蔡義俠, 閆杰成, 江丹賢, 吳偉豪, 黃 靜

0 引 言

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國常見的頭頸惡性腫瘤，以華南地區(qū)最為高發(fā)，嚴(yán)重威脅人民的生命健康[1]。目前臨床上鼻咽癌的早期診斷及治療主要依靠愛潑斯坦巴爾病毒(Epstein-Barr virus, EBV)檢測、內(nèi)鏡及影像檢查[2-3]。研究認(rèn)為，EB病毒感染與鼻咽癌發(fā)病密切相關(guān)[4]，約90%以上鼻咽癌患者活檢組織及血清中能找到EB病毒核酸、病毒抗原或抗體。然而臨床上時常觀察到不少初治或治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者，EB病毒抗體及DNA檢測呈陰性[5]。現(xiàn)有的檢驗檢測指標(biāo)，并不能完全滿足臨床診治的需要。尋找有效的分子生物標(biāo)志物用以指導(dǎo)鼻咽癌患者的診治依然是廣大臨床科研工作者努力探索的問題。

色素框同源蛋白CBX是多梳蛋白家族的一個重要成員，與細(xì)胞的分化、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[6-11]。CBX2是CBX家族成員之一，本課題組前期研究通過ceRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)CBX2在鼻咽癌組織中表達(dá)顯著高于正常對照鼻咽組織。既往文獻(xiàn)報道，CBX2在多種腫瘤中異常表達(dá)，廣泛參與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等惡性生物學(xué)行[12-14]。但是CXB2是否與鼻咽癌發(fā)病相關(guān)，并且影響鼻咽癌細(xì)胞的生物表型尚未明確。因此，本研究旨在進(jìn)一步明確CBX2在鼻咽癌組織及細(xì)胞系的表達(dá)情況，并分析其對鼻咽癌細(xì)胞系SUNE1增殖、遷移與侵襲的作用，期待為鼻咽癌的發(fā)病及診治提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本與細(xì)胞隨機選取2018年1月至2019年1月在廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行活檢的(41份)鼻咽癌組織和(35份)鼻咽慢性黏膜炎組織標(biāo)本。新鮮標(biāo)本離體后裝入凍存管置于液氮中保存。所有標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)確診。人鼻咽癌細(xì)胞系(CNE1、CNE2、SUNE1、5-8F)及人正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP69來源于中南大學(xué)細(xì)胞室。所有鼻咽癌細(xì)胞系均用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，NP69細(xì)胞系用K-SFM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)(購自Gibco公司)，所有培養(yǎng)基均加入1%青霉素/鏈霉素。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(審批號：PJ2019-010)，所有標(biāo)本對應(yīng)被采集者均簽署知情同意書。

1.2siRNA和瞬時轉(zhuǎn)染設(shè)計并合成CBX2-target的小干擾RNA(蘇州吉瑪)序列如下：siNC：正義鏈，5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3′；反義鏈，5′- ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。CBX2-siRNA#1：正義鏈，5′-GGAUGACAGUGACUUAGAUTT-3′；反義鏈，5′-AUCUAAGUCACUGUCAUCCTT-3′。 CBX2-siRNA#2：正義鏈，5′- CCAGAUCCUGGUGGCCAAATT -3′；反義鏈，5′- UUUGGCCACCAGGAUCU GGTT-3′。取對數(shù)生長期的SUNE1細(xì)胞，胰酶消化制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個/mL接種在6孔板中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至30%的融合度時使用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(ThermoFisher Cat No.13778030)用7.5 nmol/L siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。孵育48～72 h后收取RNA和蛋白分別檢驗siRNA的敲低效率。

1.3RNA提取和RT-PCR檢測采用Trizol試劑進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取，分光光度儀測定總RNA濃度，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成 cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，ABI7500熒光定量PCR儀上TB Green法檢測CBX2 mRNA表達(dá)情況。

1.4細(xì)胞增殖檢測(CCK-8法)轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化各組細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，按3×104個/mL的密度接種于96孔板中(100 μL/孔)，培養(yǎng)箱中孵育4～6 h。待細(xì)胞貼壁后每孔加入10 μL CCK-8檢測試劑，置于培養(yǎng)箱中避光孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度，采集各孔的A值。

1.5克隆形成實驗將各組細(xì)胞按500個/孔接種到6孔板中。于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d，出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆(>50個細(xì)胞的集落)時，終止培養(yǎng)，用20%甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，計數(shù)并計算克隆形成率。

