成楨哲，金晨曦，馮寶怡，鄭曉飛，劉祎晴，吳 皓#，陶 永#

1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，上海 200011；2. 上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室，上海 200125；3.上海交通大學醫(yī)學院耳科學研究所，上海 200125

遺傳性耳聾是人類最常見的遺傳性疾病之一，其發(fā)病率為2‰～3‰［1-2］；而縫隙連接蛋白β2 （gap junction protein β 2，GJB2）基因突變是遲發(fā)性耳聾以及遺傳性非綜合征性耳聾最常見的病因［3-4］。GJB2基因主要在支持細胞、血管紋以及螺旋韌帶中表達。它編碼連接子蛋白（connexin 26，CX26），與CX30蛋白一起參與構(gòu)成耳蝸基底膜非感覺上皮區(qū)域以及血管紋外側(cè)壁區(qū)域的縫隙連接通道［5］，涉及包括耳蝸發(fā)育、耳蝸內(nèi)淋巴電位產(chǎn)生、耳蝸主動放大、第二信使轉(zhuǎn)導(dǎo)以及鉀循環(huán)在內(nèi)的多項聽覺生理過程［6-9］。腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）介導(dǎo)的基因治療作為一種極具潛力的治療手段，在遺傳性耳聾模式動物的治療中已有多篇成功報道［10-12］。迄今為止的Gjb2基因治療主要集中于CX26條件性敲除小鼠模型，即在新生鼠時期實現(xiàn)CX26 蛋白的敲除，敲除小鼠成年后表現(xiàn)為螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元以及內(nèi)外毛細胞大量死亡，聽力完全喪失。隨后研究者通過AAV 介導(dǎo)外源正常CX26 蛋白表達，通過聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）實驗僅在12 kHz和24 kHz 兩個頻率測得聽力閾值的下調(diào)［13-14］。目前報道的Gjb2點突變的隱性純合突變小鼠模型僅有1 種，即Gjb2基因c.109G>A 純合突變小鼠（下文簡稱Gjb2純合突變小鼠），表現(xiàn)為輕中度漸進性聽力損失［15］，并且在注射呋塞米后相較野生型小鼠，聽力閾值會顯著升高。本研究擬向新生Gjb2純合突變小鼠注射帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP） 和野生型Gjb2基因的AAV8-GJB2-GFP，在成年后檢測小鼠能否減輕呋塞米引起的閾值升高反應(yīng)，從而評價GJB2用于遺傳性耳聾基因治療的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗病毒 病毒AAV8-GFP［5.80×1013GC/mL（GC：genomic copies）］及AAV8-GJB2-GFP（4.19×1013GC/mL） 均購自山東維真生物公司（ViGene Biosciences）。所有AAV都由CMV啟動子控制。

1.1.2 實驗小鼠 本研究使用的Gjb2純合突變小鼠及其年齡和性別匹配的野生型對照小鼠均為129T2/SvEmsJ品系小鼠［15］；通過對小鼠尾基因組DNA測序來確認基因型。野生型小鼠和Gjb2純合突變小鼠均飼養(yǎng)于上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院實驗動物中心，實驗動物使用許可證號為SYXK（滬）2020-0025。

1.1.3 主要試劑及儀器 多聚甲醛（16005）、Triton（T8787）、動物組織RNA 穩(wěn)定保存液RNAlater（R0901）、鹽酸賽拉嗪（X1251）購自美國Sigma 公司，0.5 mol/L EDTA 溶液（E1170）購自北京索萊寶科技有限公司，驢血清（BMS0140） 購自美國Abbkine 公司，SYBR Green Premix Pre Taq HS qPCR Kit 購自湖南艾科瑞生物工程有限公司，蛋白酶抑制劑（04693116001）購自美國Roche 公司，RIPA 裂解液（P0013B）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（P0012）、5×loading buffer（P0015）購自碧云天生物公司，舒泰50 （WK001） 購自法國維克公司，呋塞米（C822848）購自上海麥克林生化科技有限公司，抗CX26 抗體（33-5800）、二抗及封片劑購自美國Invitrogen 公司，抗SOX2 抗體（AF2018）購自美國R&D 公司，抗肌球蛋白7a（myosin 7a，MYO7a）抗體（25-6790）購自美國Proteus BioSciences 公司，抗β-actin抗體（4967S）購自美國CST公司。

