李香香, 冉 青, 毛 敏, 辛國(guó)鵬, 劉信平

(湖北民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 恩施 445000)

近年來(lái),研發(fā)促修復(fù)、抗菌抗腫瘤的功能性骨修復(fù)材料是人工植骨臨床應(yīng)用關(guān)注的熱點(diǎn)。自固化可注射的磷酸鈣骨水泥(CPC)以其良好的生物相容性、骨誘導(dǎo)性成為應(yīng)用潛力巨大的植骨材料。但隨著臨床應(yīng)用的深入,這類(lèi)材料存在降解速度較自體骨生長(zhǎng)慢而使新骨生長(zhǎng)受限、機(jī)械強(qiáng)度較差、水化時(shí)的放熱促使周?chē)鷻C(jī)體組織炎癥、無(wú)術(shù)后抗腫瘤復(fù)發(fā)能力等嚴(yán)重缺陷[1-2]。為改善CPC材料的不足性能,學(xué)者們進(jìn)行了大量的改性研究。通過(guò)向材料中摻入藥物如強(qiáng)力霉素、多巴胺、頭孢等[3-5],發(fā)揮靶向藥物的抗炎癥、防止癌細(xì)胞復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的功能。通過(guò)添加微量元素(如Sr2+、 Mg2+和 Zn2+)、絲素蛋白和殼聚糖等易降解促新骨生長(zhǎng)的聚合物、纖維以及石墨烯等功能性物質(zhì)[6-8],改善其力學(xué)強(qiáng)度、骨修復(fù)性能。

20世紀(jì)隨著人們對(duì)元素硒廣泛生物學(xué)活性功能認(rèn)識(shí)的深入,近年來(lái)有研究證實(shí),硒與骨骼健康密切相關(guān)[9-10]。含硒骨材料不僅能抗菌抗腫瘤、促新骨生長(zhǎng)[11-12],還能降低一些藥物(如抗生素、順鉑)對(duì)骨骼的侵害,保護(hù)骨骼[13-14]。Wang等[15]合成了3D多孔層狀SeHAN/CS復(fù)合材料,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示表明,缺損骨處新骨組織血管的形成優(yōu)于HAN/CS材料,更優(yōu)于純HA。硒涂層于植骨材料表面的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,硒含量適當(dāng)時(shí)能促成骨細(xì)胞形成,防止細(xì)菌感染,抑制腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)和增殖[16]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,將含硒材料與正常成骨細(xì)胞和骨腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí),材料能促進(jìn)正常細(xì)胞增殖,同時(shí)又表現(xiàn)出對(duì)骨腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用[17]。

含硒骨材料在骨腫瘤術(shù)后抗感染、預(yù)防腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)方面具有良好應(yīng)用前景。硒化物中抑癌作用最強(qiáng)的是無(wú)機(jī)形態(tài)Na2SeO3,因此,可通過(guò)不同機(jī)制誘導(dǎo)肺癌、胃癌、胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡,能有效清除氧自由基的侵害,對(duì)放化療有保護(hù)作用[18]。目前,含硒骨材料的研究尚處于初級(jí)階段。與人體其它功能性元素一樣,硒作為一把雙刃劍[19-20],適量有益,偏低效果差、超量而引發(fā)硒中毒,控量成為硒廣泛應(yīng)用的瓶頸,因此,硒如何緩慢、長(zhǎng)時(shí)地釋放有效作用濃度成為筮待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。以殼聚糖(CS)、明膠等高分子聚合物為壁材制備的載藥緩釋膠囊實(shí)現(xiàn)了藥物控劑的靶向療法,以其安全穩(wěn)定性成為臨床應(yīng)用的主導(dǎo)趨勢(shì)[21-22]。本研究結(jié)合CS和海藻酸鈉(SA)優(yōu)良的載藥性能及利于機(jī)體修復(fù)、硒元素的抑菌抗癌等生物活性功能,制備N(xiāo)a2SeO3-SA/CS緩釋硒微球,并將一定量微球摻入α-CPC中制得Na2SeO3-SA/CS微球/α-TCP基復(fù)合骨水泥,并對(duì)復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)和基本性能進(jìn)行表征和測(cè)試,考察了其對(duì)MG63細(xì)胞增殖的抑制性能,以期使功能性硒元素在骨修復(fù)時(shí)能長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)緩慢地釋放有效作用濃度,改善CPC的降解性、強(qiáng)度、骨修復(fù)性能,為臨床上術(shù)后所需的促進(jìn)新骨形成、防止腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移以及抗炎癥的優(yōu)良植骨材料的選擇提供一種新思路,同時(shí)奠定必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Nicolet Avatar 370型紅外光譜分析儀(KBr壓片);SHIMADZU XRD-7000型射線(xiàn)衍射儀;PerkinElmer DE-6300型綜合熱分析儀;Malvern Nano-ZS型馬爾文激光電位粒度儀。

