李 斌, 何 菱

(四川大學(xué) 華西藥學(xué)院,四川 成都 610041)

近十年來,文獻(xiàn)報(bào)道的七元雜環(huán)分子中,有近55%的生物活性表現(xiàn)在抗腫瘤方面[1-14](Chart 1),由此可知,七元氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)是一種潛在的抗腫瘤生物活性的結(jié)構(gòu)單元。2013年,Olivier等[10]報(bào)道了具有破壞BET特定結(jié)構(gòu)域(BRD2, BRD3和BRD4)功能的強(qiáng)效苯并二氮類抑制劑的構(gòu)效關(guān)系,其中I-BET762(Chart 1)已進(jìn)行白血病、淋巴瘤、腦瘤和骨髓瘤等多種癌癥的臨床試驗(yàn)工作。基于此,開展該類衍生物的合成和活性研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

Chart 1

本文為簡化結(jié)構(gòu),從滲透性和不可逆結(jié)合方面改善抗腫瘤活性,以簡單鄰硝基苯甲酸衍生物為底物,經(jīng)3或4步反應(yīng),并在第3步關(guān)環(huán)反應(yīng)中用乙酰丙酮鉬和三氟甲磺酸銅作為催化劑,最終合成了10個(gè)新型七元氮雜環(huán)1,4-苯并二氮雜-5-酮三氟乙基和環(huán)丙基取代衍生物(4a～4f,5a～5b,6a～6b, Scheme 1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR,13C NMR和HR-MS(ESI)表征。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Varian Mercury 400/600 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo))；Bruker Daltonics Data analysis 3.2 mass spectrometer型質(zhì)譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成(以化合物4a、 5b和6b為例)

(1) 化合物2a的合成

將鄰硝基苯甲酸(501.00 mg, 3.00 mmol)置于干凈無水的反應(yīng)瓶中,氮?dú)獗Ｗo(hù)下向反應(yīng)瓶中加入二氯亞砜(4.00 mL),并于80 ℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)完全后,將多余二氯亞砜旋出,得到鄰硝基苯甲酰氯。將三氟乙胺(0.26 mL, 3.30 mmol)置于另一裝有攪拌子的干燥反應(yīng)瓶內(nèi),氮?dú)獗Ｗo(hù),無水操作下注入無水二氯甲烷(20.00 mL)和三乙胺(3.00 mL)。隨后在冰浴條件下加入鄰硝基苯甲酰氯,升至室溫,反應(yīng)10 h(TLC監(jiān)測)。加入飽和碳酸氫鈉溶液進(jìn)行淬滅反應(yīng),用乙酸乙酯萃取,有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌,經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:石油醚/乙酸乙酯=1/1,V/V)純化得白色固體2a690.00 mg,產(chǎn)率93%。

(2) 化合物3a的合成

將化合物2a(248.00 mg, 1.00 mmol)置于干燥的反應(yīng)瓶中,注入干燥四氫呋喃(10.00 mL),氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行無水操作。將反應(yīng)瓶置于冰浴中,并向其中加入二異丙基氨基鋰(LDA, ca. 2.00 M, 0.75 mL, 1.50 mmol),充分?jǐn)嚢?5 min。采用注射器緩慢滴加烯丙基溴化物(220.00 mg, 1.50 mmol)使其反應(yīng)3 h, TLC監(jiān)測至反應(yīng)結(jié)束。之后向反應(yīng)中加入飽和氯化銨溶液進(jìn)行淬滅反應(yīng),用乙酸乙酯萃取,有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥,減壓旋蒸濃縮,得棕色油狀液體3a,不經(jīng)分離純化,繼續(xù)下一步反應(yīng)。

(3) 化合物4a的合成

將化合物3a(31.60 mg, 0.10 mmol)置于裝有攪拌子的反應(yīng)管中,隨后依次加入三苯基膦(75.00 mg, 0.29 mmol),乙酰丙酮鉬(3.30 mg, 0.01 mmol),三氟甲烷磺酸酮(3.60 mg, 0.01 mmol),并注入干燥甲苯(3.00 mL)。將反應(yīng)置于110 ℃的油浴鍋中反應(yīng)12 h，TLC監(jiān)測至反應(yīng)結(jié)束后,減壓濃縮,經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:二氯甲烷/丙酮=70/1,V/V)純化得白色油狀液體三氟乙基取代的1,4-苯并二氮雜-5-酮4a10.00 mg。

