章偉慧，楊開勇

（1.江蘇民政康復(fù)醫(yī)院檢驗科，江蘇 南京 210000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院 整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023）

中晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者中，表皮生長因子受體（EGFR）突變可有效提高患者對免疫治療的應(yīng)答率，使患者從中受益[1-2]。 在肺癌中，EGFR 突變可誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡-配體1 （PDL1）上調(diào)[2]。 PD-L1 是一種免疫檢查點蛋白，在多種腫瘤細(xì)胞，包括NSCLC 表面上呈高表達(dá)，與T 細(xì)胞膜上受體PD-1 結(jié)合，抑制T 細(xì)胞的功能，誘使T 細(xì)胞耗竭[3]。 有多種分子機(jī)制參與PD-L1 的調(diào)控， 其中轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)扮演重要的角色。 MicroRNA(miRNA) 是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為18-25個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，主要參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控[4]。 MicroRNA-320a（miR-320a）在多種惡性腫瘤中均異常低表達(dá)，包括結(jié)直腸癌、乳腺癌和肺癌等[5-6]。此外，miR-320a 具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等多種生物學(xué)功能[5-6]。 例如，miR-320a 可抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖[6]。 然而，關(guān)于miR-320a 調(diào)節(jié)PD-L1 的表達(dá)以及免疫抑制尚無研究報道。 因此，研究miR-320a 靶向PD-L1 介導(dǎo)腫瘤免疫抑制及其分子機(jī)制， 為EGFR 突變的肺癌患者接受免疫治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460、A549、HCC827 和H1975 均來自于中科院上海細(xì)胞庫；RPMI1640、DMEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購自美國Gibco 公司； 胎牛血清購自上海依科賽公司；miR-320a 莖環(huán)結(jié)構(gòu)特異性逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、NC mimics 和miR-320a mimics 均購自廣州市銳博公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega 公司；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于上海翊圣公司； 人外周血淋巴細(xì)胞分離液購于天津市灝洋公司； 所有的引物和Trizol 總RNA 抽提試劑盒購自上海生工； 鼠抗PD-L1 單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；鼠抗GAPDH 單克隆抗體和HRP 標(biāo)記山羊抗兔或鼠IgG 二抗以及山羊抗鼠IgG H&L (Alexa Fluor594)紅色熒光二抗購自美國Abcam 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將H460、HCC827、H1975 和A549 細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 g/mL鏈霉素的RPMI1640 和DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)， 置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中， 取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3 共培養(yǎng)體系的建立 收集健康捐贈的外周血，分離出外周血單個核細(xì)胞（PBMCs），再給予5 μg/mL的植物血凝素（PHA）刺激活化后，在Transwell 中與已轉(zhuǎn)染miR-320a mimics 的H1975 細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，48 h 后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 MTT 法檢測細(xì)胞存活率 參照1.3 材料與方法，待共培養(yǎng)結(jié)束后，在鋪有H1975 細(xì)胞下層培養(yǎng)板每孔中加入MTT（終濃度為0.5 mg/mL），37 ℃反應(yīng)2 h，吸去上清后每孔加入100 L 二甲基亞砜，振蕩5 min， 置酶標(biāo)儀上于570 nm 處測定各孔吸光度值。

1.5 RT-PCR 和Real-time quantitative PCR 檢 測miR-320a 和PD-L1 的表達(dá) 收集細(xì)胞后， 按照Trizol 試劑說明書，提取總RNA。 使用PrimeScript RT Master Mix 試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。 RT-PCR：依據(jù)2×TSINGKE Mix 說明書操作。 PD-L1 正 向 引 物： TACTGTCACGGTTCCCAAGG；PD-L1 反 向 引 物： GGAGAGCTGGTCCTTCAACA。GAPDH 作內(nèi)參對照。GAPDH 正向引物： CCAGAACATCATCCCTGCCT；GAPDH 反向引物： - CCTGCTTCACCACCTTCTTG。

Real-time quantitative PCR： 參照2× SYBR green PCR mixture 的使用說明書進(jìn)行操作。 miR-320a 正向引物: AAAAGCTGGGTTGAGAGG，miR-320a 反向引物: AACATGTACAGTCCATGGATG；U6 作內(nèi)參對照。 U6 正向引物: CGCTTCGGCAGCACATATAC； 反 向 引 物 : TTCACGAATTTGCGTGTCAT。 PD-L1 （qRT-PCR） 正向GTGCCGACTACAAGCGAATT；PD-L1 （qRT-PCR）反向引物： CTTGGAATTGGTGGTGGTGG。

