于文玫

健脾丸是由枳實(shí)、炒白術(shù)、陳皮與黨參等多味中藥配伍組成的中成藥，具有健脾開胃的功效，臨床用于治療食少便溏，脘腹脹滿，脾胃虛弱［1］。其中，枳實(shí)與陳皮發(fā)揮破氣消積，理氣健脾與化痰散痞的功效［2-3］。黨參發(fā)揮養(yǎng)血生津與健脾益肺的功效［4］；炒白術(shù)發(fā)揮固表止汗安胎的功效［5-6］。健脾丸的法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)收載于《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑（第七分冊(cè)）。經(jīng)查閱文獻(xiàn)［7-8］，其質(zhì)量控制均是以枳實(shí)與陳皮中主要成分檢測(cè)為主，尚未檢索到對(duì)健脾丸中白術(shù)與黨參質(zhì)量控制的文獻(xiàn)報(bào)道。黨參中特有成分為黨參炔苷，白術(shù)中特有成分為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，通過對(duì)此4 種成分含量測(cè)定，可以有效控制健脾丸中白術(shù)與黨參兩種處方的質(zhì)量。

一測(cè)多評(píng)法（QAMS）是利用樣品中某一指標(biāo)成分作為內(nèi)參物，建立內(nèi)參物與其他待測(cè)組分之間的相對(duì)校正因子（RCF），再利用RCF 計(jì)算其他待測(cè)組分的含量［9-11］。QAMS 可以解決中藥對(duì)照品制備難度大，穩(wěn)定性差，價(jià)格昂貴，不容易獲得的難題，適合于中藥中多成分同時(shí)含量測(cè)定［12-14］。本研究于2020 年1 月至2020 年7 月采用QAMS 對(duì)健 脾丸中4種有效成分進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，該方法經(jīng)濟(jì)實(shí)惠方便快捷，較全面地反映健脾丸的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑安捷倫1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；島津LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有二極管陣列檢測(cè)器。對(duì)照品：黨參炔苷（批號(hào)111732）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（批號(hào)111975）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（批號(hào)111976）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號(hào)111978）均由中檢院提供；樣品：健脾丸（規(guī)格為每8 丸相當(dāng)于原生藥3 g，批號(hào)191011，181002，190303，200201，仲 景 宛 西 制 藥 公 司；191002，200105，上海華源制藥公司；批號(hào)190504，190903，200204，上海寶龍安慶公司；批號(hào)200301，蘭州佛慈制藥公司），乙腈、甲醇與冰醋酸均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)默克公司，超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 色譜條件色譜柱為Zorbax SB-C18（250.0 mm×4.6 mm×5μm）；流速為1.0 mL/min；各檢測(cè)成分的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為黨參炔苷（270 nm）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（220 nm）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（220 nm）和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（270 nm）；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相為乙腈（A）-水（含0.1%冰醋酸）（B），梯度洗脫程序：0（20%A：80%B），9 min（50%A：50%B），16 min（55%A：45%B），25 min（100%A）。

1.3 對(duì)照品溶液的配制稱取各待測(cè)成分對(duì)照品（黨參炔苷99.37 mg，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ15.29 mg，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ10.16 mg 與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ17.93 mg），轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，用甲醇充分溶解后定容，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；量取各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 mL，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容。

1.4 供試品溶液的配制取健脾丸研碎，稱取約2.0 g，轉(zhuǎn)移至具塞三角瓶中，加入100 mL 甲醇，稱定重量，加熱回流提取1 h，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)充損失的重量，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.5 陰性對(duì)照溶液的配制按照國(guó)家法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中收載的健脾丸處方制法，制備不含白術(shù)與不含黨參的陰性樣品，按照“1.4”供試品溶液的配制方法，配制不含白術(shù)與不含黨參的陰性樣品溶液。