共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8）購自德國Leica公司，勻漿機（JXFSTPRP-48）購自上海凈信公司，熒光定量PCR 儀（Roche LightCycler 480）購自美國Roche公司，化學發(fā)光儀（Amersham Imager 600）購自美國GE 公司，37 ℃直流電熱墊（557020）購自美國Harvard 公司，TDT 聽覺誘發(fā)電位工作站（TDT System3 RZ6 workstation） 購 自 美 國Tucker-Davis Tech公司。

1.2 方法

1.2.1 新生鼠注射 將出生2 d 內(nèi)（P0～P2）的新生小鼠放在冰上低溫麻醉。取耳前入路，暴露鐙骨動脈后，用拉制的玻璃電極在顯微鏡直視下將AAV8-GFP或AAV-GJB2-GFP 病毒注射入新生鼠右側(cè)內(nèi)耳中階。每只新生鼠注入0.3 μL 病毒。手術(shù)結(jié)束后置于37 ℃恒溫加熱墊上至完全復(fù)蘇。

1.2.2 免疫熒光染色 小鼠處死后，快速取出耳蝸，進行4%多聚甲醛灌流固定。隨后將組織放置在4%多聚甲醛中4 ℃固定過夜，隨后換成0.5 mol/L EDTA室溫脫鈣6 h。脫鈣結(jié)束后將耳蝸按頂圈、中圈、底圈解剖分離。用含有8%驢血清、0.3%Triton 的磷酸鹽緩沖液（PBS）室溫封閉組織1 h，加入抗SOX2抗體（1∶300 稀釋）、抗myosin 7a 抗體（1∶300 稀釋）4 ℃孵育過夜，PBS清洗3遍，每遍5 min。加入對應(yīng)的二抗（1∶500 稀釋）室溫孵育1 h，PBS 清洗3 遍，每遍5 min。滴入含DAPI的抗淬滅劑后封片，進行共聚焦成像。使用Image J 分別對頂圈、中圈、底圈的GFP轉(zhuǎn)染的內(nèi)毛細胞及支持細胞進行計數(shù)。

1.2.3 實時熒光定量PCR 將快速獲取的耳蝸組織放入RNAlater中防止RNA降解，去除前庭后放入勻漿機研磨勻漿（總運行時長37 s，運行7 s后中斷3 s，頻率為65 Hz）。隨后按照TRIzol法提取組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，使用SYBR Green Premix Pre Taq HS qPCR Kit 在 熒 光 定 量PCR 儀 中 對Gjb2、Gjb6以 及Rpl19（ribosomal protein L19）進行PCR 擴增。擴增引物見表1。擴增程序為：95 ℃孵育5 min；隨后95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共45 個循環(huán)。目的基因的相對表達值用Rpl19進行標準化換算。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for real-time qPCR

1.2.4 Western blotting實驗 將去前庭的耳蝸組織放入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液中，放入勻漿機研磨勻漿（總運行時長2 min，運行3 s 后中斷8 s，頻率為70 Hz）。隨后4 ℃，17 000×g離心30 min。取上清液用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測得蛋白濃度，并將各樣品稀釋成相同的濃度。加入5×loading buffer放入95 ℃水浴5 min。每個樣品上樣量為20 μg總蛋白，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉后，抗CX26 抗體（1∶1 000 稀釋）以及抗β-actin 抗體（1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，對應(yīng)二抗室溫孵育1 h后，使用化學發(fā)光儀曝光顯影。

1.2.5 ABR 實驗 采用TDT 聽覺誘發(fā)電位工作站（TDT System3 RZ6 workstation），按20 mg/kg 鹽酸賽拉嗪和65 mg/kg舒泰50的劑量腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠全麻后置于37 ℃直流電熱墊上。將記錄電極置于顱頂正中皮下，參考電極置于待測耳乳突下，接地電極置于另一側(cè)大腿皮下。選擇5.66 kHz、8.00 kHz、11.32 kHz、 16.00 kHz、 21.35 kHz、 32.00 kHz、45.00 kHz短音作為刺激聲頻，疊加次數(shù)為512次，強度從90 dB 聲壓級（sound pressure level，SPL）開始記錄，每次遞減5 dB SPL，以可以檢測到的振幅的最低刺激強度定為該頻率閾值。

