聶恒，黃斌，蘇帆

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)為臨床常見的原發(fā)性心肌病，該病發(fā)病隱匿，多數(shù)患者出現(xiàn)明顯心衰癥狀時才得以確診，錯過了最佳治療時期，且發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。研究表明，心肌纖維化導(dǎo)致的心室重構(gòu)是DCM發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)，而轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smads信號通路在心肌纖維化的變化過程中發(fā)揮著重要的作用[2]?？估w益心方為河南省中醫(yī)院心病科臨床治療DCM的經(jīng)驗方，具有益氣活血的功效，能改善患者癥狀，提高其生活質(zhì)量[3]。研究表明，抗纖益心方能夠抑制DCM模型大鼠的心室重構(gòu)[4]，但此機(jī)制仍需進(jìn)一步的探討。本研究通過觀察DCM大鼠模型心肌纖維化過程中及抗纖益心方干預(yù)后大鼠超聲心電圖、活性因子及心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)，明確TGF-β1/Smads信號通路在心肌纖維化中的時相性變化及抗纖益心方對TGF-β1/Smads信號通路的干預(yù)效果，以便選擇合適的時間用藥，既減輕患者的治療花費(fèi)，又能最大效率的治療疾病，開拓DCM研究思路，為臨床治療提供根據(jù)。

1 材料

1.1 動物SPF級Wistar 健康雄性大鼠140只，體質(zhì)量100～120 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK (京) 2012-0001，所有實驗動物飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院中心實驗室動物飼養(yǎng)中心，22～25 ℃、50%濕度自由攝食、飲水，正常飼養(yǎng)1周后進(jìn)行模型制備。本實驗獲得實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑抗纖益心方干浸膏(由黨參，黃芪，茯苓，白術(shù)，丹參，益母草，川芎，紅花，赤芍，澤蘭組成，河南省中醫(yī)院制劑室提供)；呋喃唑酮片(福建省三明天泰制藥有限公司，批號：20150505)；貝那普利片 (常州制藥廠，批號：20150308)。戊巴比妥鈉[中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司，批號：20150204]；RIPA裂解液(美國Sigma公司，批號：20150703)；TGF-β1、GAPDH抗體(美國BD公司，批號：20140623、20150203)；羊抗兔二抗(美國CST公司，批號：20150601)；免疫組化試劑盒(上海長島生物有限公司，貨號：D-3005)；trizol(美國Invitrogen公司，批號：15596-026)；PCR試劑盒、TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara Bio公司，貨號：RR430A、RR036A)；蛋白提取試劑盒、BCA檢測試劑盒(南京建成生物研究所，批號：20150508、20150126)。

1.3 儀器彩色多普勒超聲檢測儀(德國西門子股份公司，型號：Acuson Cypress)；石蠟切片機(jī)(湖北慧達(dá)儀器公司，型號：HD-325)；組織包埋機(jī)(湖北慧達(dá)儀器公司，型號：HD-310)；熒光顯微鏡(奧林巴斯，型號：CKX41)；凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司，型號：164-5070)。

2 方法

2.1 動物模型復(fù)制及分組、給藥采用呋喃唑酮水溶液(700 mg·kg-1)喂養(yǎng)大鼠復(fù)制DCM模型。將模型制備成功的大鼠隨機(jī)分為造模組、模型對照組及給藥組(小劑量抗纖益心方組、大劑量抗纖益心方組貝那普利組、聯(lián)合用藥組)，造模組又分為空白對照組及模型2周組、4周組、6周組、8周組、10周組、12周組、14周組、16周組，每組10只大鼠。所有組全程給予呋喃唑酮飲水喂養(yǎng)，造模組、模型對照組不給予藥物干預(yù)，給藥組均于造模6周后開始給藥，連續(xù)8周：小劑量抗纖益心方組、大劑量抗纖益心方組、貝那普利組分別給予抗纖益心方4.7 g·kg-1、抗纖益心方18.8 g·kg-1、貝那普利10.125 mg·kg-1，聯(lián)合用藥組每日給予抗纖益心方18.8 g·kg-1+貝那普利10.125 mg·kg-1。

