蔣學(xué)軍，楊勇，庹磊，吉祖進(jìn)，雷新益

中藥在癌癥的治療中越來越多地發(fā)揮作用，研究表明，中藥聯(lián)合化療在結(jié)直腸癌的治療中發(fā)揮良好的效果，中藥可提高病人免疫力，抑制癌細(xì)胞的增殖，對(duì)延長病人生存期、提高病人生存質(zhì)量起一定的作用［1-2］。

艾葉為菊科蒿屬植物艾的葉子［3］。研究發(fā)現(xiàn)，艾葉提取物對(duì)肝癌、胃癌、宮頸癌具有一定的抑制作用，且其呈明顯的劑量依賴［4-5］，但艾葉提取物對(duì)結(jié)直腸癌的影響及其機(jī)制目前還不清楚。研究表明，微小RNA（miR）-26b 在人結(jié)直腸癌組織和耐藥細(xì)胞株HT-29/5-氟尿嘧啶（5-FU）和LOVO/5-FU 細(xì)胞中表達(dá)水平下調(diào)，且miR-26b 在體外可提高結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU 的敏感性，在體內(nèi)增強(qiáng)了5-FU 對(duì)腫瘤生長的抑制作用［6］。而本研究通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)，LINC01606 與miR-26b 之間存在結(jié)合位點(diǎn)。LINC01606在胃癌中高表達(dá)，與胃癌細(xì)胞遷移、侵襲有關(guān)［7］，在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和轉(zhuǎn)移尚不清楚?；谝陨涎芯亢皖A(yù)測結(jié)果，本研究于2018 年6 月至2019 年11 月以人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW1116 為研究對(duì)象，假設(shè)艾葉乙酸乙酯提取物通過調(diào)控LINC01606/miR-26b 途徑影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡，并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW1116購自美國模式菌種收集中心（ATCC）；艾葉藥材來自湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)總醫(yī)院中藥房，經(jīng)中藥師鑒定為菊科植物艾的干燥葉；胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich 公司；Transwell 板購自美國Corning 公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑Trizol、Realtime PCR 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒購自美國Invitrogen 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司；流式法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；LINC01606 過表達(dá)載體（pcDNA3.1-LINC01606）、LINC01606 抑制物（si-LINC01606）、miR-26b 模擬物（miR-26b）、miR-26b 抑制物（antimiR-26b）、空載體（pcDNA3.1）及陰性對(duì)照（miR-NC、anti-miR-NC、si-NC）購自蘇州吉瑪基因；周期素依賴激酶抑制劑p21（P21）、胱天蛋白酶-3（caspase-3）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自英國Abcam；流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司；Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 細(xì)胞培養(yǎng)：在含1%青-鏈霉素、10%FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)SW1116 細(xì)胞，置于5%二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，胰蛋白酶消化傳代。藥物處理：艾葉乙酸乙酯提取物采用文獻(xiàn)［8］方法提取和制備。細(xì)胞過夜培養(yǎng)至貼壁狀態(tài)時(shí)棄去培養(yǎng)液，加入含艾葉乙酸乙酯提取物12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L濃度的DMEM 高糖培養(yǎng)液，分別稱為實(shí)驗(yàn)1、2、3組，培養(yǎng)48 h，根據(jù)結(jié)果選擇最佳處理濃度。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測LINC01606 和miR-26b 的表達(dá) 收集實(shí)驗(yàn)1、2、3 組的SW1116 細(xì)胞，Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（cDNA），按Real-time PCR 說 明 書 合 成LINC01606 和miR-26b，95 ℃1 min；94 ℃30 s、59 ℃40 s、72 ℃42 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。LINC01606 正向引 物：5'-GCTGGACATTTCTCCTTCA-3'，反向引物：5'-GAGTCCTCTCGCTTCCTCCT-3'；GAPDH 正向引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反向引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'；miR-26b 正 向 引 物：5'-CCCAAGCTTAAAAACCTCCACCACGAAT-3'，反 向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGTTCAAGTAATTCAGG-3'；U6 正向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，反向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；運(yùn)用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長期的SW1116 細(xì)胞用培養(yǎng)液稀釋為1×l06～2×l06個(gè)細(xì)胞/毫升，接種于6 孔板（每孔200 μL 細(xì)胞）中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書操作。將轉(zhuǎn)染分組：LINC01606 過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 和pcDNA3.1-LINC01606），LINC01606 抑制+藥物組（轉(zhuǎn)染si-NC和si-LINC01606，然后用10 mg/L 艾葉乙酸乙酯提取物處理48 h）。轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞。