1.6細(xì)胞周期檢測處于生長期的各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度，加入預(yù)冷的75%乙醇(終濃度為70%)，輕輕吹打混勻，4 ℃固定過夜。離心并收集固定后的細(xì)胞,加100 μL RNase A并充分懸浮細(xì)胞，然后于37 ℃溫箱孵育30 min,再加入400 μL PI并充分混勻，4 ℃避光30 min，上機檢測，記錄激發(fā)光波長488 nm處紅光，檢測細(xì)胞所在周期。

1.7細(xì)胞遷移和侵襲實驗(Transwell法)在siRNA轉(zhuǎn)染后48 h后胰酶消化各組細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/mL。對于遷移試驗，將5×104個細(xì)胞(100 μL，含1%FBS的1640培養(yǎng)基)接種到上室。對于侵襲試驗，上室用250 g/mL基質(zhì)凝膠(康寧)預(yù)包被，然后在37 ℃孵育1 h，隨后將5×104個細(xì)胞接種于上室中。為了誘導(dǎo)細(xì)胞遷移，所有下室均填充有含有20% FBS的1640培養(yǎng)基500 μL。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦拭殘留在上室膜上的細(xì)胞。然后將穿過膜的細(xì)胞用20%甲醇固定并用0.1%結(jié)晶紫染色。使用EVOS倒置顯微鏡對每個小室的5個隨機場進(jìn)行拍照，用Image J軟件計數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計。

1.8Western blot檢測轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA 法定量，以10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，用10% 脫脂奶粉封閉，依次孵育一抗、二抗后，通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 5200，中國上海)檢測。β-actin、β-catenin, cyclin D1和CBX2以1:1000稀釋度使用。二級抗體(山羊兔抗/辣根過氧化物酶)以1:5000稀釋度使用。

2 結(jié) 果

2.1 CBX2在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)RT-PCR分析結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中 CBX2 mRNA表達(dá)水平顯著高于鼻咽慢性炎性組織(P<0.01)，這進(jìn)一步驗證了我們前期芯片檢測的結(jié)果。同時，我們也驗證了CBX2 mRNA在幾株常見鼻咽癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，RT-PCR結(jié)果表明CBX2在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP69。見圖1。

a：組織水平；b：細(xì)胞水平

2.2敲低CBX2的表達(dá)抑制了鼻咽癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力RT-PCR檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染48 h后，與siNC(0.59±0.06)相比，轉(zhuǎn)染CBX2-siRNA#1(0.19±0.11)和#2(0.27±0.06)兩組SUNE1細(xì)胞的CBX2 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。CCK-8實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CBX2-siRNA 48h后，SUNE1細(xì)胞的增殖速率相比siNC組開始顯著下降，其中siRNA#1轉(zhuǎn)染組下降最為顯著(P<0.01)，見圖2。平板克隆形成實驗結(jié)果亦表明，與siNC(54.33±4.51)相比，轉(zhuǎn)染CBX2-siRNA#1(28.33±4.16)和#2(34.67±3.79)后兩組SUNE1細(xì)胞的克隆形成能力顯著降低(P<0.01)，見圖3。上述結(jié)果表明敲低CBX2表達(dá)對SUNE1細(xì)胞的生長及增殖能力具有抑制作用。

與siNC比較，*P<0.01

a：siNC，b: siRNA#1，c: siRNA#2

2.3敲低CBX2表達(dá)降低鼻咽癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力Transwell實驗結(jié)果顯示，與siNC相比，CBX2-siRNA#1和#2的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目均顯著減少(P<0.01 )，見圖4，表1。

圖 4 敲低CBX2后SUNE1細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化比較

表 1 遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)的變化

2.4siRNA轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細(xì)胞SUNE1的細(xì)胞周期變化流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，敲低CBX2表達(dá)后，SUNE1細(xì)胞的周期發(fā)生了改變。相比較于siNC組，轉(zhuǎn)染siRNA#1后，S期的SUNE1細(xì)胞細(xì)胞比例顯著增多，G2/M期的細(xì)胞比例顯著降低，細(xì)胞發(fā)生了S期阻滯。轉(zhuǎn)染siRNA#2后，則G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞顯著降低，細(xì)胞發(fā)生 G0/G1期阻滯(P< 0.01)，見圖5。