(4) 化合物5b的合成

將化合物4d(30.00 mg, 0.12 mmol)置于裝有攪拌子的反應(yīng)管中,注入干燥的四氫呋喃(3.00 mL),氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行無水操作。將反應(yīng)瓶置于冰浴中,并向其中加入二異丙基氨基鋰(LDA, ca. 2.00 M, 0.12 mL, 0.24 mmol),充分?jǐn)嚢?5 min。加入氨基磺酰氯(27.60 mg, 0.24 mmol),TLC監(jiān)測至反應(yīng)結(jié)束后,向反應(yīng)中加入飽和氯化銨溶液進(jìn)行淬滅反應(yīng),用乙酸乙酯萃取,有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥,減壓旋蒸濃縮,經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:石油醚/丙酮=4/1,V/V)純化得黃色油狀液體5b21.60 mg。

(5) 化合物6b的合成

將化合物4e(51.20 mg, 0.20 mmol)置于裝有攪拌子的反應(yīng)管中,并注入干燥的甲醇(2.00 mL)。之后將反應(yīng)管置于-78 ℃,通入臭氧,反應(yīng)1 min，再向其中加入二甲硫醚,攪拌下反應(yīng)1 h。旋蒸除去二甲硫醚,殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:石油醚/乙酸乙酯=2/1,V/V)純化得白色油狀液體6b23.00 mg。

2-(丙-1-烯-2-基)-4-(2,2,2-三氟乙基)-1,2,3,4-四氫-5H-苯并[e][1,4]二氮雜-5-酮(4a):白色油狀液體,收率35%:1H NMR(400 MHz, Methanol-d4)δ: 7.60(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.26(t,J=7.1 Hz, 1H), 6.84(d,J=8.2 Hz, 1H), 6.79(t,J=7.5 Hz, 1H), 5.10(s, 1H), 4.97(s, 1H), 4.70～4.54(m, 1H), 4.26(dd,J=7.8 Hz, 2.1 Hz, 1H), 3.99～3.86(m, 1H), 3.79(dd,J=15.3 Hz, 8.1 Hz, 1H), 3.59(dd,J=15.3 Hz, 2.7 Hz, 1H), 1.79(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Methanol-d4)δ: 171.94, 146.06, 145.31, 132.74, 131.17, 124.73(q,J=280.0 Hz), 120.00, 119.12, 118.18, 112.28, 64.61, 50.28, 48.02(q,J=33.6 Hz), 17.95; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C14H16N2OF3{[M-H]-}285.1209 found 285.1211。

8-氟-2-(丙-1-烯-2-基)-4-(2,2,2-三氟乙基)-1,2,3,4-四氫-5H-苯并[e][1,4]二氮雜-5-酮(4b):淡黃色油狀液體,收率42%;1H NMR(400 MHz, Methanol-d4)δ: 7.67(dd,J=8.7 Hz, 6.9 Hz, 1H), 6.55(dd,J=11.2 Hz, 2.2 Hz, 1H), 6.49(td,J=8.8 Hz, 8.4 Hz, 2.4 Hz, 1H), 5.08(s, 1H), 4.99(s, 1H), 4.71～4.49(m, 1H), 4.24(dd,J=8.1 Hz, 2.0 Hz, 1H), 3.99～3.87(m, 2H), 3.82(dd,J=15.3 Hz, 7.9 Hz, 1H), 3.62(dd,J=15.4 Hz, 2.5 Hz, 1H), 1.80(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Methanol-d4)δ: 170.86, 165.89(d,J=248.9 Hz), 148.33(d,J=11.8 Hz), 144.76, 134.49(d,J=11.1 Hz), 124.72(q,J=280.0 Hz), 115.40(d,J=1.9 Hz), 112.55, 105.21(d,J=22.8 Hz), 103.92(d,J=24.4 Hz), 64.13, 50.39, 48.22(q,J=33.5 Hz), 17.85; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C14H15N2OF4{[M-H]-}303.1115 found 303.1116。

