梅蘭，郭陽(yáng)，張寧，傅盼盼，孫國(guó)鈞

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院和平院區(qū)，遼寧 沈陽(yáng) 110000； 2.大連市友誼醫(yī)院，遼寧 大連 116000

糖尿病腎病是糖尿病常見(jiàn)并發(fā)癥之一，其發(fā)病率逐年上升，已嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，隨著疾病進(jìn)展糖尿病腎病最終發(fā)展為終末期腎病。然而，糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞損傷可引起糖尿病腎病的發(fā)生，而足細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等均可誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷[1]。目前，臨床尚缺乏防治足細(xì)胞損傷的方法，既往研究顯示，中醫(yī)藥在抗氧化、抗炎及腎臟保護(hù)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[2-3]。葛根素為中藥葛根的主要成分，具有降血糖等作用，還可通過(guò)調(diào)控尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(recombinant nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4)的表達(dá)抑制糖尿病腎病的發(fā)展進(jìn)程[4]，但關(guān)于葛根素治療糖尿病腎病的分子機(jī)制尚未完全闡明。微小RNA(miRNA，miR)在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其可通過(guò)調(diào)控靶mRNA的表達(dá)參與足細(xì)胞損傷過(guò)程[5]。研究表明，miR-30e-5p在糖尿病腎病患者中表達(dá)水平降低，并可能參與糖尿病腎病的發(fā)生過(guò)程[6]?；诖?，本研究采用高糖誘導(dǎo)小鼠腎足細(xì)胞MPC5建立足細(xì)胞損傷模型，探討葛根素能否通過(guò)調(diào)控miR-30e-5p的表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，并初步探究其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞小鼠腎足細(xì)胞MPC5購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司(貨號(hào)：LHY2125)。

1.2 藥物與試劑葛根素(純度≥98%，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：20190203)；葡萄糖(北京酷來(lái)搏科技有限公司，批號(hào)：20190105)；Lipofectamine2000(南京信帆生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20190106)；Trizol試劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20190207)；miRcute 增強(qiáng)型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、Quant one step RT-qPCR 試劑盒(SYBR Green)(北京天根生化科技有限公司，批號(hào)：20190211、20181223)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京博邁斯科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20181215)；兔抗鼠半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific protease-3，caspase-3)抗體、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)抗體(美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：20190108、20190122、20190116)；兔抗鼠p62抗體、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ(microtubule-associated protein l light chain 3，LC3-Ⅱ)抗體、LC3-Ⅰ抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)：20190124、20190201、2019021、120190119)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：20190203)；miR-30e-5p寡核苷酸模擬物(miR-30e-5pmimics)及陰性對(duì)照序列(miR-NC)、miR-30e-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-30e-5p)及其陰性對(duì)照(anti-miR-NC)(廣州銳博生物科技有限公司，批號(hào)：20190132、20190136、20190096、20190138)；miR-30e-5p引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.3 儀器FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)；7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；DYY-7C型電泳儀電源、DYCZ-24DN型垂直電泳槽、DYY-12型電泳儀(北京六一儀器廠)；JY02S型紫外分析儀、JY-SPCT型水平電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；Nano-100型微量分光光度計(jì)(杭州奧盛儀器有限公司)；mμlISKANMK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；HI650型離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

2 方法

2.1 分組與干預(yù)MPC5細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105mL-1，接種于96孔板，每孔 100 μL，分為對(duì)照組、模型組、低劑量葛根素組、中劑量葛根素組及高劑量葛根素組。對(duì)照組加入含有濃度為5.5 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)液，模型組加入含有濃度為30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)液[7]，低、中、高劑量葛根素組分別加入含有30 mmol·L-1葡萄糖及不同劑量(1 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1)葛根素[8]的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。miR-NC、miR-30e-5pmimics轉(zhuǎn)染至MPC5細(xì)胞后，加入含有濃度為30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別記作miR-NC組、miR-30e-5p組。anti-miR-NC、anti-miR-30e-5p轉(zhuǎn)染至MPC5細(xì)胞，分別加入含有10 μmol·L-1葛根素與30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別記作高劑量葛根素+anti-miR-NC組、高劑量葛根素+anti-miR-30e-5p組。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取各組MPC5細(xì)胞加入預(yù)冷PBS洗滌，棄上清，加入500 μL緩沖液重懸細(xì)胞，參照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別加入Annexin V-FITC與PI，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

2.3 RT-qPCR檢測(cè)MPC5細(xì)胞中miR-30e-5p的表達(dá)水平采用Trizol法提取各組MPC5細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系：5×gDNA Buffer 2 μL，10×King RT Buffer 2 μL，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNA 2 μg，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。RT-qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至25 μL，應(yīng)用熒光定量PCR儀檢測(cè)miR-30e-5p相對(duì)表達(dá)量。miR-30e-5p正向引物序列：5′-GGGTGTAAACATCCTTGAC-3′，反向引物序列：5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6正向引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2.4 Western Blot檢測(cè)caspase-3、Bax、Bcl-2、p62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的蛋白表達(dá)量提取各組MPC5細(xì)胞總蛋白進(jìn)行定量，蛋白變性后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(vinylidene fluoride，PVDF)膜，使用5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗孵育(稀釋11 000)24 h，孵育二抗(稀釋比例13 000) 1 h，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值，并計(jì)算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。