肉骨瘤MG63細(xì)胞、殼聚糖(CS,脫乙酰度>90%)、海藻酸鈉(SA)、亞硒酸鈉、硝酸鈣、磷酸氫鈣(DCPD)、檸檬酸、碳酸鈣。試劑均為AR或GR。

1.2 Na2SeO3-SA/CS微球制備

A液制備：1.00 g Na2SeO3溶于100.00 mL去離子水,再加入0.10 g海藻酸鈉(SA),攪拌至充分溶解,待用。

B液制備：磁力攪拌下,將1.00 g殼聚糖(CS)溶于100.00 mL 2%醋酸液中。

Na2SeO3-SA/CS微球制備：將盛有50.00 mL石蠟油(5% Span80)的燒杯置于65 ℃的恒溫水浴鍋中。在持續(xù)磁力攪拌環(huán)境下,用注射器吸取10.00 mL A液以2 mL/min的滴速加到油相中,待A液滴加完全,繼續(xù)攪拌30 min。用注射器以2.00 mL/min的滴速將10.00 mL B液緩慢加入反應(yīng)液中,滴加完畢后攪拌30 min,再緩慢滴加0.50 mL 12.5%的戊二醛交聯(lián)1 h,加入10.00 mL丙酮靜置10 min，破乳,離心得沉淀物。分別用無(wú)水乙醚和無(wú)水乙醇洗滌產(chǎn)物至濾液澄清,并將濾餅于40 ℃干燥箱烘干制得Na2SeO3-SA/CS微球。

樣品微波消解,用AFS-9760雙道原子熒光儀測(cè)其中硒含量,設(shè)定載氣流量為300 mL/min,屏蔽氣流量為800 mL/min,輔陰極燈電流為35 mA。樣品平行測(cè)定3次,由公式(1)、 (2)計(jì)算微球的包封率和載藥量：

包封率=M微球中硒質(zhì)量/M投入硒質(zhì)量×100%

(1)

載藥量=M微球中硒質(zhì)量/M微球質(zhì)量×100%

(2)

1.3 Na2SeO3-SA/CS/α-CPC的制備

α-TCP制備：配制0.15 mol/L Ca(NO3)2·4H2O、 0.10 mol/L (NH4)2HPO4溶液各1 L。在磁力攪拌下,將Ca(NO3)2·4H2O溶液逐滴加入到(NH4)2HPO4溶液中,加入完畢,氨水調(diào)pH=7左右。繼續(xù)攪拌4 h，將其置于37 ℃水浴鍋中陳化1 d,抽濾，先后用去離子水和無(wú)水乙醇洗滌,并于80 ℃烘箱烘干,轉(zhuǎn)移產(chǎn)品至坩堝并在馬弗爐中高溫煅燒,升溫程序以6 ℃/min的速度先升至1000 ℃,再以4 ℃/min的速率升到1300 ℃,并在此溫度下保持2 h后迅速取出急冷,干燥環(huán)境中保存產(chǎn)品備用。

