金歌，費(fèi)金鵬，胡秀彩，譚靜，呂愛軍，孫敬鋒

（天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）肉質(zhì)鮮美、出肉率高、營(yíng)養(yǎng)豐富，受到廣大消費(fèi)者的青睞[1]，是我國(guó)主要分布于渤海、黃海和東海海域特有的名貴經(jīng)濟(jì)海水魚類之一。近年來，我國(guó)半滑舌鰨多采用集約化養(yǎng)殖，但由于飼養(yǎng)密度過大、水質(zhì)環(huán)境差，多種細(xì)菌性傳染病頻繁發(fā)生造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2,3]。

魚類生活在比陸地更為復(fù)雜的水生環(huán)境中，更易接觸病原體，包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲等[4,5]。魚類皮膚黏液主要由黏蛋白、免疫球蛋白和酶類等組成[6]。黏蛋白作為黏液的主要成分，在魚類抵制病原菌入侵中發(fā)揮重要作用。魚類黏蛋白主要分為分泌型黏蛋白和膜結(jié)合型黏蛋白兩大類[7,8]。近年來，已陸續(xù)在斑馬魚（Danio rerio）[9,10]、鯉（Cyprinus carpio）[11]、金頭鯛（Sparus aurata）[12]、海鱒（Salmo trutta）[13]以及半滑舌鰨[14,15]等硬骨魚類中，發(fā)現(xiàn)有MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC13 和MUC18 等黏蛋白。在脊椎動(dòng)物中還發(fā)現(xiàn)一些黏蛋白樣蛋白（Mucin-like protein,MLP）基因[10,16]，與人類MUC2黏蛋白由同一基因編碼[17]。但是，關(guān)于半滑舌鰨黏蛋白MLP 基因克隆表達(dá)及功能研究，目前尚未見報(bào)道。

本研究采用RT-PCR 方法擴(kuò)增和克隆了半滑舌鰨黏蛋白CsMLP 基因，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)分析了基因蛋白結(jié)構(gòu)，分析CsMLP 在各組織分布和創(chuàng)傷弧菌感染后其在皮膚中的表達(dá)模式，以期為深入研究黏蛋白在魚類免疫過程中的功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

致病性創(chuàng)傷弧菌ST-6 菌株由本試驗(yàn)室從發(fā)病半滑舌鰨分離純化并保存[2]。半滑舌鰨購(gòu)自天津某養(yǎng)殖公司，平均體質(zhì)量（110±10）g，體長(zhǎng)為25～30 cm，置于1.2 m×0.8 m×0.6 m 的網(wǎng)箱中室內(nèi)暫養(yǎng)2周，每天投喂普通飼料2 次、換水1 次，水溫維持在（25±2）℃，鹽度12。確認(rèn)健康活潑無病后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)用Trizol 試劑、焦碳酸二乙酯DEPC、Prime Script RT reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RHaseH Plus）試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；主要檢測(cè)儀器有：CFX96 型熒光定量PCR 儀（BIO-RAD）、NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（Thermo）、瓊脂糖水平電泳儀（北京市六一儀器廠，DYCP-31BN）、和臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Legend Mach 1.6R，賽默飛世爾儀器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 人工感染半滑舌鰨及組織樣品收集

創(chuàng)傷弧菌感染半滑舌鰨實(shí)驗(yàn)，參照胡秀彩等[2]方法進(jìn)行。取保存于-80℃的創(chuàng)傷弧菌ST-6 菌株，無菌接種于2216E 培養(yǎng)基中，28℃、120 r/min 過夜培養(yǎng)。菌液濃度用比濁法調(diào)至1×106CFU/mL 后，給半滑舌鰨腹腔注射，劑量為100 μL。對(duì)照組注射等量0.85%的生理鹽水。無菌操作取其皮膚、鰓、肝、脾和腸道；注射6 h、12 h、24 h 和36 h 時(shí)皮膚取樣，用生理鹽水沖洗以去除黏液，置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 組織總RNA 提取與cDNA 第一鏈合成