3 結(jié)果

3.1 葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中劑量葛根素組、高劑量葛根素組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與中劑量葛根素組比較，高劑量葛根素組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡的影響

注：A：細(xì)胞凋亡流式圖；B：凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)圖圖1 葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡的影響

3.2 葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞自噬的影響與對(duì)照組比較，模型組p62蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中劑量葛根素組、高劑量葛根素組p62蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.05)；與中劑量葛根素組比較，高劑量葛根素組p62蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞自噬的影響

3.3 葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞中miR-30e-5p表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，模型組miR-30e-5p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中劑量葛根素組、高劑量葛根素組miR-30e-5p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與中劑量葛根素組比較，高劑量葛根素組miR-30e-5p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞自噬的影響

表3 葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞中miR-30e-5p表達(dá)的影響

3.4 過(guò)表達(dá)miR-30e-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡及自噬的影響與miR-NC組比較，miR-30e-5p組細(xì)胞凋亡率及caspase-3、Bax、p62蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表4。

注：A：細(xì)胞凋亡流式圖；B：凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)圖圖3 過(guò)表達(dá)miR-30e-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡及自噬的影響

表4 過(guò)表達(dá)miR-30e-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡及自噬的影響

3.5 干擾miR-30e-5p的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡及自噬的影響與高劑量葛根素+anti-miR-NC組比較，高劑量葛根素+anti-miR-30e-5p組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，caspase-3、Bax、p62蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表5。

注：A：細(xì)胞凋亡流式圖；B：凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)圖圖4 干擾miR-30e-5p能逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡及自噬的影響

表5 干擾miR-30e-5p能逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡及自噬的影響

4 討論

糖尿病腎病是引發(fā)終末期腎病的重要原因之一，目前臨床尚缺乏防治糖尿病腎病進(jìn)展的有效措施[9-11]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥可通過(guò)減輕足細(xì)胞損傷對(duì)糖尿病腎病的防治發(fā)揮作用[12-16]，也可通過(guò)調(diào)控多種基因或信號(hào)通路表達(dá)減緩糖尿病腎病的發(fā)展進(jìn)程[17-20]。因而，積極探尋新型糖尿病腎病的治療藥物并探究其可能作用機(jī)制，成為防治糖尿病腎病的新方向。

葛根素是葛根的主要成分，具有改善心腦血管循環(huán)、抑制心肌細(xì)胞凋亡等作用，可通過(guò)抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路抑制缺血再灌注所致的心肌細(xì)胞凋亡[21]，還可通過(guò)抑制線粒體解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)的表達(dá)保護(hù)2型糖尿病大鼠胰腺β細(xì)胞[22]，通過(guò)上調(diào)miR-155-3p的表達(dá)抑制髓樣分化因子(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)的表達(dá)從而減輕血管內(nèi)皮小細(xì)胞損傷[23]。本研究結(jié)果顯示，高糖處理后，足細(xì)胞凋亡率明顯提高，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[24]，提示高糖誘導(dǎo)可成功建立足細(xì)胞損傷模型。使用不同劑量的葛根素處理后，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡率明顯降低，caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，且呈劑量依賴(lài)性，提示葛根素可抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡從而減輕細(xì)胞損傷。自噬與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，自噬的主要過(guò)程為細(xì)胞將自身胞質(zhì)內(nèi)蛋白或細(xì)胞器包被后與溶酶體形成自噬小體進(jìn)而降解細(xì)胞，自噬發(fā)生時(shí)LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ，p62與LC3偶聯(lián)從而參與自噬過(guò)程[25]。本研究結(jié)果顯示，高糖處理足細(xì)胞后可明顯提高p62蛋白表達(dá)水平，降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，而葛根素可明顯降低p62的表達(dá)水平，提高 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，且呈劑量依賴(lài)性，提示葛根素可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬而調(diào)控細(xì)胞凋亡。

研究表明，miR-30e-5p可減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[26]。miR-30e-5p通過(guò)調(diào)控去整合素-金屬蛋白酶9(disintegrin-metalloproteinase 9，ADAM9)抑制血管緊張素II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中miR-30e-5p的表達(dá)水平降低，而葛根素可明顯提高miR-30e-5p的表達(dá)水平，提示葛根素可能通過(guò)促進(jìn)miR-30e-5p的表達(dá)減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。本研究進(jìn)一步分析顯示，miR-30e-5p過(guò)表達(dá)可明顯降低高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡率，抑制caspase-3、Bax、p62的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，并可提高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，提示miR-30e-5p過(guò)表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡從而減輕足細(xì)胞損傷。

綜上所述，葛根素可通過(guò)上調(diào)miR-30e-5p的表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡從而減輕細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬有關(guān)，為進(jìn)一步揭示葛根素治療糖尿病腎病的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。