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紫薯花青素大孔吸附樹(shù)脂的篩選

2022-08-17 06:59王世鵬范龍一
農(nóng)產(chǎn)品加工 2022年13期
關(guān)鍵詞:極性光度紫薯

王世鵬,王 巖,范龍一

(1.黑龍江省標(biāo)檢產(chǎn)品檢測(cè)有限公司,黑龍江 哈爾濱 150000;2.黑龍江省市場(chǎng)監(jiān)督管理審核查驗(yàn)中心,黑龍江 哈爾濱 150000)

花青素(Anthocyanidin) 又稱花色素,是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素,是花色苷水解而得有顏色的苷元[1]?;ㄇ嗨貙儆谏镱慄S酮物質(zhì),而黃酮物質(zhì)最主要的生理活性功能是自由基清除能力和抗氧化能力。紫薯(Ipomoea batatas(L.) Lam) 又稱紫甘薯,紫薯的活性成分主要包括花青素、糖蛋白、綠原酸、黃酮類、脫氫表雄酮和膳食纖維等[2],其所含花青素與葡萄皮等原料相當(dāng),其穩(wěn)定性又高于黑莓色素和葡萄皮等,是一種重要的天然色素,在食品行業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景[3]。研究表明,紫薯花青素對(duì)·OH、H2O2等活性氧均具有清除和抑制作用,尤其對(duì)·OH 的清除能力強(qiáng)于抗壞血酸,且清除作用與濃度呈劑量關(guān)系[4],具有抗氧化、清除自由基、抗突變、抗癌癥、抗心血管疾病、抗高血糖、改善肝功能等功效。

分離純化花青素的方法主要包括液相萃取法、柱層析法、固相萃取法、凝膠色譜法凝膠色譜、微生物發(fā)酵法、高速逆流色譜法、分子烙印技術(shù)等。其中,大孔吸附樹(shù)脂柱層析法具有吸附量大、效率高、成本低、可再生等優(yōu)點(diǎn)[5],目前已發(fā)展為從不同類型植物中提純花青素最為常用的分離純化方法之一,用于玫瑰茄、樹(shù)莓、紫甘藍(lán)和藍(lán)莓[6-7]等花青素的提取。孫倩怡[8]采用D3520 型大孔樹(shù)脂對(duì)藍(lán)莓花青素進(jìn)行分離純化,顯著提高了花青素純度。薛宏坤等人[9]利用大孔樹(shù)脂-Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠聯(lián)用技術(shù)從巨峰葡萄皮中獲得3種花色苷組分,并且純度都達(dá)到了90%以上。篩選出適于紫薯中花青素的分離純化的樹(shù)脂類型,并對(duì)其吸附和解析性能進(jìn)行研究,以期為紫薯在食品、藥品等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持,為工業(yè)化生產(chǎn)紫薯花青素提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料和試劑

紫薯,購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?;無(wú)水乙醇(試劑純)、鹽酸(試劑純)、氫氧化鈉(試劑純),西隴科學(xué)股份有限公司提供;AB-8 型大孔樹(shù)脂(非極性)、D101型大孔樹(shù)脂(非極性)、NKA-9 型大孔樹(shù)脂(非極性)、NKA-II 型大孔樹(shù)脂(非極性)、RAS80 型大孔樹(shù)脂(非極性)、RAS07 型大孔樹(shù)脂(非極性)、RAW16 型大孔樹(shù)脂(極性)、RAW01 型大孔樹(shù)脂(極性)、RAW19(H)型大孔樹(shù)脂(極性)、RAW92 型大孔樹(shù)脂(極性),天津南開(kāi)和成科技有限公司提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SPECORDR 210 PLUS 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),德國(guó)analytikjena 儀器有限公司產(chǎn)品;SD20 型pH計(jì),梅特多- 托樂(lè)多(上海) 儀器有限公司產(chǎn)品;BSA224S 型電子天平,德國(guó)Sartorius 公司產(chǎn)品;膠體磨,韜越(上海) 機(jī)械科技有限公司產(chǎn)品;HH-4型恒溫水浴鍋,上海力辰儀器科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫薯花青素浸提液制備