2.2 大鼠一般狀況開始造模后每天觀察大鼠的活躍度、皮膚毛發(fā)、精神狀況、平均飲食和飲水量等，并于每周檢測體質(zhì)量變化。

2.3 大鼠超聲心動圖各組大鼠共140只在其對應(yīng)時間點(diǎn)，以體積分?jǐn)?shù)1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)腹腔內(nèi)注射麻醉后行心臟超聲心動圖檢測左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter，LVDs)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVDd)。取3個測量值后取平均值計算射血分?jǐn)?shù)(ejection fractions，EF)及左室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)。

2.4 心肌取材、處理及保存用體積分?jǐn)?shù)1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠后，迅速打開胸腔，以祛酶剪刀剪除大鼠心臟，1‰DEPC水沖洗殘留血液，去除大血管、心外膜脂肪組織，放于祛酶錫箔紙上，將左心室分割兩份。一份置于10%中性福爾馬林中保存24 h，然后經(jīng)酒精逐梯脫水，二甲苯透明，用熔點(diǎn)為60 ℃及54 ℃的石蠟浸透4 h，石蠟包埋備用。另一份以祛酶錫箔紙包裹，標(biāo)記相應(yīng)大鼠編號后，浸入液氮罐，1 h后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱存放，待檢。

2.4.1 HE染色觀察大鼠心肌病理形態(tài)將上述已經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋的心肌組織進(jìn)行切片、脫洗、HE染色，顯微鏡下觀察病理學(xué)形態(tài)變化。

2.4.2 免疫組化檢測心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1的表達(dá)取大鼠心肌組織石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min。每張切片加入1滴過氧化物酶阻斷溶液，用來阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育10 min。PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加1滴非免疫性動物血清，室溫孵育10 min。除去血清，每張切片加1滴稀釋的一抗，4 ℃過夜。取出放至室溫，PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加1滴生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育 30 min。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加1滴親和素-過氧化物酶，室溫孵育 30 min。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加2滴新鮮配制的DAB溶液。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。在圖像分析系統(tǒng)上隨機(jī)選取相等的5個高倍視野(×400)，每張片子測量OD值后取平均值。染色質(zhì)含量的高低即陽性染色度的強(qiáng)弱和平均光密度呈正相關(guān)。

2.4.3 RT-PCR檢測大鼠心肌TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量將各組大鼠心肌組織50 mg運(yùn)用Trizol法提取總RNA，依照試劑盒固定的步驟進(jìn)行實驗，用DU800檢測RNA的OD值；用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA(逆轉(zhuǎn)錄程序為37 ℃×15 min，85 ℃×5 s)，再進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR引物序列見表1，PCR結(jié)果采用ΔCT法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 引物序列

2.4.4 Western Blot法檢測大鼠心肌TGF-β1/Smads通路相關(guān)蛋白表達(dá)量取各組大鼠心肌組織30 mg進(jìn)行剪碎后結(jié)合400 μL單去污劑裂解液(含PMSF)加入勻漿器中進(jìn)行勻漿，然后離心5 min后，取上清置于-20 ℃。采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，以含5%脫脂奶粉的TBST 溶液室溫封閉2 h后加入一抗，室溫下孵育1～2 h后，PBS漂洗15 min，連續(xù)4次，同上法加入二抗，顯影后用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀況造模組：隨著造模時間延長，各組大鼠逐步開始出現(xiàn)活動少，反應(yīng)遲鈍，飲食少，毛發(fā)疏松無光澤，體質(zhì)量減輕等；模型對照組大鼠活動度減弱，進(jìn)食、飲水減少，體質(zhì)量減輕，毛色萎黃，大便性狀不一，時溏時常，取材時部分大鼠可見腹腔積液，下肢水腫；各給藥組較模型對照組大鼠更加活躍，癥狀恢復(fù)較好。結(jié)果表明，各給藥組均可明顯改善大鼠的生活質(zhì)量，減輕癥狀。