參照譚靜等[14]的方法，用TRIzol Reagent 抽提RNA，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 質(zhì)量，用Nanodrop ND-2000 分光光度計(jì)測(cè)定其濃度及OD260/OD280。然后以提取的總RNA 為模板，用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）合成第一鏈cDNA，合成的cDNA 于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及半滑舌鰨CsMLP 基因克隆

參考半滑舌鰨基因組黏蛋白MLP 基因序列（登錄號(hào)：XM_025055452）設(shè)計(jì)2 對(duì)黏蛋白特異性引物用于RT-PCR 擴(kuò)增和1 對(duì)引物用于qPCR 擴(kuò)增（表1），引物由金唯智生物科技有限公司合成。

表1 半滑舌鰨黏蛋白MLP 基因引物序列Tab.1 Primer sequence of MLP gene in semi-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis

以半滑舌鰨皮膚組織cDNA 為模板，采用RT-PCR 方法擴(kuò)增CsMLP。PCR 擴(kuò)增體系為25 μL，包括cDNA 模板2 μL、上下游引物各1 μL、Master Mix 10 μL 和ddH2O 11 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min；95℃40 s，55℃45 s，72℃1 min 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖檢測(cè)后，用DNA 膠回收試劑盒回收目的基因片段；膠回收產(chǎn)物與pMD18-T 載體進(jìn)行連接，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆菌液送金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.4 CsMLP 蛋白序列與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用ExPASy ProtParam tool 分析該蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、NetOGlyc 4.0 Server 和NetPhos 3.1 Server 預(yù)測(cè)其糖基化與其磷酸化位點(diǎn)、SMART 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；利用DNAStar 中Protean 軟件分析該蛋白的疏水性、表面可能性、抗原指數(shù)及綜合預(yù)測(cè)其抗原表位；利用PSIPRED 在線分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)、Phyre2進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，ClustalW 及MEGA 6.0 進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以cDNA 為qPCR 模板，GAPDH 為內(nèi)參基因（引物序列見表1），利用CFX96 型熒光定量PCR 儀進(jìn)行不同組織和創(chuàng)傷弧菌感染后其在皮膚各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的定量分析，每個(gè)組織及時(shí)間點(diǎn)各取3 個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。20 μL 反應(yīng)體系包括SYBR Premix Ex TaqTMII（2×）10 μL，上下游引物（10 μM）各0.5 μL，各組織cDNA 模板2 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃3 min；95℃15 s，60℃1 min，40 個(gè)循環(huán)；72℃2 min；65℃5 s；95℃5 s。通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物的特異性和試驗(yàn)的可靠性。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以皮膚組織的cDNA 為模板，進(jìn)行4 倍倍比稀釋，取5 個(gè)稀釋梯度進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)梯度設(shè)3 個(gè)平行，并做不加模板對(duì)照，確定每個(gè)基因擴(kuò)增后標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率（E）在90%～105%之間，R2>0.990；產(chǎn)生的溶解曲線是單一波峰后為有效數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，分別制作目的基因CsMLP 和內(nèi)參基因GAPDH 的標(biāo)準(zhǔn)曲線（擴(kuò)增效率為E=95%，相關(guān)系數(shù)R2=0.997）。根據(jù)擴(kuò)增得到Ct 值，通過2-ΔΔCt法計(jì)算MLP 基因的相對(duì)表達(dá)量，采用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 半滑舌鰨CsMLP 蛋白理化特性分析

