職小飛，徐萍，張克清，李相中

1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院附屬安陽醫(yī)院，河南 安陽 455003； 2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 3.安陽市中醫(yī)院，河南 安陽 455003

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們暴露于各類射線的概率日益增加，受到輻射的概率也大為增加，因此尋求有效地防治輻射的藥物也日顯重要[1]。電離輻射是最常見的輻射，可以引起頭暈、乏力、食欲下降等免疫力低下的癥狀[2]。遠(yuǎn)志皂苷B為藥材遠(yuǎn)志中的化合物，具有抗衰老、抗抑郁、鎮(zhèn)靜、祛痰鎮(zhèn)咳、抗癌、抗誘變和增強(qiáng)免疫力等藥理作用[3-6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志皂苷B可以減輕電離輻射的損傷[7-8]，但其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。為進(jìn)一步探明遠(yuǎn)志皂苷B減輕電離輻射損傷的作用機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)擬采用電離輻射損傷小鼠模型，通過觀察胸腺組織中核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)抑制因子α (inhibitor of NF-κBα，IκBα)、p53、半胱氨酸蛋白酶-3 (caspase-3)的基因和蛋白表達(dá)水平，探究其減輕電離輻射損傷的作用機(jī)理。

1 材料

1.1 動(dòng)物120只SPF級雄性BALB/c小鼠，8～12周齡，體質(zhì)量為(25±2) g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2015-0018。小鼠飼養(yǎng)房內(nèi)恒溫(23±2) ℃、恒濕(濕度50%)，光照時(shí)間為800—2000，且動(dòng)物被允許自由攝食飲水。本研究所涉及的所有實(shí)驗(yàn)均按照中華人民共和國科技部發(fā)布的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例執(zhí)行。

1.2 藥物及試劑遠(yuǎn)志皂苷B(成都德思特生物技術(shù)有限公司，純度98.9%，批號：DY0088)。Trizol、Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：15596018、4367659)；Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連Takara公司，批號：9767)；IκBα兔抗鼠抗體、p-IκBα兔抗鼠抗體、p53兔抗鼠抗體、caspase-3兔抗鼠抗體、GAPDH抗體(德國Merck公司，批號：P36896、P11021、P29147、P42574、P04406)；羊抗兔二抗(武漢博士德生物公司，批號：20180211)；引物合成由南京金斯瑞生物科技公司完成。

1.3 儀器Practum型電子天平(德國SARTORIUS公司)；XFA6100型血球儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)；EnSight型多功能酶標(biāo)儀(美國PERKINELMER公司)；QIAxcel Advanced型核酸蛋白分析儀(德國Qiagen公司)；MyCycler型PCR擴(kuò)增儀、Gel Doc EZ型全自動(dòng)免染凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；Centrifuge 5418 R型離心機(jī)(Eppendorf公司，離心半徑：76 mm)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、模型建立及給藥適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將120只SPF級雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、遠(yuǎn)志皂苷B低劑量組和遠(yuǎn)志皂苷B高劑量組，每組30只。除空白組外，其他組小鼠根據(jù)參考文獻(xiàn)描述進(jìn)行全身一次性5.5 Gy γ射線照射3 h建立電離輻射損傷模型[9]。造模完成的第2天開始給藥，遠(yuǎn)志皂苷B低、高劑量組以10 mL·kg-1的體積分別灌胃給予10 mg·kg-1、20 mg·kg-1的遠(yuǎn)志皂苷B溶液，空白組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，持續(xù)給藥4周。小鼠飼養(yǎng)期間，記錄造模后及給藥期間體質(zhì)量的變化及動(dòng)物死亡數(shù)和死亡時(shí)間，每7天稱量1次小鼠的體質(zhì)量。

2.2 小鼠外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和胸腺系數(shù)檢測末次給藥結(jié)束后24 h，稱取體質(zhì)量，摘眼球取血，使用血球儀計(jì)數(shù)外周血淋巴細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算百分率。取血后頸部脫臼處死小鼠，取胸腺，分離脂肪和韌帶，擦干血水，稱取質(zhì)量，計(jì)算胸腺系數(shù)。