選取新鮮、無(wú)腐爛的紫薯→洗凈→切塊→磨漿(5%檸檬酸水溶液,料液比1∶15) →浸提(溫度55 ℃,時(shí)間2 h) →冷卻備用。

1.2.2 大孔樹(shù)脂預(yù)處理

先用無(wú)水乙醇浸泡24 h,使其充分溶脹,蒸餾水洗至無(wú)醇味兒為止;再用5%鹽酸浸泡12 h,蒸餾水洗至中性;5%氫氧化鈉浸泡12 h,蒸餾水洗至中性,室溫下晾干,備用。

1.2.3 靜態(tài)吸附能力的篩選

用電子天平分別稱取每種樹(shù)脂5 g,然后分別進(jìn)行裝柱編號(hào),吸取10 mL 備用的紫薯果浸提液勻速上樣,經(jīng)1 h 充分吸附后,分別收集樹(shù)脂流出液,于波長(zhǎng)542 nm 處分別測(cè)定各流出液的吸光度A1,并計(jì)算其吸附率α,篩選出高吸附率的樹(shù)脂。樹(shù)脂吸附率的計(jì)算公式如下:

式中:A0——提取液在波長(zhǎng)542 nm 處的吸光度;

A1——大孔樹(shù)脂充分吸附紫薯花青素后流出溶液的吸光度。

1.2.4 解析率的篩選

根據(jù)樹(shù)脂的靜態(tài)吸附率,初步選出對(duì)紫薯花青素吸附效果較好的大孔吸附樹(shù)脂,進(jìn)行解析力的篩選。分別使用30 mL 用70%乙醇溶液勻速洗脫已經(jīng)篩選出的樹(shù)脂,30 min 后分別收集流出液,于波長(zhǎng)542 nm 處分別測(cè)定其吸光A2,并根據(jù)下列公式計(jì)算其解析率δ,篩選出解析率較大的大孔吸附樹(shù)脂。解析率的計(jì)算公式如下:

式中:A2——吸附飽和的樹(shù)脂經(jīng)乙醇解析后流出液的吸光度。

1.2.5 上樣載量對(duì)大孔吸附樹(shù)脂吸附效果的影響

分別取10 mL 已經(jīng)篩選出的大孔吸附樹(shù)脂,分別進(jìn)行裝柱,用 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 BV(1 BV 為1 個(gè)樹(shù)脂床體積) 的紫薯花青素浸提液分別對(duì)不同的大孔樹(shù)脂進(jìn)行上樣吸附,分別收集不同載量條件下的流出液并定容至100 mL,于波長(zhǎng)542 nm 處測(cè)定其吸光度,并比較其最大的上樣載量大小。

1.2.6 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解析效果的影響

分別取5 g 已經(jīng)吸附飽和的篩選出的大孔吸附樹(shù)脂裝柱,分別設(shè)定30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100% 8 個(gè)洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù),分別用30 mL 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇在室溫條件下進(jìn)行解析,30 min 后分別收集流出液,稀釋一定倍數(shù),于波長(zhǎng)542 nm 處測(cè)定其吸光度。

1.2.7 樣品pH 值對(duì)大孔吸附樹(shù)脂吸附效果的影響

用鹽酸或氫氧化鈉溶液將pH 值為3.03 的紫薯浸提液配置成不同pH 值溶液,分別設(shè)為2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.5,然后分別取 10 mL 對(duì)篩選出的樹(shù)脂上樣吸附,1 h 充分吸附后,分別收集流出液,于波長(zhǎng)542 nm 處測(cè)定其吸光度。

1.2.8 使用次數(shù)對(duì)大孔吸附樹(shù)脂吸附效果的影響

分別用10 mL 紫薯浸提液對(duì)篩選出的3種大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行上樣吸附,經(jīng)1 h 充分吸附后,分別收集流出液,10 mL 定容,靜置10 min 后,分別于波長(zhǎng)542 nm 處測(cè)定其吸光試,再用70%乙醇溶液30 mL 洗脫大孔吸附樹(shù)脂,上述操作重復(fù)10 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附結(jié)果

