沈忱悠，李桂榮，衛(wèi) 棟，聶曉偉，楊旭生，王 偉，江 成，盛雅婷，鄒 建，趙晶晶，陳靜瑜

0 引 言

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性、進(jìn)展性、與年齡相關(guān)且起因不明的間質(zhì)性肺疾病，確診后若不采取治療措施，患者的平均存活時間僅為3～5年[1-2]?，F(xiàn)有指南推薦的IPF治療藥物為吡非尼酮與尼達(dá)尼布[3-4]，但這兩種藥在阻止病情發(fā)展和提高患者生活質(zhì)量方面的效果均有限，且存在耐藥情況[5-6]。肺移植是目前公認(rèn)的治愈IPF的唯一方案，但考慮到年齡、并發(fā)癥等實(shí)際問題，此治療方案僅適用于少數(shù)IPF患者[7]。IPF的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，近年來被普遍接受的病因機(jī)制包括有遺傳傾向的肺泡上皮反復(fù)的亞臨床損傷及后續(xù)其再生與修復(fù)的失敗[8-9]。肺泡內(nèi)的活性細(xì)胞分泌過剩的細(xì)胞因子與生長因子，從而促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的募集、增殖及分化，導(dǎo)致過量膠原堆積、肺實(shí)質(zhì)的進(jìn)展性瘢痕性改變，最終造成肺功能的不可逆損失[10-11]。目前研究IPF疾病的體內(nèi)模型中，氣道給予博來霉素法因其相對廉價的造模成本、博來霉素誘導(dǎo)后產(chǎn)生的強(qiáng)烈纖維化反應(yīng)以及造模動物與IPF患者相似的病理學(xué)特征而被廣泛應(yīng)用[12]。

轉(zhuǎn)錄因子是一類在特定的空間與時間中協(xié)調(diào)基因表達(dá)的蛋白，其在各類生物進(jìn)程中扮演基因組控制臺的角色，精細(xì)調(diào)控著基因轉(zhuǎn)錄，最終通過誘導(dǎo)或維持細(xì)胞命運(yùn)，參與塑造生物有機(jī)體的表型[13]。轉(zhuǎn)錄因子的活性受其分子生物學(xué)特性影響，即便處在不同的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，多個轉(zhuǎn)錄因子也可同步參與誘導(dǎo)蛋白分子間的相互作用[14]。轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)部無序的結(jié)構(gòu)特征使其相互作用具有一定的可互換性；轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)間相互作用及其對DNA結(jié)合基序的親和性決定了其對靶基因的選擇性和染色體結(jié)合動力學(xué)[14-15]。

已有的病因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)，包括TERT、SFTPA2、MUC5B等眾多基因的異常表達(dá)與IPF的發(fā)病有關(guān)[16-17]，但這其中有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在IPF發(fā)生中表達(dá)與作用的報道則較為罕見。本研究擬對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行篩選及分析，從基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的角度探討肺纖維化的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料博來霉素(日本化藥株式會社)，Bouin固定液(北京百奧萊博)，Masson染色試劑盒(南京建成)，Trizol(美國sigma)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、mRNA qPCR mix熒光定量試劑盒、小鼠轉(zhuǎn)錄因子PCR Array Plate檢測試劑盒(上海沃吉基因)；石蠟包埋機(jī)(常州派斯杰)，切片機(jī)(德國徠卡)，光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯)，核酸凝膠電泳系統(tǒng)(上海天能)，紫外/可見分光光度計(美國NanoDrop)，實(shí)時熒光定量PCR儀(美國ABI)。