1.2.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 將SW1116 細(xì)胞以5×103個(gè)/孔（100 μL）接種于96 微孔板中，培養(yǎng)24 h 至貼壁后，換培養(yǎng)液，加入含艾葉乙酸乙酯提取物12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L 濃度的DMEM 高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入100 μL CCK-8 溶液，培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm 吸光度，細(xì)胞存活率%=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率 收集各組SW1116 細(xì)胞并稀釋，以5×104個(gè)/孔接種于6 孔板中，過夜貼壁后換為含艾葉乙酸乙酯提取物12.5、25、50 mg/L 濃度的DMEM 高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用胰蛋白酶消化后依據(jù)凋亡試劑盒說明書操作。加入5 μL 標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和5 μL 碘化丙啶（PI）混勻，室溫避光孵育20 min，加入緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法 用放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液裂解各組SW1116 細(xì)胞并超聲破碎，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，封閉1 h。加入稀釋的一抗（P21抗體1∶2 000、caspase-3 抗體1∶2 000 和GAPDH 抗體1∶4 000），4 ℃孵育過夜。等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜3 次，然后加入稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h。以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 按照“1.2.3”的方法要求培養(yǎng)SW1116 細(xì)胞，將構(gòu)建的lncRNA LINC01606 野 生 型（WT-LINC01606）和 突 變 型（MUT-LINC01606）雙熒光素酶報(bào)告載體，分別與miR-NC 或miR-26b 共轉(zhuǎn)染SW1116 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后裂解細(xì)胞。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，檢測并計(jì)算裂解后的上清中相對(duì)螢火蟲熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果均以± s表示。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間數(shù)據(jù)差異，采用單因素方差分析比較多組間數(shù)據(jù)差異，采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行多組間的兩兩比較，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW1116增殖和凋亡的影響與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)1、2、3 組的SW1116細(xì)胞克隆形成數(shù)、存活率和S期細(xì)胞百分比逐漸降低（P＜0.05），P21、caspase-3 蛋白表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率及G1 期細(xì)胞百分比均逐漸升高（P＜0.05），呈顯著劑量依賴趨勢，劑量越高效果越顯著，見表1。說明艾葉乙酸乙酯提取物可抑制SW1116細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

2.2 艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞SW1116 中LINC01606、miR-26b表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)1、2、3 組的SW1116 細(xì)胞中LINC01606 含量逐漸降低（P＜0.05），miR-26b 逐漸升高（P＜0.05），呈顯著劑量依賴趨勢，劑量越高效果越顯著，見表2。選用實(shí)驗(yàn)3組抑制率約為50%的艾葉乙酸乙酯提取物濃度（50 mg/L）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞SW1116中LINC01606、miR-26b表達(dá)的影響/± s

表2 艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞SW1116中LINC01606、miR-26b表達(dá)的影響/± s

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)1組實(shí)驗(yàn)2組實(shí)驗(yàn)3組F值P值重復(fù)次數(shù)3333 LINC01606 1.01±0.06 0.76±0.05①0.51±0.05①0.34±0.04①100.90＜0.001 miR-26b 0.98±0.08 1.26±0.09①1.41±0.10①1.69±0.12①27.08＜0.001