采用RT-PCR 方法擴(kuò)增半滑舌鰨皮膚黏蛋白CsMLP 基因片段，分別獲得特異性片段長(zhǎng)度大小為1 500 bp 和1 400 bp 左右目的條帶，與預(yù)期片段大小一致（圖1），測(cè)序獲得長(zhǎng)度為1 506 bp 和1 589 bp的兩條序列，經(jīng)拼接基因全長(zhǎng)為2 989 bp，推測(cè)可編碼996 氨基酸（aa），與半滑舌鰨基因組黏蛋白MLP基因序列（XM_025055452）相似性為91.31%。預(yù)測(cè)分子量為104.30 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為4.47、蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為47.99、親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.558，表明半滑舌鰨蛋白CsMLP 屬于親水蛋白。DNAstar 軟件預(yù)測(cè)CsMLP 可形成抗原表位的氨基酸區(qū)域數(shù)有6 個(gè)，分別是43～49、175～195、406～426、455～465、559～587 和990～996 aa（圖2）。對(duì)CsMLP蛋白修飾位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明：CsMLP 有5 個(gè)糖基化位點(diǎn)（Thr568、Ser571、Ser767、Ser782、Thr844）和24 個(gè)磷酸化位點(diǎn)（閾值≥0.9），其中16 個(gè)為絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)（S27/30/77/239/498/571/591/600/634/647/681/694/728/741/754/991）、4 個(gè)蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)（T9/70/76/581）及4 個(gè)酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)（Y41/500/778/809）。

2.2 黏蛋白基因序列比對(duì)及3D 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過Blast 同源性檢索分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨CsMLP 與黃金鱸（Perca flavescens，XP_028432905）MLP 同源性最高為56.18%，其次與大西洋鳙鰈（Hippoglossus hippoglossus，XP_034437605.1）為50.78%，與石斑魚（Epinephelus lanceolatus，XP_033488230.1）、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes，XP_029701618.1）和斑馬魚（Danio rerio，XP_002667589）分別為44.07%、39.34%和33.15%；但與非洲爪蟾（Xenopus laevis，XP_018113014）、人（Homo sapiens，CAA04737.1）和紫海膽（Strongylocentrotus purpuratus，XP_0308517 49.1）等同源性較低，分別為26.91%、22.63%和15.69%（表2）。CsMLP 蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示（圖3），CsMLP 蛋白共含有3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為VWD（smart00216,98～273 aa）、C8（pfam08742,318～379 aa）和CK（smart00041,908～982 aa）。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白以β-折疊為主，其中C8 區(qū)主要由α-螺旋構(gòu)成，VWD、CK 區(qū)主要由β 折疊構(gòu)成。三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致（圖4）。

表2 CsMLP 序列同源性比對(duì)分析Tab.2 Homology analysis of sequence alignment of CsMLP gene

2.3 CsMLP 基因的組織分布及創(chuàng)傷弧菌感染后皮膚表達(dá)分析

用SYBR Green Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 法分析了CsMLP 基因mRNA 的組織分布、創(chuàng)傷弧菌感染后CsMLP 皮膚表達(dá)模式。結(jié)果顯示：CsMLP 基因擴(kuò)增效率為E=103.2%，相關(guān)系數(shù)R2=0.994，對(duì)應(yīng)的熔解曲線生成單一峰、無引物二聚體和非特異性產(chǎn)物，表明引物具有特異性，可用于相對(duì)定量qPCR 檢測(cè)分析。CsMLP 基因廣泛存在多個(gè)組織中，但存在一定組織差異性，其中鰓、皮膚中表達(dá)量較高，而在脾臟、肝臟和腸道中表達(dá)水平較低（圖5-A）。創(chuàng)傷弧菌感染半滑舌鰨后，皮膚組織中CsMLP 基因在短時(shí)間內(nèi)顯著下調(diào)表達(dá)，刺激12 h 后表達(dá)顯著增加（P<0.05），達(dá)最高峰表達(dá)量，約為對(duì)照組的2.5 倍，感染36 h 后顯著性下調(diào)表達(dá)（P<0.01）（圖5-B）。