1.6 回歸方程與RCF 計(jì)算本研究以黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ4 種對(duì)照品儲(chǔ)備溶液配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行檢測(cè)，以待測(cè)成分的質(zhì)量濃度（x，mg/L）作為橫坐標(biāo)，以色譜響應(yīng)值（y）作為縱坐標(biāo)，以最小二乘法進(jìn)行線性統(tǒng)計(jì)分析，制得回歸曲線方程。并以黨參炔苷為內(nèi)參物，分別計(jì)算3種白術(shù)內(nèi)酯的RCF。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分別取供試品溶液、對(duì)照品溶液及不含白術(shù)與不含黨參的陰性樣品溶液，進(jìn)行檢測(cè)。4 種待測(cè)成分色譜峰的分離度與對(duì)稱性均良好。在不含白術(shù)與不含黨參的陰性樣品溶液色譜圖中無其他雜質(zhì)色譜峰干擾，說明本研究建立色譜條件適用于4種待測(cè)成分的檢測(cè)。見圖1。

2.2 線性與范圍取“1.3”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，用甲醇定容，制得標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照“1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，再進(jìn)行線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與相關(guān)系數(shù)（r）檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)取本品（批號(hào)191011），按“1.4”項(xiàng)下制備6 份供試品溶液，進(jìn)行檢測(cè)，記錄4 種待測(cè)成分的響應(yīng)值并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各成分的含量。結(jié)果，各成分含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）（n=6）分別為1.02%、1.15%、0.67%、0.82%，說明本研究建立方法具有良好的重復(fù)性。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取本品（批A號(hào) 191011），按B“1.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h 進(jìn)行檢測(cè)，記錄4 種待測(cè)成分的響應(yīng)值。結(jié)果4 種成分響應(yīng)值的RSD 分別為0.73%、0.82%、0.66%、0.84%，說明樣品溶液在檢測(cè)時(shí)間段內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

圖1 高效液相色譜圖：A為對(duì)照品溶液；B為供試品溶液；C為不含黨參陰性樣品溶液；D為不含白術(shù)陰性樣品溶液

2.5 精密度試驗(yàn)量取“1.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按照“1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)測(cè)定6 次，記錄4種待測(cè)成分的響應(yīng)值，并計(jì)算RSD值；結(jié)果各成分響應(yīng)值的RSD 分別為0.56%、0.74%、0.49% 和0.61%，說明精密度良好。

2.6 回收率試驗(yàn)取樣品（批號(hào)191011）6 份，稱取1.0 g，置具塞三角瓶中，加入“1.3”項(xiàng)下對(duì)照品貯備溶液500 μL，分別制備供試品溶液，進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算回收率。結(jié)果4種待測(cè)成分的平均回收率分別為98.16%、97.52%、98.18%、98.13%，其RSD 分別為1.25%、1.05%、1.23%、1.08%。

2.7 RCF和相對(duì)保留時(shí)間（RRT）的測(cè)定

2.7.1 待測(cè)組分RCF 計(jì)算 按“1.6”項(xiàng)下方法，取“2.2”項(xiàng)下的系列對(duì)照品溶液，分別進(jìn)行檢測(cè)，各濃度水平的對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣3 次，計(jì)算待測(cè)成分響應(yīng)值的平均值，并計(jì)算各成分相對(duì)黨參炔苷的校正因子。結(jié)果見表2。

表2 待測(cè)組分相對(duì)校正因子

2.7.2 高效液相色譜儀及色譜柱對(duì)RCF 的影響本試驗(yàn)分別考察安捷倫1260、島津LC-20A 高效液相 色 譜 儀 和Zorbax SB-C18（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）、Capcell pak C18（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）、Accucore C18（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）、Thermo ODS C18（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）等不同型號(hào)色譜柱對(duì)RCF 的影響，每個(gè)樣品均平行檢測(cè)3次，取平均值進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，不同品牌高效液相色譜儀及色譜柱對(duì)RCF無顯著影響。

2.7.3 色譜峰的定位 色譜峰的準(zhǔn)確定位是使用QAMS 法的前提，本試驗(yàn)選用RRT 對(duì)各待測(cè)成分進(jìn)行定位。本研究以黨參炔苷為內(nèi)參物，分別計(jì)算白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ與黨參炔苷的RRT。分別考察各成分RRT 在不同高效液相色譜儀和色譜柱中的重現(xiàn)性。每個(gè)樣品均平行進(jìn)樣3次，取平均值進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果各成分的RRT 變化非常小。采用RRT 對(duì)各成分進(jìn)行定位更為準(zhǔn)確，結(jié)果見表4。