1.2動物與分組雄性SPF級C57BL/6小鼠14只，鼠齡6周，體重(25±2)g，購自常州卡文斯實(shí)驗動物有限公司，實(shí)驗動物生產(chǎn)許證號：SCXK(蘇)2016-0010。通過完全隨機(jī)化分組法按1∶1比例將小鼠-分為博來霉素組與對照組，每組7只。博來霉素組按5 mg/kg體重劑量采用移液器鼻腔滴入方式給予博來霉素，對照組給予等劑量等滲鹽水。造模前后兩組小鼠均常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食。造模3周后，安樂處死全部小鼠，低溫?zé)o菌條件下取出肺組織。根據(jù)解剖學(xué)特征將肺組織分為5葉，每只小鼠取一葉用于Masson染色，以評估模型構(gòu)建是否成功；余下4葉存放于超低溫冰箱，用于后續(xù)差異表達(dá)基因的篩選與分析。

1.3方法

1.3.1 Masson染色將新鮮取下的小鼠肺組織浸泡入Bouin固定液中，室溫固定12 h。75%乙醇洗滌脫去黃色后，進(jìn)行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。使用切片機(jī)將包埋好的組織蠟塊切片后，按Masson染色試劑盒說明書進(jìn)行染色。中性樹膠封固后于顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)與肌纖維被染成紅色，膠原纖維則呈藍(lán)色。

1.3.2小鼠轉(zhuǎn)錄因子PCR Array檢測通過簡單隨機(jī)抽樣法-每組各抽取3只小鼠，提取其肺組織總RNA。通過RNA核酸電泳檢測所提取RNA的完整性，使用紫外/可見分光光度計測定其濃度與純度；RNA質(zhì)檢合格后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA。根據(jù)小鼠轉(zhuǎn)錄因子PCR Array試劑盒說明對cDNA樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以測定各組樣品的循環(huán)指數(shù)(即Ct值)。

1.3.3生物信息學(xué)分析通過轉(zhuǎn)錄因子-靶基因在線數(shù)據(jù)庫TRRUST(https://www.grnpedia.org/trrust)對PCR Array篩選出的高表達(dá)與低表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子分別進(jìn)行靶基因預(yù)測。為降低假陽性率，本研究取TRRUST數(shù)據(jù)庫與Harmonizome數(shù)據(jù)庫(https://maayanlab.cloud/Harmonizome)預(yù)測所得的交集基因作為最終靶基因；其中Harmonizome數(shù)據(jù)庫共包括CHEA Transcription Factor Targets Dataset、ENCODE Transcription Factor Targets Dataset、JASPAR Predicted Transcription Factor Targets Dataset、MotifMap Predicted Transcription Factor Targets Dataset、TRANSFAC Curated Transcription Factor Targets Dataset與TRANSFAC Predicted Transcription Factor Targets Dataset等6個轉(zhuǎn)錄因子靶基因數(shù)據(jù)集，本研究將至少由其中2個數(shù)據(jù)集共同預(yù)測所得的靶基因作為Harmonizome數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果。使用在線生物信息數(shù)據(jù)庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)對預(yù)測所得的靶基因進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路預(yù)測，其中GO分析包括生物進(jìn)程、細(xì)胞組分以及分子功能。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析生物信息學(xué)分析以小鼠轉(zhuǎn)錄因子PCR Array檢測結(jié)果為基礎(chǔ)，采用2-ΔCt法計算相對表達(dá)倍數(shù)、t檢驗法計算P值，選取表達(dá)倍數(shù)變化值≥2且P值<0.05的基因作為差異基因。使用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠肺纖維化模型建立Masson染色結(jié)果顯示：對照組肺組織絕大部分區(qū)域呈紅色或淡紅色，僅部分血管周圍被染成藍(lán)色，且著色較淺，提示肺組織無明顯異常；博來霉素組的藍(lán)染區(qū)域則明顯增加，且著色加深，提示肺組織膠原纖維堆積，肺纖維化模型構(gòu)建成功。見圖1。

a.對照組；b.博來霉素組

2.2小鼠肺組織轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)譜以Fold Change≥2、P<0.05作為篩選條件對兩組小鼠肺組織PCR Array結(jié)果進(jìn)行分析，可見在本次Array檢測的90個基因中，紅框標(biāo)出的6個基因在博來霉素組與對照組中各自積聚到一個集中區(qū)域，見圖2。與聚類圖一致，火山圖結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)譜中，與對照組相比，博來霉素處理組中共有6個差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其中上調(diào)者1個，為EGR1；下調(diào)者5個，分別為AR，ESR1，F(xiàn)OXG1，HAND2，HSF1，見圖3。提示上述差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子可能參與肺纖維化的發(fā)生。