1.2.6 呋塞米試驗 將小鼠按“1.2.5”的方法腹腔注射麻醉后，快速腹腔注射呋塞米溶液200 mg/kg，等待30 min 后用ABR 檢測穩(wěn)定的聽力閾移數(shù)值，并用同齡野生型小鼠作為對照組。

1.2.7 統(tǒng)計學方法 使用GraphPad Prism 8.0 對數(shù)據(jù)進行分析，定量資料用±s表示，組間比較采用方差分析（ANOVA）以及Bonferroni 校正。將P<0.05 定義為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AAV8-GFP在Gjb2純合突變小鼠耳蝸的轉(zhuǎn)染情況

于新生Gjb2純合突變小鼠內(nèi)耳中階注射1.74×1010GC 的AAV8-GFP 病 毒，14 d 后 獲 取 耳 蝸 組 織 進行免疫熒光染色，用SOX2 抗體標記基因治療靶細胞即耳蝸支持細胞（圖1A）。頂圈、中圈、底圈的支持細胞AAV8-GFP 病毒轉(zhuǎn)染率分別為（11.60±1.28）%、（10.33±1.55）% 、（5.40±0.86）% （圖1B）。 可 見AAV8-GFP病毒可用于后續(xù)Gjb2轉(zhuǎn)染的載體。

圖1 Gjb2純合突變小鼠耳蝸中階注射AAV8-GFP 14 d后支持細胞轉(zhuǎn)染情況Fig 1 Supporting cells transfection 14 d after AAV8-GFP injection in the scala media of the cochleae of Gjb2 homozygous mice

2.2 AAV8-GJB2-GFP 在Gjb2 純合突變小鼠耳蝸的轉(zhuǎn)染情況

新生Gjb2純合突變小鼠中階注射1.26×1010GC的AAV8-GJB2-GFP 病毒，4 周后取注射耳以及未注射耳的耳蝸組織進行實時熒光定量PCR，結(jié)果顯示病毒注射后耳蝸Gjb2mRNA 表達量為未注射耳的1.26 倍（P=0.014），編碼CX30 蛋白的Gjb6基因表達差異并無統(tǒng)計學意義（圖2A）。Western blotting 結(jié)果顯示CX26 的蛋白表達量為未注射耳的1.31 倍（圖2B）。耳蝸免疫熒光染色結(jié)果提示外源性CX26（綠色熒光）成功在支持細胞區(qū)域表達（圖2C），部分內(nèi)毛細胞間可觀察到CX26的異位表達（圖2D）。

圖2 Gjb2純合突變小鼠耳蝸中階注射AAV8-GJB2-GFP 4周后Gjb2及其蛋白CX26在耳蝸的表達和定位Fig 2 Expression and location of Gjb2 and it's expression protein CX26 in the cochleae of Gjb2 homozygous mice 4 weeks after AAV8-GJB2-GFP injection in the scala media

2.3 AAV8-GJB2-GFP對新生小鼠內(nèi)耳的安全性

選擇新生（P0～P2）Gjb2純合突變小鼠，通過耳蝸中階的注射方式給予1.26×1010GC 的AAV8-GJB2-GFP后，于小鼠4周齡時用ABR分別檢測給藥耳與對側(cè)未給藥耳的各頻率聽力閾值（n=10），兩側(cè)耳聽力閾值一致（圖3）。

圖3 Gjb2 純合突變小鼠一側(cè)耳蝸中階注射AAV8-GJB2-GFP 4周后ABR閾值與未注射側(cè)的比較Fig 3 Comparison of ABR thresholds between AAV8-GJB2-GFP injected side and contralateral side of cochleae after 4 weeks in Gjb2 homozygous mice

2.4 呋塞米試驗在Gjb2純合突變小鼠的反應(yīng)

野生型小鼠及Gjb2純合突變小鼠腹腔注射呋塞米前后的ABR閾值變化見圖4。野生型4周齡小鼠基礎(chǔ)聽力與Gjb2純合突變小鼠差異無統(tǒng)計學意義。在呋塞米注射后30 min，測量2組的ABR閾值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠全頻聽力與注射前無明顯變化，而Gjb2純合突變小鼠全頻聽閾較注射前均顯著升高（均P<0.01）。

圖4 4 周齡野生型小鼠及Gjb2 純合突變小鼠注射呋塞米前后ABR閾值變化Fig 4 Changes of ABR thresholds before and after furosemide injection in 4-week-old wild type mice and Gjb2 homozygous mice