3 討論

近年來，重要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類半滑舌鰨多種細(xì)菌性傳染病頻繁發(fā)生，其中弧菌感染危害嚴(yán)重[2,3]。皮膚及其黏液是魚體抵抗病原體的重要防線，其中黏蛋白為黏液的主要成分[14,15,18]。黏蛋白是一類富含脯氨酸、蘇氨酸和絲氨酸高度串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)域的大分子類糖蛋白，根據(jù)蛋白特性可分為兩大類即膜結(jié)合型黏蛋白和分泌型黏蛋白[7,8]。分泌型黏蛋白進(jìn)一步可分為大分子的凝膠形成型黏蛋白（SGFM）和小分子的可溶性黏蛋白[19]。SGFM 含有一個(gè)血管性血友病因子D 型結(jié)構(gòu)域（VWD），富含半胱氨酸的C8 結(jié)構(gòu)域（C8）和C 末端半胱氨酸結(jié)（CK），參與黏蛋白的低聚反應(yīng)[13]。本研究采用RT-PCR 方法克隆獲得半滑舌鰨分泌型黏蛋白CsMLP，預(yù)測(cè)含有三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（即VWD、C8 和CK），與金頭鯛中的MUC2保守結(jié)構(gòu)域一致[10]。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果顯示，半滑舌鰨CsMLP 與MUC2 同屬于分泌型黏蛋白家族。同源性分析表明，CsMLP 氨基酸序列與黃金鱸、大西洋鳙鰈、斑馬魚等魚類序列同源性較高，但與非洲爪蟾、人、鼠、海膽等同源性較低，值得進(jìn)一步探索其生物學(xué)功能。

黏蛋白不僅參與細(xì)菌黏附侵入過程，且與宿主細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡免疫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)過程有關(guān)[10,20]。近年來，關(guān)于魚類黏蛋白的表達(dá)及功能研究也逐漸成為關(guān)注熱點(diǎn)，主要集中在膜結(jié)合型和分泌型黏蛋白MUC2、MUC5AC 和MUC18等[14,15]。但是，關(guān)于半滑舌鰨黏蛋白樣蛋白CsMLP基因克隆表達(dá)研究，目前尚未見報(bào)道。薛春雨等[8]克隆獲得了團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）MUC5B 基因，發(fā)現(xiàn)其在皮膚和鰓中表達(dá)量最高。Pérez-Sánchez 等[12]研究了李氏粘體蟲（Enteromyxum leei）感染金頭鯛后MUC13、MUC18 等黏蛋白的組織分布及腸道表達(dá)時(shí)序。Sveen 等[16]分析了大西洋鮭（Salmo salar）全基因組，獲得MUC2 和MUC5基因序列，發(fā)現(xiàn)MUC2 基因主要在腸道表達(dá)，而MUC5 基因主要在皮膚和鰓中表達(dá)。在鯉（Cyprinus carpio）中黏蛋白MUC2、MUC5B 的組織分布與鮭的研究中也報(bào)道類似結(jié)果[9]。CyHV-3 感染鯉后MUC5B 基因下調(diào)表達(dá)[21]。Marcos-López 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，大西洋鮭感染阿米巴鰓病后，分泌型黏蛋白MUC5AC 表達(dá)量顯著增加，膜結(jié)合型黏蛋白MUC18卻下調(diào)表達(dá)明顯。本研究發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨CsMLP 基因主要在皮膚和鰓中大量表達(dá)，這與鯉MUC5B、大西洋鮭MUC5AC 基因組織表達(dá)模式類似[9,22]。多數(shù)黏蛋白的分布均呈組織特異性，如人類的MUC2 主要在腸道特異性表達(dá)[23]。本實(shí)驗(yàn)采用創(chuàng)傷弧菌感染半滑舌鰨后CsMLP 基因在短時(shí)間內(nèi)顯著下調(diào)表達(dá)，隨后在刺激12 h 后表達(dá)顯著增加，36 h 后顯著性下調(diào)表達(dá)，結(jié)果表明CsMLP 在細(xì)菌感染半滑舌鰨抗病應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)主要分析了創(chuàng)傷弧菌感染半滑舌鰨后MLP[24]基因在皮膚組織中的表達(dá)，關(guān)于在脾臟、肝臟和腸道組織的表達(dá)模式有待進(jìn)一步研究。

本研究克隆了半滑舌鰨皮膚黏蛋白CsMLP 基因序列，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，采用熒光定量分析其在各組織中分布情況和創(chuàng)傷弧菌感染后在皮膚中的表達(dá)模式，不僅為研究魚類黏蛋白基因功能奠定基礎(chǔ)，而且對(duì)魚類疾病免疫預(yù)防研究具有重要意義。