10種大孔吸附樹(shù)脂的吸光度及吸附率見(jiàn)表1。

測(cè)得紫薯浸提液的吸光度A0=1.075。由表1 可知,當(dāng)紫薯浸提液上樣量為10 mL 時(shí),不同型號(hào)的大孔吸附樹(shù)脂對(duì)紫薯花青素吸附能力差異較大。根據(jù)大孔吸附樹(shù)脂吸附紫薯浸提液的吸光度越小,其吸附率越大,吸附效果越好。因此,篩選出吸附效果較好的 5種樹(shù)脂分別為 D101,AB-8,RAS07,NKA-II,RAS80,室溫下,5種大孔吸附樹(shù)脂吸附率均可達(dá)到90%以上。因?yàn)槲铰手饕c樹(shù)脂極性、溶液極性和大孔樹(shù)脂表面積等有關(guān)[10],篩選出的5種樹(shù)脂都為非極性樹(shù)脂,花青素類物質(zhì)屬于弱極性化合物,且有一定的極性和親水性,因此易被弱極性或非極性樹(shù)脂的吸附[11]。

表1 10種大孔吸附樹(shù)脂的吸光度及吸附率

2.2 大孔吸附樹(shù)脂解析率結(jié)果

5種大孔吸附樹(shù)脂的吸附率和解析率見(jiàn)表2。

表2 5種大孔吸附樹(shù)脂的吸附率和解析率

解析率也是衡量大孔吸附樹(shù)脂純化紫薯花青素性能的重要指標(biāo)[12],由表2 可知,當(dāng)上樣量為10 mL 時(shí),大孔吸附樹(shù)脂解析率大小為D101>AB-8>RAS80>RAS07>NKA-II。綜合吸附率和解析率2 個(gè)指標(biāo),從而篩選出3種對(duì)紫薯花青素浸提液吸附效果較好的大孔吸附樹(shù)脂:D101 型,AB-8 型,RAS80 型大孔樹(shù)脂,其解析率可達(dá)80%以上,D101 型樹(shù)脂的解析率達(dá)到了90%以上。

2.3 樣品上樣載量對(duì)大孔吸附樹(shù)脂吸附效果的影響

樹(shù)脂性能的優(yōu)劣除與吸附率、解析率有關(guān)外,還與其對(duì)有效成分的吸附載量密切相關(guān),也是制約其應(yīng)用于生產(chǎn)的重要因素。

樣品上樣載量對(duì)大孔吸附樹(shù)脂吸附效果影響見(jiàn)圖1。

圖1 樣品上樣載量對(duì)大孔吸附樹(shù)脂吸附效果影響

由圖1 可知,流出液的吸光值隨著上樣體積的增加逐漸增加,即篩選出的3種大孔樹(shù)脂對(duì)紫薯花青素吸附能力隨上樣體積增加而降低。當(dāng)流出液吸光度達(dá)到上樣紫薯花青素溶液吸光度1/10 時(shí),認(rèn)為已有花青素透出,即只要吸附后的流出液中出現(xiàn)紫薯花青素大孔樹(shù)脂就已達(dá)到最大吸附量。D101 型,AB-8 型,RAS80 型大孔樹(shù)脂的上樣液體積分別達(dá)7,9,8 BV 時(shí)樹(shù)脂已經(jīng)不能再吸附。由此可知,在大孔吸附樹(shù)脂柱體積相同的條件下,樹(shù)脂吸附紫薯花青素的能力是有限的且與上樣載量有關(guān)。一般最佳的上樣載量應(yīng)為2~4 BV。

2.4 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解析效果的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔吸附樹(shù)脂紫薯花青素解析率影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔吸附樹(shù)脂紫薯花青素解析率影響

由圖2 可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,解析率呈上升趨勢(shì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)AB-8 大孔吸附樹(shù)脂解析率最大;乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)D101 型大孔吸附樹(shù)脂解析率最大;乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)RAS80 型大孔吸附樹(shù)脂解析率最大,故分別用70%左右的乙醇解析大孔樹(shù)脂上吸附的紫薯花青素效果最好,很好地說(shuō)明大孔樹(shù)脂適合在水溶液中進(jìn)行吸附。