9-甲基-2-(丙-1-烯-2-基)-4-(2,2,2-三氟乙基)-1,2,3,4-四氫-5H-苯并[e][1,4]二氮雜-5-酮(4c):白色油狀液體,收率33%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.39(d,J=7.2 Hz, 1H), 7.20(d,J=6.9 Hz, 1H), 6.67(t,J=7.5 Hz, 1H), 5.06(s, 1H), 4.98(s, 1H), 4.92(s, 1H), 4.76～4.58(m, 1H), 4.24(dd,J=10.7 Hz, 2.6 Hz, 1H), 4.09～3.92(m, 1H), 3.72(dd,J=15.3 Hz, 8.3 Hz, 1H), 3.54(dd,J=15.2 Hz, 2.3 Hz, 1H), 2.18(s, 3H), 1.74(s, 3H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 170.75, 145.92, 143.64, 133.90, 130.27, 126.17,125.38(q,J=282.1 Hz), 121.57, 118.05, 112.94, 64.01, 50.18, 48.14(q,J=32.7 Hz), 19.62, 18.84; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H18N2OF3{[M-H]-}299.1366 found 299.1365。

4-環(huán)丙基-8-氟-2-(丙-1-烯-2-基)-1,2,3,4-四氫-5H-苯并[e][1,4]二氮雜-5-酮(4d):白色油狀液體,收率32%;1H NMR(400 MHz, Methanol-d4)δ: 7.64(t,J=7.7 Hz, 1H), 6.62～6.31(m, 2H), 5.09(s, 1H), 4.97(s, 1H), 4.13(m, 1H), 3.68(dd,J=14.9 Hz, 7.2 Hz, 1H), 3.57(dd,J=15.2 Hz, 2.2 Hz, 1H), 2.91～2.79(m, 1H), 1.81(s, 3H), 0.98～0.86(m, 1H), 0.86～0.75(m, 2H), 0.74～0.65(m, 1H);13C NMR(101 MHz, Methanol-d4)δ: 172.11, 165.55(d,J=248.1 Hz), 148.21(d,J=11.6 Hz), 145.09, 133.87(d,J=11.0 Hz), 117.12(d,J=2.0 Hz), 112.09, 105.03(d,J=22.6 Hz), 103.79(d,J=24.3 Hz), 65.46, 50.17, 31.71, 18.13, 7.79, 5.12; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H18N2OF{[M-H]-}261.1398 found 261.1397。

4-環(huán)丙基-9-甲基-2-(丙-1-烯-2-基)-1,2,3,4-四氫-5H-苯并[e][1,4]二氮雜-5-酮(4e):淡黃色油狀液體,收率36%;1H NMR(400 MHz, Methanol-d4)δ: 7.42(d,J=7.7 Hz, 1H), 7.20(d,J=7.1 Hz, 1H), 6.72(t,J=7.5 Hz, 1H), 5.14(s, 1H), 4.98(s, 1H), 4.37～4.10(m, 1H), 3.68(dd,J=15.0 Hz, 6.9 Hz, 1H), 3.53(dd,J=14.7 Hz, 3.2 Hz, 1H), 2.97～2.76(m, 1H), 2.21(s, 3H), 1.81(s, 3H), 0.97～0.87(m, 1H), 0.86～0.75(m, 2H), 0.75～0.63(m, 1H);13C NMR(151 MHz, Methanol-d4)δ: 173.54, 145.51, 143.27, 133.14, 128.76, 125.49, 122.78, 118.16, 111.95, 65.64, 49.73, 31.38, 18.26, 16.89, 7.63, 5.22; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C16H21N2O{[M-H]-}257.1648 found 257.1648。

