李星閱，任自敬，王 越，樊瑞雪，周佩洋

0 引 言

腦卒中因其高發(fā)病率、致死率和致殘率成為我國(guó)第二大致死病因，其中缺血性卒中約占腦卒中的80%，嚴(yán)重威脅著我國(guó)居民的身體健康[1]。在急性缺血性卒中(acute ischemic stroke，AIS)發(fā)生過(guò)程中，腦組織迅速缺血缺氧，使神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞等更多地進(jìn)行無(wú)氧代謝合成能量，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高[2]。大量活性氧、炎性因子等有害物質(zhì)損傷血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)完整性，導(dǎo)致外周毒性細(xì)胞和分子進(jìn)入大腦加重腦損傷[3]。再灌注治療會(huì)因血腦屏障損傷出現(xiàn)腦水腫和出血性轉(zhuǎn)化的嚴(yán)重并發(fā)癥。因此，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激引起的損傷，對(duì)于保護(hù)AIS血腦屏障功能、減輕神經(jīng)功能損傷至關(guān)重要。

鞘氨醇-1-磷酸酯受體5 (sphingosine 1-phosphate 5 receptor,S1PR5)是1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P)的5個(gè)受體之一，在神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、增殖、分化及存活，且與多發(fā)性硬化、亨廷頓病、年齡相關(guān)認(rèn)知障礙等疾病的病理機(jī)制有關(guān)[4-6]。研究表明，在導(dǎo)致多發(fā)性硬化的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中，S1PR5可維持血腦屏障完整性并減輕內(nèi)皮細(xì)胞的免疫炎癥反應(yīng)[4]。在亨廷頓病動(dòng)物模型中，S1PR5特異性激動(dòng)劑A971432可通過(guò)調(diào)節(jié)Erk等途徑保持血腦屏障的完整性[6]。但是S1PR5在AIS中的作用研究較少，S1PR5是否可在AIS的血腦屏障氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮保護(hù)作用尚不清楚。本研究在體外利用H2O2處理腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞模擬AIS發(fā)生時(shí)的氧化應(yīng)激環(huán)境，并給予S1PR5特異性激動(dòng)劑A971432，研究激動(dòng)S1PR5對(duì)氧化應(yīng)激損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，以期為臨床上治療AIS提供一定思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系bEnd.3(武漢普諾賽)。S1PR5特異性激動(dòng)劑A971432(Tocris Bioscience)，過(guò)氧化氫(H2O2)和熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖(FITC-dextran)(Sigma)。Transwell小室(6.5 mm直徑，0.4 μm孔徑，聚碳酸酯)(Corning)。CCK-8試劑盒(Biosharp)?；钚匝鯔z測(cè)試劑盒(Applygen)。α-Tublin多克隆抗體(Sigma)，Bcl2多克隆抗體、ZO-1多克隆抗體、Occludin多克隆抗體、Nrf2多克隆抗體、HO-1多克隆抗體(Proteintech)，β-actin多克隆抗體、GAPDH多克隆抗體、S1PR5多克隆抗體、VE-Cadherin多克隆抗體、Erk1/2多克隆抗體及Bax多克隆抗體(Absin)，MMP-9多克隆抗體、p-Erk1/2多克隆抗體(CST)，SOD1及SOD2多克隆抗體(Santa Cruz)、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，標(biāo)記山羊抗兔/小鼠 IgG、Dy-Light 488 標(biāo)記的山羊抗兔二抗(Abbkine)。SpectraMax i3x酶標(biāo)儀(Molecular Devices)。電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)。倒置熒光顯微鏡(Olympus)。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清(Gibico)的杜氏改良培養(yǎng)基(Gibico)培養(yǎng)單層bEnd.3，培養(yǎng)箱設(shè)置為37 ℃、5% CO2。在細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)(密度約為80%～90%)進(jìn)行傳代、鋪板。

1.2.2細(xì)胞活力檢測(cè)96孔板中接種bEnd.3細(xì)胞(6×103個(gè)/孔)，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至約80%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：①參考文獻(xiàn)[7]，用不同濃度的H2O2(0.5、1、2、4 mmol/L)處理1.5 h后，換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，根據(jù)細(xì)胞活力變化，確定H2O2濃度。②參考文獻(xiàn)[4-5]，給予不同濃度A971432(1、5、10、20、50 μmol/L)單獨(dú)處理bEnd.3細(xì)胞24 h，檢測(cè)細(xì)胞活力變化。③A971432(5、10、20 μmol/L)預(yù)處理bEnd.3細(xì)胞24 h后，再給予H2O2處理1.5 h，檢測(cè)細(xì)胞活力變化。