α-CPC制備：為增強(qiáng)α-TCP的抗壓強(qiáng)度,常需添加增強(qiáng)劑制得CPC,以此改善材料的不足[23]。本實(shí)驗(yàn)將制得的α-TCP用無(wú)水乙醇濕法球磨一定時(shí)間后,將其與球磨過(guò)篩后的DCPD和CaCO3粉末按照摩爾物質(zhì)的量比為10.0 ∶0.5 ∶0.5混均磨勻制得α-CPC粉體。

Na2SeO3-SA/CS/α-CPC復(fù)合骨水泥的制備：稱(chēng)取一定量Na2SeO3-SA/CS微球,加入到α-CPC粉體中混均,加入固化液快速調(diào)和成牙膏狀、填入模具(φ=10 mm×10 mm)、加壓排氣泡、脫模得圓柱體試樣。將試樣于37 ℃、 95%相對(duì)濕度環(huán)境中干燥1 d,制得的Na2SeO3-SA/CS/α-CPC基復(fù)合骨水泥。

1.4 體外細(xì)胞活性試驗(yàn)

采用CCK-8法[24-25]測(cè)定Na2SeO3-SA/CS/α-CPC復(fù)合骨水泥對(duì)肉骨瘤MG63細(xì)胞增殖的抑制作用。

待測(cè)樣液：將復(fù)合骨水泥材料浸泡于37 ℃ SBF模擬液中,緩釋液緩釋時(shí)間分別為0.5、 1、 5、 10和50 h,采用0.2 μm微孔的濾膜過(guò)濾除菌。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肉骨瘤MG63細(xì)胞,經(jīng)2.5 mg·mL-1胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),將細(xì)胞濃度調(diào)至4.375×104個(gè)/mL,并以每孔200 μL接種于96孔板里,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待取出后,吸去培養(yǎng)液,取緩釋不同時(shí)間段的200 μL樣液加到96孔板中,各試樣均設(shè)復(fù)孔3個(gè),將孔板置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、 48和72 h,每孔加入CCK-8試劑20 μL,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育40 min。取出后，采用酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度,各試樣對(duì)人骨肉瘤MG-63生長(zhǎng)的抑制率由公式(3)計(jì)算：

抑制率=[(Ab-Aa)/(Ab-Ac)]×100%

(3)

式中Aa為實(shí)驗(yàn)孔吸光度,Ab為對(duì)照孔吸光度,Ac為空白孔吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 α-TCP球磨時(shí)間對(duì)α-CPC性能的影響

(1) 粒徑的影響

采用Nano-ZS測(cè)量樣品的粒徑、球磨時(shí)間對(duì)α-TCP粒徑的影響如圖1所示。由圖1可知,α-TCP粉體粒徑隨球磨時(shí)間的增長(zhǎng)呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)。球磨時(shí)間為4 h時(shí),粉體的平均粒徑最小為116 nm,這可能是4 h前為球磨初期,粉體間、球磨球間、球磨球與粉體間、磨球罐壁間的快速碰撞,粉體迅速分裂、破損致使α-TCP粉體的粒徑減小至116 nm,此時(shí)微納級(jí)別的α-TCP顆粒間接觸面積大,表面能較大,若繼續(xù)球磨,反而促使α-TCP顆粒間隨著碰撞重新焊合,導(dǎo)致部分顆粒粗化,使得α-TCP粉體的粒度又逐漸增大。

Time/h圖1 α-TCP球磨時(shí)間對(duì)其粒徑的影響Figure 1 Effect of α-TCP ball milling time on its particle size

(2) 固化時(shí)間的影響

球磨時(shí)間對(duì)α-CPC初凝(IT)和終凝(FT)時(shí)間的影響如圖2所示。由圖2可知,不同球磨時(shí)間的α-TCP基粉體制得的α-CPC骨水泥的IT和FT固化時(shí)間順序?yàn)椋? h<1 h<8 h<12 h<16 h。

Time/h圖2 α-TCP球磨時(shí)間對(duì)α-CPC固化時(shí)間的影響Figure 2 Effect of α-TCP ball milling time on α-CPC solidification time