a：流式檢測細(xì)胞周期；b：細(xì)胞周期統(tǒng)計圖

2.5Western blot法檢測轉(zhuǎn)染siRNA后SUNE1細(xì)胞中蛋白的相對表達(dá)水平Western blot結(jié)果顯示，與siNC相比，siRNA#1和siRNA#2的鼻咽癌細(xì)胞中LRP6、β-catenin、cyclinD1的蛋白表達(dá)水平降低(P< 0.01)，見圖6。

a：蛋白表達(dá)條帶 ；b：蛋白表達(dá)量統(tǒng)計圖

3 討 論

鼻咽癌是一種多基因參與、遺傳與環(huán)境因素協(xié)同作用的惡性腫瘤，具有明顯的地域和族群聚集分布特征[15]。盡管其對現(xiàn)有放化療等治療手段相對敏感，由于首診中晚期患者居多，治療后易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，總體療效依然不盡如人意[16-17]?？茖W(xué)家們一直致力于探索鼻咽癌的發(fā)病機制[18]，尋找鼻咽癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子標(biāo)志物，用于高危人群篩選、發(fā)病預(yù)測和早期診斷，從而降低該疾病的危害。

基于PcG蛋白在表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮的重要作用，近年來對于CBX蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究愈發(fā)廣泛[19-20]。CBX2蛋白包含了完整的CD、Pc、AT Hook和ATHL結(jié)構(gòu)域，能通過識別和結(jié)合H3K27me3募集PRC1，參與PRC1復(fù)合體的組裝機轉(zhuǎn)錄抑制功能的發(fā)揮[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)機體內(nèi)CBX2表達(dá)紊亂與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，在白血病細(xì)胞中，CBX2的異常缺失直接導(dǎo)致U937細(xì)胞形態(tài)的改變，并且削弱了其增殖能力[23]。在骨肉瘤組織中CBX2表達(dá)顯著上調(diào)，CBX2高表達(dá)與骨肉瘤患者的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、差的化療療效相關(guān)，是不良預(yù)后的影響因素[24]。在卵巢癌中的研究發(fā)現(xiàn)CBX2作為miR-342-5p的靶向基因抑制卵巢癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移并促進(jìn)凋亡，發(fā)揮致癌基因的作用[25],而且它被確定為高等級漿液性卵巢癌的逃逸和驅(qū)動因素[26]。高表達(dá)CBX2的肝癌的生存率明顯降低[27]。CBX2的表達(dá)可預(yù)測食道鱗狀細(xì)胞癌治愈性切除術(shù)后的預(yù)后情況[28]。功能研究發(fā)現(xiàn)，CBX2可能通過Wnt/β-catenin或YAP/β-catenin通路從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖[13, 26]。然而，CBX2在鼻咽癌中的表達(dá)模式、功能及其調(diào)控機制目前尚不明確。

本研究在前期芯片分析的基礎(chǔ)上，利用實時定量PCR檢測了鼻咽癌組織和細(xì)胞株中CBX2的表達(dá)情況，結(jié)果表明CBX2在鼻咽癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于其正常對照，提示CBX2的異常表達(dá)可能與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。為進(jìn)一步探索CBX2是否影響鼻咽癌的惡性生物學(xué)行為，我們利用CBX2 siRNA轉(zhuǎn)染SUNE1細(xì)胞株，并進(jìn)行了CCK8、克隆形成實驗、細(xì)胞周期、遷移及侵襲實驗。實驗結(jié)果顯示，敲低CBX2表達(dá)顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力。細(xì)胞周期結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染不同siRNA片段后，CBX2可能發(fā)生了不同的轉(zhuǎn)錄抑制，導(dǎo)致siRNA#1組和#2組的細(xì)胞周期分別受阻于G0/G1期和S期。對其機制進(jìn)行初步探索，WB檢測結(jié)果顯示，CBX2蛋白表達(dá)水平的下調(diào)可能直接導(dǎo)致影響β-catenin表達(dá)，進(jìn)而抑制其下游周期相關(guān)蛋白CyclinD1及LRP6的表達(dá)。敲低CBX2可能通過Wnt/β-catenin途徑抑制鼻咽癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，鼻咽癌中CBX2的表達(dá)水平升高，且CBX2高表達(dá)能促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，其可能是CBX2通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin途徑來實現(xiàn)的。提示CBX2對鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用，然而其是否可作為鼻咽癌不良預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)及臨床潛在診治靶點仍有待進(jìn)一步研究。