2.5 上樣液pH 值對(duì)大孔吸附樹(shù)脂的吸附效果影響結(jié)果

浸提液pH 值對(duì)3種大孔吸附樹(shù)脂吸附能力的影響見(jiàn)圖3。

圖3 浸提液pH 值對(duì)3種大孔吸附樹(shù)脂吸附能力的影響

不同類型大孔吸附樹(shù)脂在吸附時(shí)所要求的紫薯花青素浸提液最適pH 值也有所區(qū)別。由圖3 可知,在 pH 值 2.0~4.0,隨著 pH 值的升高 RAS80 型大孔吸附樹(shù)脂吸附紫薯花青素的吸附率逐漸增大;pH 值4.0 時(shí)吸附率最大;在pH 值4.0~5.5,隨著 pH 值的升高其吸附率急劇下降,可能是紫薯花青素在不同pH 值溶液中穩(wěn)定性不同所造成的[13]。所以當(dāng)粗提液pH 值增大時(shí),花青素的穩(wěn)定性下降,其吸附率發(fā)生變化。AB-8 型大孔吸附樹(shù)脂在pH 值2.5 和pH 值3.0 處吸附紫薯花青素的吸附率較高,且隨著pH 值的升高其吸附率幾乎不變化,因?yàn)樽鲜砘ㄇ嗨匾螂x子化趨勢(shì)而不易被吸附[14],但pH 值2.5 時(shí)花青素易水解,故選擇pH 值3.0。隨著pH 值的升高,D101型大孔吸附樹(shù)脂的吸附率逐漸減小,在pH 值2.5 和pH 值2.0 時(shí)吸附率較高,選擇pH 值2.0。

2.6 大孔吸附樹(shù)脂重復(fù)使用次數(shù)對(duì)其吸附效果影響的分析

3種大孔吸附樹(shù)脂重復(fù)使用次數(shù)對(duì)其吸附效果的影響見(jiàn)圖4。

圖4 3種大孔吸附樹(shù)脂重復(fù)使用次數(shù)對(duì)其吸附效果的影響

由圖4 可知,隨著使用次數(shù)的增加,紫薯浸提液經(jīng)3種大孔吸附樹(shù)脂吸附后流出液的吸光度逐漸增加,表明其吸附能力逐漸下降,樹(shù)脂性能變差。因?yàn)榇罂孜綐?shù)脂一般存在樹(shù)脂中毒的現(xiàn)象,在重復(fù)使用多次以后,其吸附能力會(huì)明顯減弱,引起中毒的原因有蛋白質(zhì)、多糖中毒等[15]。同時(shí),在使用第10 次時(shí)流出液的吸光度幾乎不變化,可以推斷出這3種大孔吸附樹(shù)脂在使用后需要再生。RAS80 型大孔吸附樹(shù)脂重復(fù)使用多次后吸光值相對(duì)于D101 型,AB-8 型大孔吸附樹(shù)脂變化較明顯,流出液的吸光度較大,表明其多次使用后吸附性減弱甚至消失,從經(jīng)濟(jì)方面考慮,不選擇RAS80 型大孔吸附樹(shù)脂吸附紫薯花青素。

3 結(jié)論

利用大孔吸附樹(shù)脂法分離純化紫薯花青素方便可行,大孔吸附樹(shù)脂吸附紫薯浸提液中的花青素后,再通過(guò)70%乙醇溶液洗脫,可得到純度較高的花青素,而且樹(shù)脂可循環(huán)再生,反復(fù)使用,既節(jié)約資源又降低成本,是分離和提取紫薯花青素的良好方法。通過(guò)對(duì)10種大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附、解析性、載量、使用次數(shù)等影響因素研究,篩選出適合純化紫薯中花青素吸附性和解析性較好的2種大孔吸附樹(shù)脂:AB-8 型和D101 型。利用AB-8 型和D101 型大孔吸附樹(shù)脂吸附時(shí),紫薯花青素浸提液pH 值應(yīng)控制在2.0~3.5,洗脫劑體積在70%左右,載量8,9 BV。不適合吸附紫薯花青素的8種大孔吸附樹(shù)脂:NKA-9 型,NKA-II 型,RAW01 型,RAW16 型,RAW19(H)型,RAW(92)型,RAS07 型,RAS80 型。

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