單志鳴，楊俊梅，孫紅啟，李鐵威，成怡冰

（鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童醫(yī)院 鄭州兒童醫(yī)院 鄭州市兒童感染與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000）

手足口病 (Hand, foot and mouth disease,HFMD)是一種由腸道病毒感染引起的兒童常見(jiàn)感染性疾病，多累及2~5 歲兒童，手足口病主要的病原為腸道病毒柯薩奇病毒A 組16 型(CA16) 和腸道病毒71 型(EV71)等,典型臨床表現(xiàn)為口腔黏膜潰瘍性皰疹及四肢末端水皰樣皮疹, 此外，EV71常引起嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥, 如腦膜炎、腦炎、急性遲緩性癱瘓等[1-2]。 微小脫氧核糖核酸（microRNA）是一種19~22 個(gè)堿基的小分子RNA，大量研究表明其參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、病毒感染等多種生物學(xué)過(guò)程[3]，為了進(jìn)一步探討其在EV71感染過(guò)程中的功能,本研究我們通過(guò)分析基因綜合表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）[4]中EV71 感染后差異表達(dá)microRNAs，分析這些差異表達(dá)基因所參與的生物學(xué)過(guò)程，以及在EV71 感染過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的通路途徑，更好的揭示EV71 感染人體的更多分子機(jī)制，為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)，并為臨床診斷和治療提供有診斷和預(yù)后價(jià)值的標(biāo)志物以及治療的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI) 的公共數(shù)據(jù)庫(kù)GEO 中以“EV71”“microRNA”檢索,對(duì)檢索結(jié)果按照如下標(biāo)準(zhǔn)篩選：（1）至少3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)；（2）研究設(shè)計(jì)有對(duì)照組。篩選后得到microRNA 芯片數(shù)據(jù)集GSE57372，其包含EV71感染人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29 組和對(duì)照組共6 個(gè)樣本， 芯片分析平臺(tái)為Affymetrix 多物種miRNA-2芯片。

1.2 篩選差異表達(dá)基因 用在線分析工具GEO2R對(duì)miRNA 矩陣作差異表達(dá)分析， 設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)為： 感染組與對(duì)照組相比差異倍數(shù)2 倍以上，P 值小于0.05（Log FC>1, P<0.05）。

1.3 差異miRNA 聚類分析 對(duì)符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的差異miRNA 在TAM2.0 網(wǎng) 站（http://www.lirmed.com/tam2）[5]作功能聚類分析， 該網(wǎng)站可以對(duì)上傳的miRNA 列表作生物學(xué)功能和相關(guān)疾病聚類富集分析。

1.4 差異表達(dá)miRNA 關(guān)鍵靶基因篩選和互作關(guān)系圖構(gòu)建 對(duì)得到的差異表達(dá)的miRNA 按照上調(diào)和下調(diào)分別在mirTarBase v6.0（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）[6]作靶基因預(yù)測(cè)，將靶基因列表在STRING 在線分析網(wǎng)站(http:// www.stringdb.org)[7]分別作蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）構(gòu)建， 通過(guò)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)分析靶基因的蛋白互作關(guān)系，篩選條件為：互作得分＞0.4，將結(jié)果文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件[8]，用Cytohubba 插件分別篩選MCC 等級(jí)排名前10 的關(guān)鍵基因； 接下來(lái)在Cytoscape 中構(gòu)建差異miRNA 和關(guān)鍵基因的互作關(guān)系圖。

1.5 差異miRNA 表達(dá)水平驗(yàn)證 下載數(shù)據(jù)集GSE45816 結(jié)果文件， 將差異miRNA 的表達(dá)水平導(dǎo)入GraphPad Prism 8.3, 對(duì)感染組和對(duì)照組表達(dá)水平以柱狀圖顯示。

2 結(jié)果

2.1 感染組與對(duì)照組差異基因 用GEO2R 分析得到106 個(gè)差異表達(dá)miRNA，78 個(gè)表達(dá)上調(diào)，28 個(gè)表達(dá)下調(diào)，以Log FC>1，P<0.05 為條件篩選，并將探針對(duì)照平臺(tái)注釋文件后得到人源miRNA 分子11 個(gè)，其中7 個(gè)上調(diào)，4 個(gè)下調(diào)，見(jiàn)表1。

2.2 差異miRNA 聚類分析 生物功能聚類結(jié)果顯示差異miRNA 主要富集在膠原形成、細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、細(xì)胞黏附、固有免疫、神經(jīng)元凋亡、細(xì)胞死亡等功能過(guò)程，疾病聚類主要有慢性乙肝、流感、腺病毒感染等感染性疾病以及肺源性高血壓、 大腦缺血等心血管疾病， 還有克羅恩病和獲得型免疫缺陷等免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病，見(jiàn)表2。