球磨4 h時(shí)的固化時(shí)間最短(IT=6.9 min, FT=13.9 min),這是粉體粒徑與其溶解度呈負(fù)相關(guān)性,顆粒粒徑越小,比表面越大,溶解速率越快,使得α-CPC漿體過(guò)飽和度提升,促使快速凝固。

α-TCP基粉體球磨時(shí)間對(duì)α-CPC抗?jié)⑸⒛芰?浸泡12 h)的影響如圖3所示。由圖3可知,球磨16 h的α-CPC試樣中間斷裂且有大小不均的碎渣掉落。球磨12 h和8 h的試樣外層部分脫落、四周散落較多,大小不一且試樣為碎渣。球磨1 h的試樣碎渣掉落相對(duì)減少,球磨4 h的試樣脫落情況最為輕微。浸泡液渾濁程度順序?yàn)? h<1 h<8 h<12 h<16 h。實(shí)驗(yàn)證明,α-TCP基粉體粒徑是影響骨水泥抗?jié)⑸⒛芰Φ闹匾蛩?與粉體基粒徑呈負(fù)相關(guān),粒徑越小,骨水泥固化時(shí)結(jié)合越緊密,能有效阻止模擬體液滲入材料內(nèi)部,防止斷裂,提高α-CPC的抗?jié)⑸⒛芰Α?/p>

圖3 α-TCP球磨時(shí)間對(duì)α-CPC抗?jié)⑸⑿阅艿挠绊慒igure 3 Effect of α-TCP ball Milling time on α-CPC battering resistance

Time/d圖4 骨水泥在SBF中浸泡pH變化曲線(xiàn)Figure 4 pH change curves of bone cement soaked in SBF

(3) 降解能力的影響

球磨時(shí)間對(duì)α-CPC降解能力的影響如圖4和圖5所示。由圖4可知,由不同球磨時(shí)間的α-TCP粉體制得的骨水泥在降解過(guò)程中,其浸泡液pH變化曲線(xiàn)形狀相似,均為先降低后略微上升,即第1～3 d從pH=7.4降到6.5～6.7之間,而第3～5 d試液的pH基本平穩(wěn)，這是由于在降解初期,骨水泥中的檸檬酸迅速擴(kuò)散到浸泡液中,使其pH迅速下降呈弱酸性。而第5 d后,pH開(kāi)始小幅度上升,這是由于骨水泥的水化反應(yīng)生成了羥基磷灰石,促使浸泡液的pH緩慢上升。圖5的降解速率曲線(xiàn)顯示：α-TCP粉體基球磨4 h制備的α-CPC降解速率最大,球磨16 h的降解速率最小,說(shuō)明粉體粒徑越小,α-CPC在模擬體液表面開(kāi)始膨脹,材料溶解時(shí)與浸泡液接觸面積增大,材料內(nèi)部產(chǎn)生的應(yīng)力越大,促使材料本身沿晶面分散致其內(nèi)部產(chǎn)生微裂縫,故其降解速率越快。

Time/d圖5 骨水泥在SBF中浸泡的降解速率Figure 5 Degradation rate of bone cement soaked in SBF

2.2 載硒微球摻入量對(duì)復(fù)合骨水泥性能影響

以球磨4 h的α-CPC摻入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、 3%、5%和7%的Na2SeO3-SA/CS微球時(shí)所得復(fù)合骨水泥的相關(guān)性能如表1所示。從表1可以看出,與純?chǔ)?CPC相比,載硒微球的加入能提升復(fù)合骨水泥的抗壓能力和降解速率,且與微球的加入量呈正相關(guān)性。從固化時(shí)間來(lái)看,當(dāng)摻入微球量小于7%時(shí),固化時(shí)間比純?chǔ)?CPC(IT=6.9 min, FT=13.9 min)縮短,而超過(guò)7%時(shí)卻有所延長(zhǎng)(IT=7.0 min, FT=14.3 min)。微球摻入量在低于5%時(shí),復(fù)合骨水泥的注射性和抗?jié)⑸⑿阅軆?yōu)良。此外,從表1還可以看出,與純?chǔ)?CPC相比,載硒微球的加入能提升復(fù)合骨水泥的抗壓能力和降解速率,且與微球的加入量呈正相關(guān)性。從固化時(shí)間來(lái)看,當(dāng)摻入微球量小于7%時(shí),固化時(shí)間比純?chǔ)?CPC(IT=6.9 min, FT=13.9 min)縮短,而超過(guò)7%時(shí)卻有所延長(zhǎng)(IT=7.0 min, FT=14.3 min)。微球摻入量在5%以下時(shí),復(fù)合骨水泥的注射性和抗?jié)⑸⑿阅軆?yōu)良。因此,經(jīng)綜合考慮,本文采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%載硒微球摻入量。