1-3：對照組； 4-6：博來霉素組

圖 3 轉(zhuǎn)錄因子火山圖

2.3差異轉(zhuǎn)錄因子的靶基因預(yù)測通過TRRUST在線數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行靶基因預(yù)測，得到上調(diào)靶基因71個，下調(diào)靶基因55個。見表1。使用Harmonizome數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗證，得到至少由其2個數(shù)據(jù)集共同預(yù)測所得的上調(diào)靶基因4768個，下調(diào)靶基因2267個。見圖4。對TRRUST與Harmonizome預(yù)測結(jié)果取交集，最終獲得差異轉(zhuǎn)錄因子的靶基因共43個，其中上調(diào)靶基因27個，下調(diào)靶基因16個。

表 1 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的靶基因預(yù)測

a：差異上調(diào)；b：差異下調(diào)

2.4GO富集分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測所得的靶基因進(jìn)行GO富集分析。結(jié)果顯示，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子的靶基因在生物進(jìn)程方面主要參與對細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、凋亡、衰老等過程，在細(xì)胞組分方面主要涉及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞溶質(zhì)等組分，在分子功能方面與蛋白結(jié)合、大分子復(fù)合物的結(jié)合、整合素結(jié)合等功能相關(guān)；下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子的靶基因在生物進(jìn)程方面主要參與以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA聚合酶II啟動子相關(guān)的轉(zhuǎn)錄正向調(diào)控、對神經(jīng)元分化的正向調(diào)控等過程，在細(xì)胞組分方面主要涉及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)等組分，在分子功能方面與蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子活性等功能相關(guān)。見圖5。

a：差異上調(diào)；b：差異下調(diào)

2.5KEGG信號通路分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫對差異轉(zhuǎn)錄因子的靶基因進(jìn)行KEGG信號通路分析。結(jié)果顯示，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子的靶基因富集于58條信號通路中，主要參與腫瘤相關(guān)通路、MAPK通路、PI3K-AKT通路、FoxO通路、卡博氏肉瘤病毒感染等過程；下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子的靶基因富集于50條信號通路中，主要參與HIF-1通路、腫瘤相關(guān)microRNAs通路、糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE通路、麻疹、化學(xué)致癌受體激活等過程。見圖6。

a：差異上調(diào)；b：差異下調(diào)

3 討 論

IPF因其不可逆的病程與特定的治療手段，被認(rèn)為是一類特殊的間質(zhì)性肺疾病。未接受肺移植的IPF患者在確診后的中位生存期僅為3～5年，其預(yù)后較多數(shù)腫瘤差，被稱為不是癌癥的癌癥[18]。全球范圍內(nèi)，IPF的發(fā)病率約為每10萬人50例，且發(fā)病率隨著年齡的增長而增加，大部分患者確診時已超過50歲[19]。隨著世界老齡化社會的到來，IPF勢必會給患者的身體、心理以及社會經(jīng)濟(jì)造成巨大負(fù)擔(dān)[20]。IPF的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，其錯綜復(fù)雜的發(fā)病機(jī)理與肺泡上皮修復(fù)失調(diào)、宿主防御、細(xì)胞衰老、免疫應(yīng)答異常、成纖維細(xì)胞增殖相關(guān)激酶活性改變等眾多因素相關(guān)[21]。