胸腺系數(shù)=胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量×100%

2.3 RT-PCR檢測胸腺中IκBαmRNA、p53mRNA、caspase-3mRNA的表達(dá)摘眼球取血后，頸部脫臼處死小鼠，取胸腺。Trizol法提取胸腺總mRNA，提取后用核酸蛋白儀檢測純度，純度為 1.8～2.2即合格；按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書操作完成后，置于PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：SYBR Green PCR Master Mix 25 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；dNTP 2 μL；cDNA模板2 μL；加入ddH2O使總體積達(dá)50 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，45個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。用2-△△Ct表示mRNA相對表達(dá)水平。使用Primer Premier 5 設(shè)計(jì)IκBα、p53、caspase-3及內(nèi)參GAPDH引物，序列見表1。

2.4 Western Bolt檢測胸腺內(nèi)IκBα、p-IκBα、p53、caspase-3蛋白表達(dá)量取胸腺組織50 mg，加蛋白裂解液，研磨，12 000 r·min-1離心30 min，取上清，使用BCA法檢測各組蛋白總量；加樣后使用10%凝膠，80 V電泳至分離后轉(zhuǎn)至120 V電泳至膠下緣，100 V 90 min轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶封閉2 h；分別加入IκBα、p-IκBα、p53和caspase-3一抗(稀釋比例為11 000)，置4 ℃冰箱過夜，洗膜，再加入二抗(稀釋比例為15 000)，洗膜，11配置ECL工作液顯影；置于凝膠圖像成像分析系統(tǒng)，曝光蛋白條帶，拍照并分析各組條帶灰度值。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠體質(zhì)量比較與空白組比較，第8天、第15天、第22天及第29天模型組小鼠體質(zhì)量顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，第8天、第15天、第22天及第29天遠(yuǎn)志皂苷B各給藥組小鼠體質(zhì)量均顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠不同時(shí)期體質(zhì)量變化比較

3.2 各組小鼠外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和胸腺系數(shù)比較與空白組比較，模型組小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞百分率和胸腺系數(shù)明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，遠(yuǎn)志皂苷B低劑量組小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)極顯著性升高(P<0.01)，淋巴細(xì)胞百分率和胸腺系數(shù)顯著升高(P<0.05)；遠(yuǎn)志皂苷B高劑量組小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)和胸腺系數(shù)顯著升高(P<0.05)，淋巴細(xì)胞百分率極顯著升高(P<0.01)。見表3。

表3 遠(yuǎn)志皂苷B對小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)及百分率、胸腺系數(shù)的影響

3.3 各組小鼠4周內(nèi)平均存活時(shí)間和生存率比較空白組小鼠4周內(nèi)無死亡，平均存活時(shí)間為 30 d，生存率為100%；模型組小鼠從第5天開始死亡，30 d內(nèi)死亡19只，平均存活時(shí)間為19.77 d，生存率為36.70%；遠(yuǎn)志皂苷B低劑量組小鼠從第7天開始死亡，30 d內(nèi)死亡15只，平均存活時(shí)間為24.30 d，生存率為50%；遠(yuǎn)志皂苷B高劑量組小鼠從第8天開始死亡，30 d內(nèi)死亡12只，平均存活時(shí)間為26.10 d，生存率為60%。與空白組比較，模型組小鼠平均存活時(shí)間和生存率均顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，遠(yuǎn)志皂苷B高劑量組的平均存活時(shí)間和生存率均顯著增加(P<0.05)。見圖1及表4。

表4 遠(yuǎn)志皂苷B對小鼠生存時(shí)間的影響

圖1 各組小鼠4周生存率比較

3.4 RT-PCR檢測結(jié)果比較與空白組比較，模型組小鼠胸腺中IκBαmRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，p53mRNA、caspase-3mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，遠(yuǎn)志皂苷B低劑量組小鼠胸腺中IκBαmRNA表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，p53mRNA、caspase-3mRNA表達(dá)水平極顯著性下降(P<0.01)；遠(yuǎn)志皂苷B高劑量組小鼠胸腺中IκBαmRNA表達(dá)水平極顯著性上升(P<0.01)，p53mRNA表達(dá)水平極顯著性下降(P<0.01)，而caspase-3mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。見表5。

表5 各組小鼠胸腺中IκBα、p-IκBα、p53、caspase-3的mRNA表達(dá)水平比較

3.5 Western bolt檢測結(jié)果比較與空白組比較，模型組小鼠胸腺中IκBα蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，而p-IκBα、p53、caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，遠(yuǎn)志皂苷B各劑量組小鼠胸腺中IκBα蛋白表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)，而p-IκBα、p53、caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。見表6和圖2。