表1 Na2SeO3/CS微球摻入量對(duì)復(fù)合骨水泥性能的影響Table 1 Influence of the content of Na2SeO3/CS microspheres on the properties of composite bone cement

2.3 復(fù)合調(diào)和液組分含量、固液比對(duì)Na2SeO3-SA/CS/α-CPC復(fù)合骨水泥固化性能的影響

后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選取球磨4 h的α-TCP作為粉體基。殼聚糖具有良好生物相容性和可降解性,而檸檬酸促凝性?xún)?yōu)良,因此,本實(shí)驗(yàn)以二者混合物作為復(fù)合固化液制備N(xiāo)a2SeO3-SA/CS/α-CPC骨水泥。以殼聚糖濃度、檸檬酸濃度、固液比為變量設(shè)計(jì)L9(33)的正交試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。獲得的數(shù)據(jù)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,其結(jié)果如表3和表4所示。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(33)Table 2 Orthogonal test design L9(33)

表3 初凝時(shí)間正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test of initial setting time

表4 終凝時(shí)間正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal test for final setting time

由表1～3可知,3因素對(duì)復(fù)合骨水泥IT和FT的影響順序?yàn)椋汗桃罕?SA>CS,相對(duì)于CS和SA,固液比對(duì)復(fù)合骨水泥的IT(P=0.034)和TF(P=0.018)的影響更為顯著(0.050

2.4 復(fù)合骨水泥性能

(1) 形貌表征

Na2SeO3-SA/CS/α-CPC復(fù)合骨水泥緩釋前后的SEM照片如圖6所示。從圖6a和6d可以看出,純?chǔ)?CPC降解后表面形成了一些較小間隙和空腔,可在一定程度上支持生長(zhǎng)細(xì)胞的黏附。圖6b～c中圓滑的Na2SeO3-SA/CS微球被α-CPC均相包裹,形成了很好的Na2SeO3-SA/CS/α-CPC復(fù)合骨水泥。Na2SeO3-SA/CS微球緩釋前(圖6b)后(圖6e)由光滑的圓球轉(zhuǎn)變?yōu)榭v橫交錯(cuò)的皺褶圓形,硒緩釋效應(yīng)顯著。從圖6f可知,復(fù)合骨水泥緩釋后形成了完善的三維蜂窩狀多孔結(jié)構(gòu),這主要是由微球中粒子的溶出緩釋而形成的,同時(shí)這種特異微納的降解結(jié)構(gòu),對(duì)細(xì)胞黏附生長(zhǎng)、血管和神經(jīng)長(zhǎng)入、細(xì)胞外基質(zhì)沉積礦化、營(yíng)養(yǎng)和氧氣的運(yùn)輸?shù)忍峁┝擞欣蛩?。因此，Na2SeO3-SA/CS/α-CPC復(fù)合骨水泥具有良好的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)和成骨活性。

圖6 材料緩釋前后的SEM照片：α-CPC緩釋前(a)、緩釋后(d);Na2SeO3-SA-CS微球緩釋前(b)、緩釋后(e); Na2SeO3-SA-CS/α-CPC緩釋前(c)、緩釋后(f)Figure 6 SEM images of material:before sustained release(a) and after sustained release(d) of α-CPC; Before sustained release(b) and after sustained release(e) of microspheres of Na2SeO3-SA-CS; Before sustained release(c) and after sustained release(f) of Na2SeO3-SA-CS/α-CPC bone cement