2.5 Gjb2 純合突變小鼠注射AAV8-GJB2-GFP 后呋塞米試驗的反應(yīng)

新生Gjb2純合突變小鼠中階注射AAV8-GJB2-GFP 病毒4 周后進行呋塞米試驗，發(fā)現(xiàn)治療組較未治療組整體聽力閾值明顯降低，在8.00、11.32 和16.00 kHz 測得的ABR 閾值，2 組之間差異具有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）（圖5）。

圖5 Gjb2 純合突變小鼠注射AAV8-GJB2-GFP 4 周后在呋塞米試驗中的ABR閾值變化Fig 5 Changes of ABR thresholds in furosemide test in the Gjb2 homozygous mice 4 weeks after AAV8-GJB2-GFP injection

3 討論

迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有超過300 種的GJB2基因突變位點與不同程度的耳聾相關(guān)（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/），占我國遺傳性非綜合征性耳聾的18.31%，是遺傳性非綜合征性耳聾最常見的原因［16］。GJB2基因c.109G>A 突變是在東亞人群中攜帶率最高的突變類型，在中國漢族人口中攜帶率為6.2%［17］。為研究GJB2突變致聾的相關(guān)機制，本課題組前期構(gòu)建該點突變敲入小鼠，并證實其可模擬人類輕中度、遲發(fā)性、漸進性耳聾聽力表型［15］，并且在應(yīng)對環(huán)境（噪聲刺激）、藥物（呋塞米試驗）壓力下表現(xiàn)出與野生型小鼠不同的表型反應(yīng)［18］。

關(guān)于GJB2的基因治療，最早由林曦教授團隊率先開展， 構(gòu)建CX26 條件敲除小鼠（Foxg1-cCx26KO）。該小鼠表現(xiàn)為重度感音神經(jīng)性聾，隨后通過腺相關(guān)病毒1型介導(dǎo)Gjb2基因表達，成功轉(zhuǎn)染部分支持細胞，并在體外細胞層面（鈣黃綠素染色實驗）發(fā)現(xiàn)功能有部分恢復(fù)，但在體研究（電生理實驗） 未發(fā)現(xiàn)功能恢復(fù)［13］。IKEDA 團隊對另一種CX26 條件敲除的耳聾小鼠模型進行AAV 介導(dǎo)的基因治療，但僅有部分頻率的聽力閾值從100 dB SPL 恢復(fù)到70 dB SPL，而該聽力閾值仍無法用于日常溝通交流［14］。也有研究通過病毒過表達腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的方法，試圖減輕CX26 內(nèi)耳條件敲除小鼠神經(jīng)元的丟失，結(jié)果僅在耳蝸中圈、底圈觀察到神經(jīng)元數(shù)量的恢復(fù)，而聽覺電生理實驗無明顯改善［19］。然而上述基因治療均基于CX26 條件性敲除小鼠耳聾模型，其聽力表型為重度聽力下降，不符合大部分人群的GJB2突變表型。在聽力下降的GJB2突變?nèi)巳褐?，輕中度聽力損失比例超60%［20］，相較于CX26條件性敲除小鼠模型，本研究使用的Gjb2純合突變小鼠表現(xiàn)為輕中度、遲發(fā)性耳聾，對其進行基因治療更具有臨床意義。

病毒注射治療后免疫熒光染色結(jié)果表明，過表達GJB2部位包括內(nèi)毛細胞和支持細胞，盡管存在內(nèi)毛細胞區(qū)域有異位表達，但ABR 檢測結(jié)果仍正常。這與RAPHAEL 團隊結(jié)果一致［21］，提示內(nèi)毛細胞GJB2異位表達可能不會對毛細胞以及ABR 聽力檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。

LUSTIG 團隊將AAV1-VGLUT3 病毒導(dǎo)入Vglut3（vesicular glutamate transporter type 3）基因敲除小鼠模型中，使敲除小鼠聽力恢復(fù)并維持到注射后3～6 個月，首次證實基因治療可用于遺傳性耳聾治療［10］。隨后很多團隊證實AAV 介導(dǎo)的基因治療可成功實現(xiàn)耳聾模式小鼠的聽力恢復(fù)［10-12］。但發(fā)病率最高的GJB2基因治療尚無突破。本課題組前期證實AAV8可安全高效轉(zhuǎn)染內(nèi)耳細胞［22-23］。通過AAV8-GJB2-GFP 中階注射入新生小鼠內(nèi)耳，可成功靶向支持細胞，介導(dǎo)外源GJB2 的表達。然而轉(zhuǎn)染位置主要集中在頂中圈，支持細胞轉(zhuǎn)染率也較低。后續(xù)可以AAV8病毒為模版，進行衣殼或者啟動子改造［24］，以期獲得在支持細胞轉(zhuǎn)染率高、在毛細胞轉(zhuǎn)染率低的病毒工具。