3.2 大鼠超聲心動圖與空白對照組比較，模型2周組、模型4周組、模型6周組大鼠EF無明顯差異(P>0.05)，模型8周組、模型10周組EF顯著性降低(P<0.05)，模型12周組、模型14周組、模型16周組EF極顯著性降低(P<0.01)。與空白對照組比較，模型2周組、模型4周組大鼠LVDd、LVDs無明顯差異(P>0.05)，模型6周組、模型8周組大鼠LVDd、LVDs顯著性升高(P<0.05)，模型10周組、模型12周組、模型14周組、模型16周組大鼠LVDd、LVDs極顯著性升高(P<0.01)。與模型對照組比較，聯(lián)合用藥組大鼠EF顯著性升高(P<0.05)，LVDs、LVMI顯著性降低(P<0.05)；貝那普利組LVDs、LVMI顯著性降低(P<0.05)；大劑量抗纖益心方組LVMI顯著性降低(P<0.05)。見表2、表3、表4。

表2 造模組各組左室射血分?jǐn)?shù)及左室內(nèi)徑比較

表3 各組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)及左室內(nèi)徑比較

表4 各組大鼠LVMI比較

3.3 比較各組大鼠心肌組織病理形態(tài)變化觀察造模組結(jié)果可以得出：造模成功后，隨著時間的延長心肌纖維排列逐漸紊亂、變形斷裂、間質(zhì)增生水腫等；觀察治療組結(jié)果可以得出：抗纖益心方及貝那普利治療后，心肌纖維排列及組織細(xì)胞形態(tài)均明顯改善。見圖1、圖2。

注：A：空白組；B：造模4周組；C：造模6周組；D：造模8周組；E：造模16周組圖1 造模各組大鼠心肌病理學(xué)損傷變化(HE染色，×200)

3.4 免疫組化檢測大鼠心?、裥湍z原、Ⅲ型膠原、TGF-β1的表達(dá)與模型對照組比較，大劑量抗纖益心方組、貝那普利組及聯(lián)合用藥組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及TGF-β1顯著降低(P<0.05)見表5，圖3、圖4、圖5。

注：A：模型對照組；B：小劑量抗纖益心方組；C：大劑量抗纖益心方組；D：貝那普利組；E：聯(lián)合用藥組圖2 各治療組大鼠心肌病理學(xué)變化(HE染色，×200)

表5 SP法測各組大鼠心肌內(nèi)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1表達(dá)

注：A：模型對照組；B：小劑量抗纖益心方組；C：大劑量抗纖益心方組；D：貝那普利組；E：聯(lián)合用藥組圖3 免疫組化檢測I型膠原(×400)

注：A：模型對照組；B：小劑量抗纖益心方組；C：大劑量抗纖益心方組；D：貝那普利組；E：聯(lián)合用藥組圖4 免疫組化檢測大鼠心?、笮湍z原變化(×400)

注：A：模型對照組；B：小劑量抗纖益心方組；C：大劑量抗纖益心方組；D：貝那普利組；E：聯(lián)合用藥組圖5 免疫組化檢測大鼠心肌TGF-β1變化(×400)

3.5 RT-PCR法檢測大鼠左心室TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7mRNA結(jié)果與空白對照組比較，模型4周組TGF-β1mRNA顯著升高(P<0.05)，模型6周組、模型8周組、模型10周組、模型12周組、模型14周組、模型16周組TGF-β1mRNA極顯著性升高(P<0.01)；模型6周組Smad7mRNA顯著降低(P<0.05)，Smad2mRNA、Smad3mRNA、Smad4mRNA顯著升高(P<0.05)，模型8周組、模型10周組、模型12周組、模型14周組、模型16周組Smad7 mRNA極顯著降低(P<0.01)，Smad2mRNA、Smad3mRNA、Smad4mRNA極顯著升高(P<0.01)。與模型對照組比較，小劑量抗纖益心方組Smad7mRNA顯著升高(P<0.05)；大劑量抗纖益心方組與貝那普利組TGF-β1mRNA、Smad2mRNA、Smad3mRNA、Smad4mRNA顯著降低(P<0.05)，Smad7mRNA顯著升高(P<0.05)；聯(lián)合用藥組Smad2mRNA、Smad3mRNA顯著降低(P<0.05)，TGF-β1mRNA、Smad4mRNA極顯著性降低(P<0.01)，Smad7mRNA極顯著升高(P<0.01)。見表6、表7。