(2)Na2SeO3-SA/CS/α-CPC復(fù)合骨水泥的XRD和IR表征

復(fù)合骨水泥試樣降解前后的XRD譜圖如圖7所示。由圖7可知,與標(biāo)準(zhǔn)卡片比對(duì),純?chǔ)?CPC、 Na2SeO3/α-CPC和 Na2SeO3-SA/CS/α-CPC 3種試樣降解前后在21°、 29.3°、 30°和34°處出現(xiàn)α-TCP的衍射峰,而在18.1°、 24.3°和41.7°處出現(xiàn)較弱的β-TCP的衍射峰,這可能是高溫?zé)频摩?TCP在取出急冷卻時(shí)有少量α-TCP相轉(zhuǎn)變?yōu)棣?TCP。此外,該結(jié)果與IR譜圖結(jié)論一致,且各試樣降解后的峰強(qiáng)度較小,說(shuō)明降解后試樣中的α-TCP和β-TCP含量減少,轉(zhuǎn)變成了HA。3種試樣降解后,在11.7°、 22.9°和34.6°等處HA的衍射峰明顯強(qiáng)于降解前的HA衍射峰,進(jìn)一步證實(shí)α-CPC降解后的主要產(chǎn)物為HA。

2θ/(°)圖7 復(fù)合α-CPC降解前后的XRD譜圖Figure 7 XRD of composite α-CPC before and after degradation

復(fù)合骨水泥的IR譜圖如圖8所示。由圖8可知,1584 cm-1和1500 cm-1處的吸收峰為CO32-的伸縮振動(dòng)吸收峰。α-TCP的PO43-在1023 cm-1附近出現(xiàn)P—O的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)特征峰,在551 cm-1處為PO43-的彎曲振動(dòng)峰。1179 cm-1附近微弱的吸收峰為β-TCP中PO43-的伸縮振動(dòng)吸收峰,從而表明α-TCP中有少量的β-TCP。

ν/cm-1圖8 Na2SeO3-SA/CS/α-CPC的紅外譜圖Figure 8 Infrared spectra of Na2SeO3-SA/CS/α-CPC

(3) 熱性能測(cè)定

復(fù)合α-CPC降解前后的DTG和DSC曲線(xiàn)如圖9所示。由圖9可知,各試樣降解前后均出現(xiàn)了2個(gè)明顯的失重階段,第一階段為溫度240 ℃范圍的失重,主要為分子內(nèi)外的水,DSC曲線(xiàn)上的熱效應(yīng)變化不明顯。第二階段為溫度800 ℃范圍的失重,這主要是SA和CS的初步分解以及HA的分解。從DSC曲線(xiàn)可知,該階段吸熱現(xiàn)象顯著,且各試樣降解后所吸收的熱量均大于降解前,這是由于降解后生成了大量HA物質(zhì)。

Tempereture/℃

(4) 復(fù)合骨水泥體外緩釋硒

Na2SeO3-SA/CS/α-CPC復(fù)合骨水泥在SBF溶液中的緩釋效果如圖10所示。由圖10可知,各試樣在初期的8 h內(nèi),呈現(xiàn)突釋特征,Na2SeO3-SA/CS微球、Na2SeO3/α-CPC和Na2SeO3-SA/CS/α-CPC中硒的累積釋放率分別為60.57%、 45.00%和21.53%,這是附著在材料表面的硒快速擴(kuò)散所致。8～120 h區(qū)間為緩慢釋硒階段,曲線(xiàn)緩慢上升,Na2SeO3-SA/CS微球、Na2SeO3/α-CPC和Na2SeO3-SA/CS/α-CPC中硒的累積釋放率達(dá)77.71%、 53.04%和25.53%,說(shuō)明微球溶脹增加,空隙深入微球內(nèi)壁,包裹在微球內(nèi)芯的藥物釋放出來(lái),同時(shí)α-CPC水化反應(yīng)生成的HA不斷在表面沉積,使得硒的釋放減緩。120 h以后釋硒進(jìn)入緩慢穩(wěn)定階段,1000 h時(shí)Na2SeO3-SA-CS微球、Na2SeO3/α-CPC和Na2SeO3-SA/CS/α-CPC的硒累積釋放率分別為78.640%、 54.541%和32.340%。由于長(zhǎng)時(shí)間浸泡,水化產(chǎn)物HA累積增多,附著在骨水泥降解產(chǎn)生的孔隙之間形成牢固的多維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),使SeO32-的擴(kuò)散速率受到抑制,導(dǎo)致藥物緩釋速率與水化產(chǎn)物HA的量呈負(fù)相關(guān)性。