表2 miRNA 生物學(xué)功能和相關(guān)疾病聚類富集分析結(jié)果

2.3 miRNA 靶基因富集分析和關(guān)鍵靶基因-miRNA 互作關(guān)系圖 通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)，7 個(gè)上調(diào)miRNA 靶基因380 個(gè)，4 個(gè)下調(diào)miRNA 靶基因210個(gè)，將靶基因構(gòu)建PPI 互作網(wǎng)絡(luò)及富集分析（通路的富集分析），見(jiàn)表3。 結(jié)果文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件， 用Cytohubba 插件分別篩選MCC 等級(jí)排名前10 的關(guān)鍵基因，見(jiàn)表4；差異miRNA 和關(guān)鍵基因的互作關(guān)系顯示miR-29b-3p、miR-455-5p、miR-30c-1-3p、miR-149-3p、miR-483-5p、miR-320c、miR-2861 等7 個(gè)miRNA 起核心作用 （菱形為上調(diào)，三角形為下調(diào)，橢圓形為靶基因）見(jiàn)圖1—圖2。

圖1 上調(diào)miRNA 與靶基因調(diào)控關(guān)系圖

圖2 下調(diào)miRNA 與靶基因調(diào)控關(guān)系圖

表3 靶基因通路的富集分析結(jié)果

表4 MCC 等級(jí)排名前10 的關(guān)鍵基因

2.4 差異miRNA 表達(dá)水平驗(yàn)證 GSE45816 為EV71 感染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤的miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)，將差異列表的miRNA 在其中的表達(dá)量導(dǎo)入GraphPad,柱狀圖結(jié)果顯示，所有miRNA 的表達(dá)水平在感染組和對(duì)照組均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）,但是與對(duì)照組相比，miR-320c 和miR-149-3p 的表達(dá)水平升高，miR-29b-3p 和miR-30c-1-3p 表達(dá)水平降低，見(jiàn)圖3。

圖3 差異miRNA 在GSE45816 中表達(dá)水平

3 討論

手足口病作為兒童感染性疾病， EV71 是引起手足口病最常見(jiàn)的致病病毒之一， 常引起重癥手足口患兒發(fā)生無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫等嚴(yán)重并發(fā)癥， 嚴(yán)重威脅著兒童的身體健康[9]。 miRNA 作為一種非編碼RNA,可以參與基因調(diào)控的多個(gè)環(huán)節(jié)， 最普遍的功能為通過(guò)剪輯互補(bǔ)配對(duì)的方式靶向結(jié)合基因的3’ 端的非翻譯區(qū)，依賴一些結(jié)合蛋白形成復(fù)合物調(diào)節(jié)靶基因， 可促使靶基因降解而不能發(fā)揮功能，此外，一些臨床相關(guān)性研究也發(fā)現(xiàn)miRNA 對(duì)于疾病的診斷和治療也具有潛在的重要意義[3]。 隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展， 依托其研究疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的基因表達(dá)分析越來(lái)越成熟， 在探索疾病的相關(guān)分子機(jī)制和診斷方面發(fā)揮了重要作用, 伴隨對(duì)疾病研究的深入， 將對(duì)篩選疾病的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

本研究通過(guò)分析EV71 感染和正常組的差異表達(dá)miRNA, 得到106 個(gè)差異表達(dá)miRNA，78 個(gè)表達(dá)上調(diào)，28 個(gè)表達(dá)下調(diào)，以差異2 倍以上和P 值小于0.05 為篩選條件， 并將探針對(duì)照平臺(tái)注釋文件后進(jìn)一步綜合分析得到人源miRNA 分子11個(gè)，其中7 個(gè)上調(diào)，4 個(gè)下調(diào)，為了研究這些分子可能參與EV71 感染調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程， 對(duì)差異的miRNA 在TAM2.0 網(wǎng)站作生物學(xué)功能和相關(guān)疾病聚類富集分析， 結(jié)果顯示這些差異表達(dá)的miRNA生物功能聚類主要富集在膠原形成、 細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、細(xì)胞黏附、固有免疫、神經(jīng)元凋亡、細(xì)胞死亡等， 疾病聚類主要有流感等病毒感染性疾病以及肺源性高血壓、 大腦缺血等心血管疾病，EV71 病毒感染后患者機(jī)體免疫系統(tǒng)激活， 進(jìn)入體內(nèi)的病毒被模式識(shí)別受體識(shí)別， 啟動(dòng)機(jī)體固有免疫發(fā)揮作用清除病毒DNA， 病毒的一些蛋白也會(huì)通過(guò)影響體內(nèi)的一些蛋白發(fā)揮效應(yīng)功能， 進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌，因此免疫系統(tǒng)在EV71 病毒和宿主的相互對(duì)抗過(guò)程具有重要的調(diào)節(jié)作用[9]；EV71 感染后，常常會(huì)引起重癥患兒的神經(jīng)源性肺水腫，造成患者缺血缺氧加重病情，與富集分析結(jié)果相符合，miRNA 主要通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶基因來(lái)發(fā)揮功能，通過(guò)對(duì)靶基因的富集分析發(fā)現(xiàn)， 靶基因富集通路有缺氧誘導(dǎo)因子1 信號(hào)通路、 凋亡和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等靶基因通路富集， 同樣也驗(yàn)證了上述結(jié)果，因此，這些差異miRNA 可能主要通過(guò)參與調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子通路、 凋亡和氧化應(yīng)激參與EV71 感染發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