2.3 過表達(dá)LINC01606 能逆轉(zhuǎn)艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞SW1116 增殖、凋亡的影響轉(zhuǎn)染pcDNALINC01606 以實(shí)現(xiàn)過表達(dá)LINC01606，與對(duì)照實(shí)驗(yàn)3組+pcDNA3.1組相比，實(shí)驗(yàn)3組+pcDNA3.1-LINC01606組SW1116 細(xì)胞中LINC01606 含量顯著升高，細(xì)胞克隆形成數(shù)、存活率和S 期細(xì)胞百分比均升高（P＜0.05），P21、caspase-3 蛋白表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率及G1期細(xì)胞百分比均降低（P＜0.05）。見圖1，表3。說明過表達(dá)LINC01606 可逆轉(zhuǎn)艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)SW1116細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

2.4 抑制miR-26b 能逆轉(zhuǎn)艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞SW1116 增殖、凋亡的影響與對(duì)照實(shí)驗(yàn)3 組+pcDNA3.1 組相比，實(shí)驗(yàn)3 組+pcDNA3.1-LINC01606組SW1116 細(xì)胞中miR-26b 含量顯著降低P＜0.05），細(xì)胞克隆形成數(shù)、存活率和S 期細(xì)胞百分比均升高（P＜0.05），P21、caspase-3 蛋白表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率及G1 期細(xì)胞百分比均降低（P＜0.05），見圖2，表4。說明抑制miR-26b 可逆轉(zhuǎn)艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)SW1116細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

表1 艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞SW1116增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響/± s

表1 艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞SW1116增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響/± s

注：P21為周期素依賴激酶抑制劑p21，caspase-3為胱天蛋白酶-3。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)1組實(shí)驗(yàn)2組實(shí)驗(yàn)3組F值P值重復(fù)次數(shù)3333 P21 0.22±0.03 0.34±0.03①0.47±0.04①0.67±0.05①75.46＜0.001 caspase-3 0.14±0.02 0.26±0.02①0.38±0.03①0.59±0.04①133.91＜0.001克隆形成數(shù)120±10 101±9①79±8①56±6①32.15＜0.001存活率/%100.01±9.68 81.57±8.02①68.17±6.69①48.26±4.91①25.20＜0.001凋亡率/%8.19±0.93 13.37±1.21①17.94±1.47①24.36±1.69①77.08＜0.001 G1/%28.69±2.33 32.17±2.41①37.04±2.75①41.20±3.24①36.96＜0.001 S/%35.18±2.56 31.98±2.39①26.10±2.21①23.21±2.04①50.09＜0.001 M/%36.13±2.74 35.85±2.62 36.86±2.59 35.59±2.63 0.39 0.764

圖1 過表達(dá)LINC01606能逆轉(zhuǎn)艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞P21、caspase-3蛋白表達(dá)的影響

圖2 抑制miR-26b能逆轉(zhuǎn)艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞P21、caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.5 LINC01606 靶 向 調(diào) 控miR-26bTargetScan 預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-26b 序列中含有與LINC01606 互補(bǔ)的位點(diǎn)，見圖3。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明，與miR-NC組相比，miR-26b組的WT-LINC01606報(bào)告載體的熒光素酶活性（0.92±0.05 比0.29±0.03）顯著降低（t=18.71，P＜0.001），MUT-LINC01606 報(bào)告載體的熒光素酶活性（0.95±0.06 比0.94±0.06）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.20，P=0.848），說明兩者存在靶向結(jié)合關(guān)系。qRT-PCR 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn)，pcDNA3.1 組、pcDNA3.1-LINC01606 組、si-NC 組、si-LINC01606 組miR-26b 表達(dá) 水 平 分 別 為0.99±0.06、0.35±0.04、0.98±0.06、1.49±0.09，四組整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=154.81，P＜0.001）；過表達(dá)LINC01606 可下調(diào)miR-26b 的含量（P＜0.05），抑制LINC01606 可上調(diào)miR-26b 的含量（P＜0.05）。說明LINC01606 靶向調(diào)控miR-26b。