4-環(huán)丙基-2-(丙-1-烯-2-基)-1,2,3,4-四氫-5H-苯并[e][1,4]二氮雜-5-酮(4f):淡黃色油狀液體,收率35%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 7.78(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.24(t,J=6.9 Hz, 1H), 6.89(t,J=7.5 Hz, 1H), 6.68(d,J=7.7 Hz, 1H), 5.12(s, 1H), 4.96(s, 1H), 4.09(dd,J=8.0 Hz, 3.0 Hz, 1H), 3.57(dd,J=14.9 Hz, 8.2 Hz, 1H), 3.46(dd,J=14.9 Hz, 3.4 Hz, 1H), 3.06～2.77(m, 1H), 1.78(s, 3H), 1.01～0.89(m, 1H), 0.87～0.67(m, 3H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 171.49, 145.34, 139.25, 132.30, 131.77, 123.63, 119.96, 119.29, 113.17, 66.63, 50.30, 31.45, 19.49, 8.03, 6.04; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H19N2O{[M-H]-}243.1492 found 243.1497。

4-環(huán)丙基-5-氧代-2-(丙-1-烯-2-基)-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[e][1,4]二氮雜-1-磺酰胺(5a):黃色油狀液體,收率70%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.81(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.27(t,J=7.1 Hz, 1H), 7.16(d,J=6.3 Hz, 1H), 6.93(s, 2H), 6.90(d,J=8.3 Hz, 1H), 6.69(t,J=7.4 Hz, 1H), 6.10(s, 1H), 4.12～3.96(m, 1H), 3.28～3.07(m, 2H), 2.28～2.18(m, 1H), 2.01(s, 3H), 0.57～0.46(m, 1H), 0.42～0.15(m, 3H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 188.45, 152.92, 148.01, 134.31, 131.00, 130.68, 120.99, 120.31, 117.47, 57.56, 50.10, 33.07, 24.74, 8.30, 6.93; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H19N3O3SNa{[M-Na]-}344.1039, found 344.1044。

4-環(huán)丙基-8-氟-5-氧基-2-(丙-1-烯-2-基)-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[e][1,4]二氮雜-1-磺酰胺(5b):黃色油狀液體,收率55.4%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.88(t,J=8.0 Hz, 1H), 7.42(d,J=6.1 Hz), 6.94(s, 2H), 6.68(d,J=11.6 Hz, 1H), 6.54(t,J=8.3 Hz, 1H), 6.10(s, 1H), 4.13～3.98(m, 1H), 3.26～3.02(m, 2H), 2.36～2.13(m, 1H), 2.01(s, 3H), 0.68～0.48(m, 1H), 0.46～0.11(m, 3H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 187.26, 166.16(d,J=249.4 Hz), 152.67, 149.99(d,J=12.6 Hz), 134.29(d,J=11.4 Hz), 130.86, 118.34(d,J=0.7 Hz), 105.95(d,J=23.0 Hz), 104.60(d,J=23.9 Hz), 57.60, 50.28, 33.02, 24.73, 8.34, 6.89; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H18N3O3FSNa{[M-Na]-}362.0945 found 362.0946。

2-乙?；?4-環(huán)丙基-3,4-二氫-5H-苯并[e][1,4]二氮雜-5-酮(6a):白色油狀液體,收率60%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.92(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.67(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.49(t,J=7.4 Hz, 1H), 7.44(d,J=7.9 Hz, 1H), 3.90(s, 2H), 2.98～2.82(m, 1H), 2.53(s, 3H), 0.83～0.75(m, 2H), 0.75～0.67(m, 2H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 198.03, 167.60, 165.08, 144.80, 132.17, 131.12, 128.85, 128.52, 127.55, 41.23, 31.69, 25.01, 7.38; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C14H14N2O2Na{[M-Na]-}265.0948 found 265.0948。

2-乙酰基-4-環(huán)丙基-9-甲基-3,4-二氫-5H-苯并[e][1,4]二氮雜-5-酮(6b):白色油狀液體,收率45%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.72(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.52(d,J=7.3 Hz, 1H), 7.36(t,J=7.7 Hz, 1H), 3.87(s, 2H), 2.97～2.77(m, 1H), 2.55(s, 3H), 2.40(s, 3H), 0.82～0.64(m, 4H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 198.04, 167.75, 163.39, 143.23, 134.93, 133.13, 128.82, 128.67, 128.17, 41.14, 31.66, 25.03, 18.47, 7.36; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H17N2O2{[M-H]-}257.1285 found 257.1278。