表6 造模組大鼠左心室TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7基因表達(dá)變化

表7 治療組大鼠左心室肌TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7基因表達(dá)變化

3.6 Western Blot檢測大鼠左心室TGF-β1，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)結(jié)果與空白對照組比較，模型6周組TGF-β1顯著升高(P<0.05)，模型8周組、模型10周組、模型12周組、模型14周組、模型16周組TGF-β1極顯著性升高(P<0.01)；模型4周組Smad7顯著降低(P<0.05)，模型6周組、模型8周組、模型10周組、模型12周組、模型14周組、模型16周組Smad7極顯著降低(P<0.01)。與模型對照組比較，小劑量抗纖益心方組Smad7顯著升高(P<0.05)，TGF-β1顯著降低(P<0.05)；大劑量抗纖益心方組Smad7極顯著升高(P<0.01)，TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4顯著降低(P<0.05)；貝那普利組Smad7極顯著升高(P<0.01)，TGF-β1極顯著性降低(P<0.01)，Smad2、Smad3、Smad4顯著降低(P<0.05)；聯(lián)合用藥組Smad2、Smad3、TGF-β1、Smad4極顯著性降低(P<0.01)，Smad7極顯著升高(P<0.01)。見表8、表9及圖6、圖7。

表8 造模組大鼠左心室肌TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)值

表9 治療組大鼠左心室肌TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)值

圖6 各模型組大鼠左心室Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、TGF-β1蛋白表達(dá)

圖7 各給藥組大鼠左心室Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、TGF-β1蛋白表達(dá)

4 討論

擴(kuò)張型心肌病主要表現(xiàn)為心室擴(kuò)張以及收縮功能減弱，1985年美國某地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查顯示，DCM患病率為36.5/10萬；2002年中國分層整群抽樣調(diào)查顯示，DCM患病率約為19/10萬，且近幾年發(fā)病率仍逐漸升高，嚴(yán)重影響患者生命健康[5]。DCM病因復(fù)雜，感染、自身免疫及遺傳均可導(dǎo)致其發(fā)生[6]，雖然DCM的病因及發(fā)病機(jī)制尚待明確，但不管是由于病毒感染，還是家族遺傳，或者自身免疫反應(yīng)，又或其他因素所致，其發(fā)生發(fā)展過程中均會出現(xiàn)細(xì)胞間質(zhì)廣泛纖維化而致的心室重構(gòu)。

本研究通過灌胃呋喃唑酮水溶液制備DCM大鼠模型，與空白對照組比較，DCM模型組大鼠LVIDs、LVIDd升高，LVEF降低，心肌細(xì)胞形態(tài)破碎，排列疏松，出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤，說明DCM模型大鼠出現(xiàn)左心室的擴(kuò)張，收縮功能降低，且心肌組織伴有炎癥損傷，符合以往DCM模型典型特征[7]，提示DCM模型復(fù)制成功。

中醫(yī)認(rèn)為本病病機(jī)屬本虛標(biāo)實，多以氣虛為本，血瘀、水濕為標(biāo)[8]，故臨床多用益氣活血利水等方法[9]?？估w益心方是河南省中醫(yī)院心病科臨床治療DCM的經(jīng)驗方，研究表明其能有效的改善臨床患者的癥狀及心功能[10]，抗纖益心方中由黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、丹參等中藥組成，黃芪、黨參等益氣生血，茯苓健脾安神，白術(shù)補(bǔ)氣健脾，丹參活血化瘀，對于DCM氣虛下陷的癥狀有明顯改善[4]。王振濤[10-11]研究表明，抗纖益心方在改善擴(kuò)張型心肌病患者癥狀有明確的療效。曾垂義等[12]的臨床觀察表明，抗纖益心方在改善擴(kuò)張型心肌病患者心衰癥狀同時還能有效控制患者血壓。本研究結(jié)果顯示，與模型對照組比較，各抗纖益心方組大鼠射血分?jǐn)?shù)升高、左室內(nèi)徑及各室壁厚度降低、LVMI降低，提示抗纖益心方可有效改善DCM大鼠的心功能。