缺氧誘導(dǎo)因子-1 普遍存在于人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)， 正常情況下有表達(dá)很快會(huì)被細(xì)胞內(nèi)氧依賴性泛素蛋白酶降解途徑所降解， 缺氧時(shí)才會(huì)穩(wěn)定表達(dá)，可以作為感染性疾病的藥物治療靶點(diǎn)[10]。 研究顯示干擾HIF-1α 基因表達(dá)后，通過(guò)信號(hào)傳遞減少了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子合成， 表明其參與血管新生和組織細(xì)胞增殖分化的生物過(guò)程[11]，還可以增強(qiáng)甲型流感病毒和人類缺陷病毒的復(fù)制，增加2 型肺泡上皮細(xì)胞的自噬，促進(jìn)血管外基炎癥的發(fā)生[12-13]。EV71 感染后通過(guò)激活整合素及血管生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)促炎因子分泌， 還會(huì)損傷線粒體而導(dǎo)致活性氧累積，持續(xù)的活性氧增加可以損傷線粒體，過(guò)度累積直接或者間接激活NF/KB 和p38 等信號(hào)通路，增加下游的多個(gè)促炎因子生成[14]，活性氧的增加除了促進(jìn)白介素1B 和白介素6 等促炎因子分泌外，還可促使細(xì)胞發(fā)生凋亡[15]，EV71 3C 蛋白可裂解RNP 結(jié)合蛋白A1，從而破壞其與下游干擾素誘導(dǎo)基因的結(jié)合激活細(xì)胞凋亡[16]，另一研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)EV71 病毒的2A 蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起到了驅(qū)動(dòng)作用[17]。富集分析結(jié)果表明差異miRNA 在EV71 感染的過(guò)程中主要通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α、 細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等信號(hào)通路參與感染的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程， 進(jìn)一步我們分別將上調(diào)和下調(diào)miRNA 分子的靶基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)， 使用Cytoscape 的Cytohubba 插件篩選MCC 等級(jí)排名前十的靶基因，根據(jù)靶基因與miRNA 調(diào)節(jié)關(guān)系構(gòu)建了互作關(guān)系圖， 表明miR-29b-3p 和miR-320c 等7 個(gè)miRNA 可能發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用， 外部驗(yàn)證結(jié)果顯示雖然感染前后表達(dá)差異水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 但與對(duì)照組相比，miR-320c 和miR-149-3p的表達(dá)水平是升高的，miR-29b-3p 和miR-30c-1-3p 表達(dá)水平是降低，進(jìn)一步證明這4 個(gè)miRNA可能發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，之前的研究[18]發(fā)現(xiàn)在CA16 感染后miR-149-3p 可能通過(guò)下調(diào)表達(dá)而減少對(duì)靶基因的抑制導(dǎo)致感染后的一些病理過(guò)程，與本研究的結(jié)果不一致， 有待深入研究，miR-320c、miR-29b-3p 和miR-30c-1-3p 與手足口病的關(guān)系為首次報(bào)道， 我們的結(jié)果表明它們可能通過(guò)調(diào)節(jié)感染過(guò)程中的細(xì)胞凋亡和促炎反應(yīng)介導(dǎo)宿主與EV71 病毒作用，具體的分子機(jī)制有待本課題進(jìn)一步研究。

綜上， 通過(guò)分析EV71 感染與否得到的差異miRNA 分子，顯示其主要通過(guò)HIF-1α、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等信號(hào)通路調(diào)節(jié)感染發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程，miR-320c、miR-149-3p、 miR-29b-3p、miR-30c-1-3p 在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用， 可為未來(lái)本課題研究詳細(xì)分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。