Time of cumulative release/h圖10 載硒α-CPC體外緩釋曲線(xiàn)Figure 10 Selenium-containing α-CPC sustained release curve in vitr

2.5 復(fù)合骨水泥細(xì)胞活性

以樣品分別培養(yǎng)1 d和7 d的培養(yǎng)液作用于肉骨瘤MG63細(xì)胞,采用CCK-8法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用,試驗(yàn)組采用0.1 mg/mL Na2SeO3、陽(yáng)性對(duì)照的紫杉醇濃度為0.5 μg/mL,試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 樣品對(duì)MG63細(xì)胞活性影響Table 5 Effects of samples on MG63 cell viability

由表5可知,Na2SeO3、 Na2SeO3-SA/CS微球和Na2SeO3-SA/CS/α-CPC 3個(gè)試樣對(duì)MG63細(xì)胞的增殖都有抑制作用,且與空白對(duì)照組差異顯著,抑制能力順序?yàn)榧僋a2SeO3>載硒微球>載硒復(fù)合骨水泥,而α-CPC骨水泥沒(méi)有抑制作用,說(shuō)明Na2SeO3是抑制MG63細(xì)胞增殖的活性物質(zhì),且抑制能力與其含量呈正相關(guān)性。Na2SeO3抑制率雖弱于陽(yáng)性對(duì)照的紫杉醇,但其水溶性和成本低均利于應(yīng)用。復(fù)合骨水泥中的載硒成分,能較長(zhǎng)時(shí)間留存其中,發(fā)揮促修復(fù)、抗炎等生理功能。

3 結(jié)論

基質(zhì)粉體球磨時(shí)間是影響骨水泥基本性能的重要因素。粉體粒徑大小順序?yàn)? h<1 h<8 h<12 h<16 h,固化時(shí)間與粉體粒徑呈反比,球磨4 h時(shí)粉體的平均粒徑最小(116 nm),固化時(shí)間最短的IT=6.9 min, FT=13.9 min,潰散輕微,且降解速率在各個(gè)時(shí)段均大于其它球磨時(shí)間的粉體所制得的CPC。Na2SeO3-SA/CS微球的摻入能提升復(fù)合骨水泥的抗壓強(qiáng)度和降解速率,其固化時(shí)間略微縮短,當(dāng)摻入量超過(guò)5%,復(fù)合骨水泥的注射性和抗?jié)⑸⑿暂^差,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的摻入量最合適。復(fù)合調(diào)和液由25%(g/mL) SA和0.5%(g/mL) CS組成,固液比為1.0 ∶0.6, Na2SeO3-SA/CS/α-CPC復(fù)合骨水泥的IT ∶FT為5.6 ∶12.8,符合臨床需求。降解前圓滑的Na2SeO3-SA/CS微球被α-CPC均相包裹,形成了很好的Na2SeO3-SA/CS/α-CPC復(fù)合骨水泥,降解后形成了完善的三維蜂窩狀多孔結(jié)構(gòu),Na2SeO3-SA/CS微球的添加促使復(fù)合骨水泥水化成HA。Na2SeO3-SA/CS/α-CPC復(fù)合骨水泥避免了硒的突釋效應(yīng),使得硒能長(zhǎng)時(shí)間保持并發(fā)揮其活性功能。硒對(duì)MG63細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用,且抑制效能與其濃度呈正相關(guān)性。本研究以期為研究促修復(fù)、防止腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的功能性植骨材料提供可行思路,為含硒骨材料在體內(nèi)外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和臨床上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。