表6 各組小鼠胸腺中IκBα、p-IκBα、p53、caspase-3蛋白表達(dá)水平比較

注：A：空白組；B：遠(yuǎn)志皂苷B高劑量組；C:遠(yuǎn)志皂苷B低劑量組；D:模型組圖4 各組小鼠胸腺中IκBα、p-IκBα、p53、caspase-3蛋白條帶圖

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為，免疫力屬于衛(wèi)氣范疇，而衛(wèi)氣源于腎陽，屬陽，腎為先天之本，一身陰陽之根本，故腎陽為衛(wèi)陽產(chǎn)生之根本，腎陽充足則衛(wèi)陽充足。周學(xué)海在《讀醫(yī)隨筆》中云：“衛(wèi)氣者，本于命門，達(dá)于三焦”[10-11]。中藥遠(yuǎn)志味苦、辛，性溫，歸心、肺、腎經(jīng)，具有安神益智、交通心腎、祛痰消腫等功效，臨床可治療失眠、健忘、咳嗽痰多、癰疽瘡毒等。遠(yuǎn)志性溫屬陽，歸腎經(jīng)，溫腎陽而增強(qiáng)衛(wèi)氣，具有提高免疫力的作用。遠(yuǎn)志皂苷B作為中藥遠(yuǎn)志的主要有效成分，具有多種藥理活性，其臨床應(yīng)用十分廣泛，可用于治療阿爾茨海默病、心腦血管疾病及癲癇等[12-13]；還可配茯神、龍齒等中藥，以化痰濕健脾，交通心腎，安神助眠[14-15]。此外，也有研究報(bào)道，遠(yuǎn)志皂苷有抗炎、提高免疫功能的作用[16-17]，但其具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

免疫功能低下是最常見的輻射損傷，患者常有乏力、倦怠、食欲低下、體質(zhì)量下降、精神不佳等癥狀，實(shí)驗(yàn)室檢查可發(fā)現(xiàn)，輻射損傷患者具有外周血淋巴細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞百分率和胸腺系數(shù)較低的表現(xiàn)[18-19]。胸腺是機(jī)體調(diào)節(jié)免疫功能的重要免疫器官，但其對輻射敏感度高，常受輻射損傷[20-21]。淋巴細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)特異性免疫細(xì)胞，同樣對輻射敏感[22-23]。輻射損傷后，淋巴細(xì)胞DNA合成障礙，從而引起淋巴細(xì)胞數(shù)量和百分率降低。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志皂苷B尤其是高劑量不僅可有效提高小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞百分率和胸腺系數(shù)，還可以延長小鼠4周內(nèi)存活時(shí)間，提高4周生存率。提示遠(yuǎn)志皂苷B對輻射損傷小鼠具有免疫保護(hù)作用。

NF-κB是體內(nèi)介導(dǎo)細(xì)胞增殖分化和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子[24]。正常情況下，NF-κB與IκB結(jié)合以無活性的二聚體滯留于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。淋巴細(xì)胞受損后，IκB發(fā)生磷酸化，與NF-κB解離，NF-κB解離后進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)而誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，而IκBα是IκB蛋白家族的主要成員，是 NF-κB 活化的敏感標(biāo)志之一[25]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠胸腺內(nèi)IκBαmRNA和蛋白表達(dá)水平較低，p-IκBα 蛋白表達(dá)水平較高，而遠(yuǎn)志皂苷B尤其是高劑量組IκBαmRNA和蛋白表達(dá)水平升高，p-IκBα 蛋白表達(dá)水平降低，說明遠(yuǎn)志皂苷B尤其是高劑量能抑制IκBα的磷酸化，從而抑制NF-κB的激活，這可能是其抑制電離輻射后淋巴細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

激活的NF-κB會上調(diào)許多促凋亡靶基因，其中p53是NF-κB介導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的靶基因之一，p53的活化會加重淋巴細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠胸腺內(nèi)p53mRNA和蛋白表達(dá)增高，遠(yuǎn)志皂苷B則能明顯抑制p53mRNA和蛋白的表達(dá)。細(xì)胞凋亡還受到caspases的調(diào)控，細(xì)胞凋亡最終都是通過激活caspases而實(shí)現(xiàn)的。caspase-3是caspases家族中最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶[26]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志皂苷B能明顯降低電離輻射損傷后胸腺中caspase-3的表達(dá)。

綜上所述，遠(yuǎn)志皂苷B可通過抑制胸腺組織中NF-κB的激活抑制電離輻射損傷后胸腺中淋巴細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對電離輻射損傷小鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。