1.3 抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)方法

乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231等在含有10%胎牛血清,42 mmol·L-1谷氨酰胺,1 mmol·L-1丙酮酸鈉,100 μg·mL-1鏈霉素,100 μg·mL-1青霉素和0.25 μg·mL-1兩性霉素的5%二氧化碳DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為37 ℃。腫瘤細(xì)胞被接種在含有10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)基的24孔板培養(yǎng)板上,接種密度為每孔2×104個(gè)。將細(xì)胞以苯并二氮雜產(chǎn)物在0.01～1.00 mmol·L-1之間的5種劑量濃度下培養(yǎng)5 d。使用相同體積的二甲基亞砜作為空白對(duì)照,以苯達(dá)莫司汀(Bendamustiune,雙功能烷化劑)和伏立諾他(SAHA, HDAC抑制劑)作為陽性藥物對(duì)照,采用細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞活力分析儀計(jì)數(shù)。以藥物處理過的細(xì)胞存活數(shù)除以空白對(duì)照細(xì)胞存活數(shù)計(jì)算細(xì)胞存活百分比。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗腫瘤活性

本研究分別選取了人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231,非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549,宮頸癌細(xì)胞HeLa和慢性骨髓性白血病細(xì)胞K562進(jìn)行體外抗腫瘤測試,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。從表1中可知,化合物對(duì)4種腫瘤細(xì)胞均有一定抑制作用,其中4a的活性較突出,三氟乙基的引入使得該類化合物對(duì)K562細(xì)胞具有良好的活性,IC50值可達(dá)2.6 μM。此外,4a對(duì)A549和MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞也有較好的抑制作用,但是對(duì)Hela細(xì)胞的抑制效果不佳。6a和6b的測試結(jié)果顯示,經(jīng)臭氧化反應(yīng)衍生獲得α,β-不飽和酮衍生物,使得化合物對(duì)K562細(xì)胞的活性提高,IC50值均低于10 μM。由5a的的抑制活性可知,磺酰胺基的引入,使得化合物對(duì)腫瘤的抑制作用有所增強(qiáng),但可能因溶解性原因效果仍不理想,因而需進(jìn)一步優(yōu)化。苯并二氮雜化合物中引入三氟乙基和環(huán)丙基等不同基團(tuán),以及在苯環(huán)上甲基氟代對(duì)MDA-MB-231, A549, HeLa和K562均有不同程度影響。因此,揭示該類化合物的抗腫瘤活性具有重要研究意義。

表1 抗腫瘤活性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Antitumor activities of the compounds

3 結(jié)論

本研究經(jīng)3步或4步反應(yīng),并且在第3步關(guān)環(huán)反應(yīng)中使用乙酰丙酮鉬和三氟甲磺酸銅作為催化劑共合成了10個(gè)未見文獻(xiàn)報(bào)道的苯并二氮雜酮三氟乙基和環(huán)丙基取代衍生物。首先以取代的鄰硝基苯甲酰胺衍生物為底物,在乙酰丙酮鉬和三氟甲烷磺酸銅的催化下,三苯基膦作還原劑,通過硝基還原、雙鍵重排、氮賓插入過程完成了七元雜環(huán)化合物的構(gòu)建。此外,對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、宮頸癌細(xì)胞HeLa和慢性骨髓性白血病細(xì)胞K562 4種細(xì)胞株的體外抗腫瘤活性進(jìn)行了測定。其中,三氟乙基的引入使得該類化合物對(duì)K562的活性IC50值達(dá)2.6 μM,表明三氟乙基和環(huán)丙基修飾的七元環(huán)對(duì)抗腫瘤活性有一定的影響。同時(shí),經(jīng)臭氧化反應(yīng)衍生獲得的α,β-不飽和酮衍生物使得化合物對(duì)K562細(xì)胞的活性IC50值達(dá)4.9 μM。經(jīng)抗腫瘤活性初步探索,有望改善和提高該類衍生物的抗腫瘤活性,為進(jìn)一步研究腫瘤活性提供參考。