表4 不同高效液相色譜儀與色譜柱的相對(duì)保留時(shí)間檢測(cè)結(jié)果

2.8 QAMS 與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較為了再次驗(yàn)證本研究建立QAMS 的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)對(duì)QAMS與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。取樣品，按“1.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，分別采用QAMS和外標(biāo)法計(jì)算4 種成分的含量，并計(jì)算2 種方法測(cè)量結(jié)果的相對(duì)誤差，相對(duì)誤差=（QAMS計(jì)算值-外標(biāo)法實(shí)測(cè)值）/外標(biāo)法實(shí)測(cè)值×100%，結(jié)果見表5。對(duì)2 種方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果2種方法檢測(cè)含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且相對(duì)誤差＜2%。

3 討論

3.1 內(nèi)參物的選擇及色譜峰定位黨參炔苷為黨參中特有成分，性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)照品比較容易獲得，因此選擇黨參炔苷作為內(nèi)參物。QAMS 法應(yīng)用的前提是各待測(cè)成分色譜峰定位必須準(zhǔn)確，通常采用RRT對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行定位。本試驗(yàn)分別考察了不同品牌的高效液相色譜儀和不同型號(hào)的色譜柱對(duì)RCF和RRT 的影響，結(jié)果表明，采用不同的高效液相色譜儀和不同型號(hào)色譜柱，RCF和RRT均非常穩(wěn)定。

3.2 色譜條件的優(yōu)化本試驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相的組成及梯度洗脫條件進(jìn)行考察，經(jīng)過對(duì)甲醇與乙腈兩種有機(jī)相比較，發(fā)現(xiàn)甲醇的黏度相對(duì)較大，高效液相色譜的柱前壓力較高，容易使色譜柱填料塌陷，損壞色譜柱，并且待測(cè)成分黨參炔苷與相鄰成分峰的分離度達(dá)不到分度的要求。而乙腈的黏度較低，系統(tǒng)的柱前壓力低，不易損壞色譜柱。通過在水相中加入0.1%乙酸，極大改善了各成分色譜峰的對(duì)稱性。利用二極管陣列檢測(cè)器的紫外掃描功能，檢測(cè)各待測(cè)成分的最大響應(yīng)波長(zhǎng)。本研究分別采用各成分最大響應(yīng)的波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，有效提高了對(duì)待測(cè)成分檢測(cè)的靈敏度。

表3 不同高效液相色譜儀及色譜柱的相對(duì)校正因子

表5 一測(cè)多評(píng)法（QAMS）與外標(biāo)法測(cè)得結(jié)果比較/（mg/g）

3.3 QAMS 的系統(tǒng)適用性與耐用性本研究利用更換不同品牌的高效液相色譜儀和色譜柱，對(duì)所建立方法的耐用性進(jìn)行考察。通過對(duì)安捷倫1260 與島津LC20A 高效液相色譜儀，以及4 根不同型號(hào)的液相色譜柱的RRT 與RCF 測(cè)定，結(jié)果各成分的RRT與RCF 均具有良好的重現(xiàn)性。本研究選擇黨參炔苷作為內(nèi)參物，其主要原因是黨參炔苷性質(zhì)穩(wěn)定且價(jià)廉易得，在節(jié)約檢測(cè)成本的同時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種成分進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。通過對(duì)10 批次的樣品進(jìn)行分析，驗(yàn)證了該方法檢測(cè)結(jié)果與外標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異，證明了該方法準(zhǔn)確可靠。

本試驗(yàn)采用QAMS 對(duì)健脾丸中黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ4 種成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果可靠準(zhǔn)確，操作方便且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，可以對(duì)多個(gè)有效成分進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，與外標(biāo)法相比節(jié)約了檢驗(yàn)的時(shí)間和成本，為健脾丸的質(zhì)量控制提供了一種簡(jiǎn)便的方法。