法及離子交換法等是目前用于分離純化魚類免疫球蛋白IgM 的主要方法，多采用一種或多種方法聯(lián)合達(dá)到理想的分離純化效果。硫酸銨鹽析法被廣泛用于多種硬骨魚類血清IgM 的初步分離。該方法可通過簡單操作析出大量的血清IgM，對樣品進(jìn)行粗提，但粗提液中除含有高濃度的IgM 外，還包含較多其他雜蛋白，需要進(jìn)一步純化[8,15-17]。Protein A 是金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的細(xì)胞壁組成成分，可以特異性結(jié)合免疫球蛋白IgG 和部分IgM 的Fc 段，被廣泛應(yīng)用于親和純化魚類的IgM，并取得理想的純化效果[18-20]。本研究采用濃度為50%的飽和硫酸銨粗提，結(jié)合Protein A 親和層析純化了大黃魚的血清IgM。SDS-PAGE 顯示純化后的IgM 由兩條主要蛋白條帶組成，分子量分別約為75 kDa 和28 kDa，這與以往報道的大黃魚血清IgM[16]及其他硬骨魚類IgM[4,8,15]的重鏈及輕鏈分子量大小相符；且純化的IgM 除重輕鏈外，不包含其他雜蛋白，表明大黃魚血清IgM 的純化效果良好，可用于后續(xù)試驗動物的免疫。

3.2 IgM 多克隆抗體在水產(chǎn)病害防治中的應(yīng)用

通過篩選和鑒定水產(chǎn)病原具有保護(hù)作用的免疫原性蛋白，研制亞單位疫苗和基因工程疫苗，被廣泛應(yīng)用于防治水產(chǎn)病原侵染。一般做法是，將滅活后的病原按標(biāo)準(zhǔn)免疫流程注射到小鼠、家兔等實驗動物體內(nèi)，免疫周期結(jié)束后獲取抗血清作為一抗，酶標(biāo)羊抗鼠或抗兔Ig 為二抗，以免疫印跡（Western blotting）結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜鑒定免疫原性蛋白[21]。魚類作為低等脊椎動物，病原在體內(nèi)引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)與哺乳類小鼠和家兔明顯不同，Verjan 等[22]利用兔多抗篩選的愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）免疫原性蛋白就不能與牙鮃的抗血清反應(yīng)。因此，通過該方法篩選到的免疫原性蛋白往往不能對魚體形成有效的免疫保護(hù)。一種更科學(xué)的方法是，將滅活后的病原免疫魚體，收獲抗血清作為一抗，以制備的抗宿主魚體IgM 抗體為二抗，酶標(biāo)抗體為三抗，Western blotting 篩選免疫原性蛋白。該方法篩選到的蛋白一般能很好地誘導(dǎo)魚體免疫保護(hù)[13,14]。本研究制備了大黃魚血清IgM 的鼠源多克隆抗體，ELISA 測定其效價達(dá)20 000，Western blotting 顯示其可特異性結(jié)合IgM，可應(yīng)用于后續(xù)大黃魚病害的免疫防治研究中。

3.3 結(jié)論

本研究利用硫酸銨粗提結(jié)合Protein A 親和層析純化了大黃魚血清IgM，并制備了具有良好結(jié)合特性的鼠源抗IgM 血清，可應(yīng)用于大黃魚機(jī)體免疫機(jī)制及病害防治研究。