圖3 TargetScan預(yù)測發(fā)現(xiàn)LINC01606靶向miR-26b

3 討論

越來越多的研究表明，中醫(yī)藥聯(lián)合化療和放療等方式可有效改善腫瘤病人預(yù)后［9］。艾葉是菊科蒿屬植物艾的干燥葉子，在我國各地生長廣泛，具有祛寒止痛、溫經(jīng)止血的作用，它的提取物包括揮發(fā)油類、黃酮類、三萜類、桉葉烷類等，具有抗氧化、抗菌抗病毒、抗腫瘤、肝膽保護(hù)和提高免疫力等功能［10］。蘄艾鞣酸可抑制肝癌細(xì)胞HepG2 細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11］。艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)乙肝病毒HBV 有限制的抑制作用［8］。本研究提取艾葉乙酸乙酯提取物并處理結(jié)直腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L 艾葉乙酸乙酯提取物可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞SW1116 的克隆形成數(shù)，降低細(xì)胞存活率，提高細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中P21、caspase-3 蛋白含量，抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，50 mg/L 的艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)SW1116 細(xì)胞的抑制率約為50%，驗(yàn)證了艾葉乙酸乙酯提取物的抗腫瘤作用，但其具體機(jī)制尚不清楚。

表3 過表達(dá)LINC01606能逆轉(zhuǎn)艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞SW1116增殖、凋亡的影響/± s

表3 過表達(dá)LINC01606能逆轉(zhuǎn)艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞SW1116增殖、凋亡的影響/± s

注：P21為周期素依賴激酶抑制劑p21，caspase-3為胱天蛋白酶-3。

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表4 抑制miR-26b能逆轉(zhuǎn)艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞SW1116增殖、凋亡的影響/± s

表4 抑制miR-26b能逆轉(zhuǎn)艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞SW1116增殖、凋亡的影響/± s

注：P21為周期素依賴激酶抑制劑p21，caspase-3為胱天蛋白酶-3。

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有研究表明，miR-26b 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織，miR-26b 的過表達(dá)可靶向抑制Zeste基因增強(qiáng)子人類同源物2（EZH2）表達(dá)，抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移［12］。研究也發(fā)現(xiàn)，miR-26b在結(jié)直腸癌三個(gè)細(xì)胞系中表達(dá)顯著降低，可通調(diào)控核因子E2 相關(guān)因子3（NFE2L3）促進(jìn)結(jié)直腸癌惡性進(jìn)展［13］，且miR-26b 在體內(nèi)可增強(qiáng)5-FU 對(duì)腫瘤生長的抑制作用［6］。miR-26b 在卵巢癌、乳腺癌、肺癌等中低表達(dá)，miR-26b 發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用，其過表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并可抑制胃癌的紫杉醇的化療耐藥性［14-18］。本研究通過TargetScan 預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-26b 可能是LINC01606 的靶點(diǎn)。LINC01606在胃癌中表達(dá)水平升高，并通過Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路調(diào)控癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲［19］。基于以上結(jié)果，本研究假設(shè)艾葉乙酸乙酯提取物可能通過調(diào)控LINC01606/miR-26b 途徑抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，艾葉乙酸乙酯提取物可提高SW1116 細(xì)胞中miR-26b 的水平并降低LINC01606 的水平，呈顯著劑量依賴性。本研究結(jié)果表明，過表達(dá)LINC01606 和抑制miR-26b 均可逆轉(zhuǎn)艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)SW1116 細(xì)胞增殖和凋亡的影響；而雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果表明，LINC01606 靶向負(fù)調(diào)控miR-26b。

綜上所述，50 mg/L的艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)結(jié)直腸癌SW1116 細(xì)胞的抑制率約為50%，艾葉乙酸乙酯提取物可能通過調(diào)控LINC01606/miR-26b 抑制SW1116 細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)結(jié)直腸癌具有潛在的抑制作用。本研究只進(jìn)行了一種結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)，下一步將進(jìn)行動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步為艾葉乙酸乙酯提取物對(duì)結(jié)直腸癌的抑制作用提供數(shù)據(jù)支撐。