心室重構(gòu)中基礎(chǔ)的病變是多種因素引起的心肌組織纖維化[13]，在諸多要素中，TGF-β作為在促纖維化過程中不可或缺的因子，依據(jù)靶細(xì)胞的不同，TGF-β對細(xì)胞增殖分化表現(xiàn)出促進(jìn)或抑制的雙重作用[14]?，F(xiàn)已明確，TGF-β與細(xì)胞外基質(zhì)積淀有重要的聯(lián)系，在目前組織纖維化治療中常被選為作用靶點(diǎn)[15]，其在肺纖維化[16]、肝膽胰纖維化[17]、血管纖維化[18]、腎小管纖維化[19]等領(lǐng)域均有明確的研究證實其密切關(guān)系。與正常的心臟比較，TGF-β1在心肌纖維化進(jìn)程中活性顯著上升。TGF-β1一旦被釋放，與細(xì)胞表面活性受體結(jié)合后經(jīng)過一系列作用形成Smad2-Smad3-Smad4轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，然后進(jìn)入細(xì)胞核，這就是TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路[20]。多項研究表明，TGF-β/Smads信號通路的作用在心肌纖維化里有著顯著意義[21-22]。齊靜等[23]發(fā)現(xiàn)心衰大鼠左心室TGF-β1及Smad3表達(dá)上調(diào)，提示可能與心肌纖維化有關(guān)。張娟娟[24]發(fā)現(xiàn)，高血壓左心室肥厚患者血清中TGF-β1明顯高于健康人，且血清中的濃度與高血壓進(jìn)程正相關(guān)。李慶敏等[25]在對鐵皮石斛抑制心衰氣虛證大鼠心肌纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)其作用可能與鐵皮石斛下調(diào)Gal-3、TGF-β、Smad3蛋白表達(dá)有關(guān)。孟慧等[26]認(rèn)為，保元湯能通過調(diào)控TGF-β1來防治慢性心力衰竭。盡管已有多項研究表明，TGF-β1/Smads信號通路在心肌纖維化中發(fā)揮作用，但是在其發(fā)生發(fā)展過程中，此信號通路激活的時相性還不明確，該通路在心衰大鼠模型心肌纖維化的什么時間段開始被激活，在激活之后又能持續(xù)作用多長時間，這些對藥物的發(fā)揮效用有一定的作用。

本研究通過實驗發(fā)現(xiàn)觀察不同時間點(diǎn)DCM大鼠模型TGF-β1/Smads信號通路的表達(dá)，相關(guān)結(jié)果表明其在6周左右激活，8～10周進(jìn)入高峰期，12周后進(jìn)入平臺期，具有明確的時間節(jié)點(diǎn)。

本研究通過比較各組大鼠左心室TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7基因及蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與模型對照組比較，小劑量抗纖益心方組無顯著性差異、大劑量抗纖益心方及貝那普利組有顯著性差異、聯(lián)合用藥組有非常顯著性差異。

以上研究結(jié)果明確了DCM大鼠心肌纖維化過程中，TGF-β1/Smads信號通路在6周左右激活，于8～10周達(dá)到高峰期，12周后達(dá)到平臺期。而中藥復(fù)方抗纖益心方能夠有效地抑制擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌纖維化進(jìn)展，其作用機(jī)制與抑制心?、裥湍z原、Ⅲ型膠原、TGF-β1的表達(dá)，并進(jìn)一步激活Smads信號通道，上調(diào)Smad7蛋白表達(dá)以及下調(diào)Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)有關(guān)。使用中藥復(fù)方抗纖益心方及時盡早地干預(yù)擴(kuò)心病大鼠，能夠通過激活TGF-β/Smads信號通路充分有效地抑制DCM大鼠心肌纖維化進(jìn)展，聯(lián)用ACEI制劑效果更佳。這也表明在擴(kuò)張型心肌病患者的治療中抗纖益心方應(yīng)當(dāng)選擇合適的時間點(diǎn)及時介入。