1.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測PD-L1 3’UTR的熒光素酶活性 運(yùn)用生物信息學(xué)網(wǎng)站TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_72/） 分析miR-320a與PD-L1 3’UTR 的結(jié)合位點序列， 構(gòu)建pGL3-PD-L1-wild type 和pGL3-PD-L1-mutant 的質(zhì)粒。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，通過Promega GloMax 20/20 發(fā)光檢測儀檢測熒光強(qiáng)度，隨后記錄并分析數(shù)據(jù)。

1.7 Western blot 檢測細(xì)胞內(nèi)PD-L1 的表達(dá) 將20 g 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜并封閉后，加入抗PD-L1 和GAPDH 抗體于4 ℃反應(yīng)過夜。 洗滌后，將膜和相應(yīng)二抗在室溫下反應(yīng)1 h，以ECL顯色后并以全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，以ImageJ 軟件分析各條帶灰度值。

1.8 Flow cytometry 檢測細(xì)胞膜上PD-L1 的表達(dá)收集細(xì)胞，用冰甲醇固定10 min 后，加入2BSA 封閉30 min，再加入抗PD-L1 抗體于4 ℃反應(yīng)過夜。洗滌后， 用相應(yīng)的紅色熒光二抗在室溫下孵育1 h，上流式細(xì)胞儀待測，以FlowJo VX10 軟件分析平均熒光強(qiáng)度值。

1.9 AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測細(xì)胞凋亡用binding buffer 清洗細(xì)胞， 用含有AnnexinV-FITC的binding buffer 重懸細(xì)胞，冰上暗處孵育15 min，再加PI 孵育5 min，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 miR-320a 和PD-L1 在HCC827 和H1975 細(xì)胞中的表達(dá)qRT-PCR 結(jié)果表明，與EGFR 野生型的H460 和A549 細(xì)胞相比，EGFR 突變型的HCC827 和H1975 細(xì)胞中的miR-320a 的水平呈相對低表達(dá)，見圖1A。 western blot 和RT-PCR 結(jié)果顯示， 與EGFR 野生型的H460 和A549 細(xì)胞相比，EGFR 突變型的HCC827 和H1975 細(xì)胞中的PD-L1 的mRNA 水平和蛋白水平均呈相對高表達(dá)，見圖1B—1C。

圖1 miR-320a 和PD-L1 在多種NSCLCs 細(xì)胞株中的表達(dá)

2.2 miR-320a 過表達(dá)后對HCC827 和H1975 細(xì)胞中PD-L1 表達(dá)的影響 qRT-PCR 結(jié)果表明，與NC mimics 相比，miR-320a mimics 明顯使HCC827 和H1975 細(xì)胞中PD-L1 mRNA 水平下調(diào)（圖2A—圖2B）。 此外，western blot 和flow cytometry 實驗結(jié)果也 表 明，miR-320a mimics 可 抑 制HCC827 和H1975 細(xì)胞中PD-L1 蛋白表達(dá)（圖2C—圖2D）。

圖2 miR-320a mimics 對HCC827和H1975 細(xì)胞中PD-L1 表達(dá)的影響

2.3 miR-320a 與PD-L1 3’UTR 結(jié)合可縮短PDL1 mRNA 的半衰期 應(yīng)用TargetScan 預(yù)測并找出含有miR-320a 結(jié)合位點的PD-L1 3’UTR 區(qū)序列為CAGCUUU (圖3A—圖3B)。 雙熒光素酶報告基因結(jié)果表明，miR-320a mimics 明顯抑制野生型PD-L1 3’UTR 的活性，而對突變型PD-L1 3’UTR的活性無明顯影響，見圖3C。 此外，半衰期結(jié)果表明，miR-320a 與PD-L1 3’UTR 結(jié) 合 可 縮 短PDL1 mRNA 的半衰期，見圖3D。

圖3 miR-320a 與PD-L1 3’UTR結(jié)合可縮短PD-L1 mRNA 的半衰期

2.4 miR-320a mimics 可抑制T 細(xì)胞的凋亡和降低H1975 細(xì)胞的存活率AnnexinV-FITC/ PI 雙染法結(jié)果表明，在活化的PBMCs 和H1975 細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，miR-320a mimics 可明顯抑制T 細(xì)胞的凋亡，見圖4A、4B—圖4C。 MTT 實驗結(jié)果顯示，miR-320a mimics 可顯著降低H1975 細(xì)胞的存活率。