呋塞米是一種袢利尿劑，不良反應(yīng)之一是導(dǎo)致一過性聽力下降，其機制可能是引起血管紋細胞水腫，導(dǎo)致內(nèi)淋巴電位迅速降低，短暫性地引起小鼠聽力閾值的升高［25］。團隊前期測得Gjb2純合突變小鼠基礎(chǔ)的內(nèi)淋巴電位僅為88 mV，而野生型小鼠可達100 mV。野生型小鼠以及Gjb2純合突變小鼠腹腔注射200 mg/kg 呋塞米后，野生型小鼠測得的內(nèi)淋巴電位下降為78 mV，僅有輕微的聽力閾值上升；而Gjb2純合突變小鼠內(nèi)淋巴電位下降至42 mV，聽力閾值上升也更明顯［18］。以此作為實驗基礎(chǔ)，觀察基因治療能否保護呋塞米導(dǎo)致的Gjb2純合突變小鼠聽力下降。本實驗結(jié)果表明基因治療后，Gjb2純合突變小鼠能緩解呋塞米引起的聽力閾值升高。

本研究通過團隊前期基礎(chǔ)，利用耳聾家系發(fā)現(xiàn)的點突變Gjb2純合突變小鼠進行病毒介導(dǎo)的過表達治療研究。利用野生型小鼠和Gjb2純合突變小鼠在呋塞米刺激下的閾值上升程度的不同進行實驗，發(fā)現(xiàn)中階注射AAV8-GJB2-GFP 病毒后Gjb2純合突變小鼠ABR 閾值上升幅度明顯小于未注射病毒的小鼠，AAV 介導(dǎo)的基因治療使呋塞米對Gjb2純合突變小鼠的聽力損傷程度減小。這表明了Gjb2基因過表達策略可能可以治療Gjb2點突變導(dǎo)致的聽力改變。

Gjb2純合突變小鼠為一種遲發(fā)性漸進性耳聾的模型，目前我們僅觀察了AAV-GJB2-GFP 在4 周齡小鼠的表達效果。后期，我們將通過長期觀察判斷AAV 介導(dǎo)的基因治療能否改善Gjb2純合突變小鼠的漸進性聽力下降。

本研究證實新生小鼠中階注射AAV8-GJB2-GFP可以遞送Gjb2靶向小鼠耳蝸支持細胞，并介導(dǎo)外源性Gjb2在支持細胞表達。AAV8-GJB2-GFP 內(nèi)耳注射不損傷Gjb2純合突變小鼠聽力，Gjb2過表達可減輕呋塞米導(dǎo)致的Gjb2純合突變小鼠聽力下降。本研究為治療GJB2相關(guān)遺傳性耳聾的基因治療提供了可行性證據(jù)。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有動物實驗均已通過上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會的審核批準（批件號HKDL［2017163］）。所有實驗過程均遵照《實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南》及《上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院動物中心管理手冊》進行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Ethics Committee of Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （Approval Letter HKDL ［2017163］）. And all experimental animal protocols were carried out by followingGuide for the Care and Use of Laboratory AnimalsandManual for Laboratory Animals Managementof Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.

作者貢獻/Authors'Contributions

成楨哲參與數(shù)據(jù)采集和分析、論文撰寫；金晨曦、馮寶怡參與論文修改；鄭曉飛參與實驗設(shè)計；劉祎晴參與論文修改；吳皓參與實驗指導(dǎo)；陶永參與實驗設(shè)計、監(jiān)督及論文修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

CHENG Zhenzhe acquired and analyzed the data， and drafted the manuscript. JIN Chenxi and FENG Baoyi revised the manuscript.ZHENG Xiaofei designed the study. LIU Yiqing revised the manuscript. WU Hao participated in the experimental study guidance.TAO Yong designed the study and participated in the manuscript correction. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-02-18

·Accepted：2022-06-19

·Published online：2022-06-28