在協(xié)同調(diào)控IPF發(fā)生發(fā)展的多種因素中，轉(zhuǎn)錄因子作為一類從時間、空間上精確調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的生物分子，它們通過與啟動子結(jié)合來調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)，在IPF的發(fā)病進(jìn)程中起著重要作用。例如，核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)與其下游的NOD樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域3(NOD-likereceptorfamilypyrin domaincontaining3，NLRP3)炎癥小體組成的NF-κB/NLRP3通路通過調(diào)控炎癥反應(yīng)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程參與了肺纖維化的發(fā)生[22-23]；在轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)誘導(dǎo)的肺纖維化細(xì)胞模型中，被MAPK通路元件激活的活化劑蛋白1(activator protein 1，AP-1)參與了對人肺成纖維細(xì)胞向肺纖維化的效應(yīng)細(xì)胞肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)控[24]；NF-κB與AP-1亦可通過調(diào)控C-C基序趨化因子配體2的表達(dá)來參與TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)形成[25]；另外，Smad家族的Smad2、Smad3及Smad7均在IPF的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用[26]。

近年來，隨著高通量基因芯片與測序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的科研工作者將該類技術(shù)應(yīng)用于包括IPF在內(nèi)各種疾病的研究。在多數(shù)芯片或測序分析中，由于轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化程度在差異基因中常無法排至前列，其重要性容易被忽略；而通過預(yù)測靶向調(diào)控差異基因的轉(zhuǎn)錄因子等方法，雖可在一定程度上挖掘IPF的潛在調(diào)節(jié)分子，但受預(yù)測軟件種類、篩選條件設(shè)定等因素影響，結(jié)果往往會出現(xiàn)不統(tǒng)一或假陽性。基于此，為進(jìn)一步系統(tǒng)地研究轉(zhuǎn)錄因子在IPF發(fā)生過程中的作用，我們對正常組與IPF模型組小鼠的肺組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄因子PCR Array檢測。在本次Array檢測的90個基因中，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，博來霉素組中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子共6個，其中上調(diào)基因1個，為EGR1；下調(diào)基因5個，為AR，ESR1，F(xiàn)OXG1，HAND2，HSF1。

早期生長反應(yīng)蛋白1(early growth response1，EGR1)作為可誘導(dǎo)的鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子之一，參與調(diào)控包括炎癥、基質(zhì)形成、凋亡等在內(nèi)的多項生物進(jìn)程。Chu等發(fā)現(xiàn)在二氧化硅誘導(dǎo)的人肺上皮細(xì)胞中，EGR1可被上游的MAPK通路激活[27]；Ghatak等[28]亦在TGF-β誘導(dǎo)的小鼠肺成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了活化的ERK-EGR1通路。在本研究博來霉素誘導(dǎo)的小鼠模型中，EGR1表達(dá)上調(diào)的結(jié)果與上述體外實(shí)驗的文獻(xiàn)報道一致，提示EGR1可能在IPF的發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用。雄激素受體(androgen receptor，AR)是一種具有配體活性的轉(zhuǎn)錄因子，屬于類固醇激素受體家族。AR介導(dǎo)雄性激素在男性性發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，并具有維持體內(nèi)激素平衡、刺激蛋白質(zhì)合成代謝等生理功能。肺部疾病相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，AR突變與野生雄性小鼠建立的哮喘模型中，AR突變型較野生型具有更強(qiáng)烈的氣道炎癥反應(yīng)，提示AR可能對哮喘的炎癥過程具有保護(hù)作用[29]；Leach等[30]報道，AR通過調(diào)控其靶基因TMPRSS2參與冠狀病毒感染宿主細(xì)胞的過程，抗AR配體藥物可有效降低SARS冠狀病毒對人肺上皮細(xì)胞的感染率，該發(fā)現(xiàn)為臨床防治新型冠狀病毒肺炎提供了潛在用藥靶點(diǎn)；Mehrad等[31]在對IPF患者肺組織進(jìn)行的免疫組化檢測中發(fā)現(xiàn)AR染色呈陰性，這與本研究AR在小鼠IPF模型中表達(dá)下降的結(jié)果并不矛盾，因免疫組化結(jié)果無法精確定量，故AR在IPF中的表達(dá)變化及其中機(jī)制仍待進(jìn)一步驗證與探究。與AR相似，雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)也是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，后者通過調(diào)控可被雌激素誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄，參與了生長、代謝、性發(fā)育、妊娠等生理過程，在非生殖系統(tǒng)組織中亦有表達(dá)。在ESR1與IPF相關(guān)的研究中，Smith等通過建立肺纖維化體外與體內(nèi)模型，均發(fā)現(xiàn)ESR1表達(dá)量的降低，而介導(dǎo)ESR1表達(dá)變化的上游基因即為經(jīng)典促纖維化因子TGF-β[32-33]；Elliot等[34]則在IPF患者肺組織中發(fā)現(xiàn)ESR1表達(dá)上調(diào)，且該現(xiàn)象與microRNA let-7的調(diào)控作用有關(guān)。由于細(xì)胞與動物層面的實(shí)驗畢竟無法真實(shí)模擬人體疾病進(jìn)程，且轉(zhuǎn)錄因子及疾病相關(guān)基因的表達(dá)存在時間、空間特異性，故ESR1在IPF中的表達(dá)變化及其中機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。熱休克轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor 1，HSF1)是一種在溫度上升等應(yīng)激狀態(tài)下可被迅速誘導(dǎo)并表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，HSF1通過與熱休克蛋白結(jié)合行使其在生長發(fā)育、細(xì)胞凋亡等方面的調(diào)節(jié)功能。Chen等[35]發(fā)現(xiàn)，HSF1可能通過YY1/HSF1/miR-214/THY1作用軸參與了IPF的發(fā)生。本研究中篩選得到的另外兩個差異轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白G1(forkhead box G1，F(xiàn)OXG1)以及心臟與神經(jīng)嵴衍生物表達(dá)蛋白2分別在神經(jīng)發(fā)育與心臟形態(tài)發(fā)生中起著重要調(diào)控作用，然而兩者與IPF的關(guān)系尚鮮有報道，提示其在IPF中的作用值得進(jìn)一步研究。

轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控基因表達(dá)的重要分子，我們通過數(shù)據(jù)庫對本研究中差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的靶基因進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，上調(diào)與下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子的靶基因數(shù)量分別為27和16個。為進(jìn)一步探索上述差異轉(zhuǎn)錄因子功能，我們對相應(yīng)靶基因進(jìn)行了GO注釋與KEGG通路富集分析，其結(jié)果可為后續(xù)轉(zhuǎn)錄因子在IPF中作用機(jī)制的研究提供一定的參考。功能注釋與通路預(yù)測結(jié)果顯示，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子主要與調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程、細(xì)胞質(zhì)、蛋白結(jié)合等功能有關(guān)，主要通過MAPK、PI3K-AKT、FoxO等信號通路參與肺纖維化的發(fā)生；下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子主要與以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞質(zhì)、DNA結(jié)合等功能有關(guān)，主要通過HIF-1、p53、Apelin等信號通路參與肺纖維化的病理生理進(jìn)程。其中MAPK(6個靶基因)、PI3K-AKT(5個靶基因)、HIF-1(3個靶基因)等信號通路目前已被廣泛報道參與IPF的發(fā)病進(jìn)程[36-37]。

綜上所述，本研究使用PCR Array檢測博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況，通過篩選得到6個差異因子(1個上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子：EGR1；5個下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子：AR，ESR1，F(xiàn)OXG1，HAND2和HSF1)，運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測了相應(yīng)的靶基因，對后者進(jìn)行功能注釋和通路富集分析，并結(jié)合現(xiàn)有研究報道初步探討了差異轉(zhuǎn)錄因子在IPF發(fā)病過程中可能起到的作用。下一步，我們將通過實(shí)時定量PCR、蛋白免疫印跡等技術(shù)驗證差異轉(zhuǎn)錄因子在肺纖維化小鼠模型以及IPF患者肺組織與血清中的表達(dá)變化，并在IPF體外與體內(nèi)模型中對其進(jìn)行功能學(xué)研究。我們的研究結(jié)果可為IPF的臨床防治與早期診斷提供潛在的用藥靶點(diǎn)與分子標(biāo)志物。