圖4 miR-320a mimics 可抑制T 細(xì)胞的凋亡和降低H1975 細(xì)胞的存活率

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，miR-320a mimics 可抑制T細(xì)胞的凋亡和降低H1975 細(xì)胞的存活率， 提示miR-320a 可削弱腫瘤免疫抑制。此外，在EGFR 突變的HCC827 和H1975 細(xì)胞中，miR-320a 可抑制PD-L1 的表達(dá)， 其分子機(jī)制可能是miR-320a 與PD-L1 3’UTR 結(jié)合，從而縮短PD-L1 mRNA 半衰期導(dǎo)致的，見圖5。

圖5 miR-320a 調(diào)節(jié)PD-L1 表達(dá)的作用示意圖

NSCLC 患者接受免疫治療后可有效提升患者的治療效果，延長患者的生存率[1-2]。 由于大多數(shù)患者的肺癌組織中PD-L1 呈低表達(dá)， 不易被活化的T 淋巴細(xì)胞所識別殺傷， 從而影響免疫治療的效果[1-2]。 因此，找出適合免疫治療的標(biāo)志物指標(biāo)對指導(dǎo)肺癌患者使用免疫治療具有重要的臨床意義?；蛲蛔冐?fù)荷，包括EGFR 突變，可誘導(dǎo)PD-L1 高表達(dá)，從而使患者更好的受益于免疫治療[7-8]。 然而臨床上檢測肺癌組織中PD-L1 的表達(dá)或者其它相關(guān)基因突變，由于組織獲取較難且檢測周期較長，不利于患者及時治療， 故找出高效且易于檢測的標(biāo)志物指標(biāo)顯得尤為重要。 miRNAs 穩(wěn)定存在于血液和其他體液中， 可以作為諸如腫瘤等各種疾病的生物標(biāo)志物[9-11]。 例如，miR-141、miR-135b 和miR-92 等在前列腺癌患者的血清或者血漿中呈高表達(dá)[12-14]。 miR-320a 在胃癌、結(jié)腸癌和肺癌等患者的血漿中呈低表達(dá)[5-6]。 本研究也發(fā)現(xiàn)miR-320a 在EGFR 突變的HCC827 和H1975 細(xì)胞呈低表達(dá)（圖1A）。 有 趣 的 是， 在EGFR 突 變 的HCC827 和H1975 細(xì)胞PD-L1 卻呈高表達(dá)，見圖1B—圖1C，且miR-320a mimics 可抑制PD-L1 的表達(dá)， 見圖2。上述結(jié)果提示，miR-320a 可負(fù)性調(diào)節(jié)PD-L1 的表達(dá)。

由于miRNAs 通過與靶基因mRNA 分子的3’UTR 互補(bǔ)配對，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[5]，故推測miR-320a 調(diào)控PD-L1 表達(dá)可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。 為了驗證該猜想， 首先借助生物信息學(xué)工具TargetScan 預(yù)測miR-320a 與PD-L1 3’UTR 的結(jié)合位點，見圖3A，然后通過熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了miR-320a mimics 可抑制PD-L1 3’UTR 的報告基因活性，見圖3C。此外，miR-320a mimics 可抑制PD-L1 mRNA 的半衰期， 促進(jìn)PD-L1 的降解。 上述結(jié)果提示，miR-320a 抑制PD-L1 的表達(dá)，其分子機(jī)制可能是miR-320a 與PD-L1 3’UTR 結(jié)合，從而促進(jìn)PD-L1 的降解發(fā)生的。

PD-L1 是大小為40kDa 的一型跨膜蛋白，與其受體PD-1 結(jié)合后傳導(dǎo)抑制性的信號，抑制細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞的毒性，發(fā)揮免疫抑制性功能[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在活化的PBMCs 與H1975 細(xì)胞共培養(yǎng)的體系中，miR-320a 可降低H1975 細(xì)胞的存活率以及抑制PBMCs 細(xì)胞凋亡。 這些結(jié)果提示，miR-320a 調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞免疫抑制可能與PD-L1的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，miR-320a 削弱腫瘤免疫抑制可能與下調(diào)PD-L1 的表達(dá)有關(guān)， 其分子機(jī)制至少部分是通過與PD-L1 3’UTR 結(jié)合，從而促進(jìn)PD-L1 降解導(dǎo)致的。