每次處理結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值(A)。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.3分組通過(guò)Western blot檢測(cè)不同濃度H2O2對(duì)bEnd.3連接蛋白及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響。結(jié)合CCK8及Western blot結(jié)果篩選出H2O2適宜作用濃度為2 mmol/L，A971432適宜作用濃度為5、10、20 μmol/L。主要實(shí)驗(yàn)分為5組：對(duì)照組、H2O2組、H2O2+5 μmol/L A971432組、H2O2+10 μmol/L A971432組、H2O2+20 μmol/L A971432組。處理方式：5、10、20 μmol/L A971432預(yù)處理細(xì)胞24 h后，給予2 mmol/L H2O2處理1.5 h。

1.2.4血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性測(cè)定參考文獻(xiàn)方法[7]測(cè)量血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性。將bEnd. 3細(xì)胞(1×105)接種在Transwell上室中，培養(yǎng)24 h。處理結(jié)束后，棄掉上下室培養(yǎng)基，均換成不含營(yíng)養(yǎng)因子和血清的培養(yǎng)基，上室含終濃度為1 mg/mL的FITC-dextran (相對(duì)分子質(zhì)量40 000)。37 ℃孵育，分別在0.5、1、1.5 h從下室中吸取100 μL液體置入不透光96孔板中，設(shè)置酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為激發(fā)光490 nm，吸收光520 nm進(jìn)行讀數(shù)，根據(jù)各孔熒光強(qiáng)度來(lái)反映內(nèi)皮通透性。不同時(shí)間點(diǎn)取完樣后，補(bǔ)入等體積培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Western blot分析處理結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗后在冰上用含有蛋白酶抑制劑和PMSF的蛋白裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)濃度，每組取30 μg蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%牛奶封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜(S1PR5，1∶800；Bax，1∶800；Bcl2，1∶1000；ZO-1，1∶1000；VE-Cadherin，1∶800；Occludin，1∶1000；Nrf2，1∶600；HO-1，1∶600；p-Erk1/2，1∶1000；Erk1/2，1∶1000；β-actin，1∶1000；GAPDH，1∶1000；α-Tublin，1∶3000)。次日，TBST洗膜3次，每次6 min，然后將膜與相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗室溫下孵育1.5 h。TBST洗膜后，用ECL顯色液顯色，并用Image J軟件對(duì)蛋白灰度值半定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6免疫熒光染色處理結(jié)束后，PBS洗2遍，用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細(xì)胞25 min，PBS洗滌后室溫封閉2 h(含1%羊血清的PBST)，與一抗4℃孵育過(guò)夜(ZO-1, 1∶300)。次日，回收一抗，PBS洗3遍，與Dy-Light 488二抗在室溫下避光孵育2 h，PBS洗3遍后與DAPI孵育，于熒光顯微鏡下拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7活性氧檢測(cè)處理結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3遍，加入用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋好的DCFH-DA探針(終濃度為10 μmol/L)，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育25 min，PBS洗3遍，然后用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，PBS洗3遍后進(jìn)行熒光檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 H2O2誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞S1PR5表達(dá)下調(diào)Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組bEnd.3細(xì)胞的S1PR5蛋白表達(dá) (1.00±0.01) 相比，H2O2組(0.59±0.03)明顯降低(P<0.01)。

2.2激動(dòng)S1PR5抑制H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮高通透性和相關(guān)蛋白的改變?cè)? h和1.5 h檢測(cè)到，與對(duì)照組相比，H2O2組熒光值顯著升高，內(nèi)皮通透性增加(P<0.05)；與H2O2相比，H2O2+5、10、20 μmol/L A971432組的熒光值顯著降低，提示A971432預(yù)處理減輕了H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮高通透性(P<0.05)，見(jiàn)圖1。Westernblot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，暴露于H2O2的bEnd.3細(xì)胞ZO-1、VE-Cadherin、Occludin的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，MMP-9蛋白顯著增加(P<0.01)；與H2O2組比，H2O2+5、10、20 μmol/L A971432組可以增加連接蛋白的表達(dá)水平(P<0.01)，降低MMP-9表達(dá)水平(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，#P<0.05

1：對(duì)照組；2：H2O2組；3：H2O2+5 μmol/L A971432組；4：H2O2+10 μmol/L A971432組；5：H2O2+20 μmol/L A971432組

連接分子ZO-1的免疫熒光結(jié)果顯示，對(duì)照組在細(xì)胞連接處連續(xù)分布而且熒光強(qiáng)度更高，H2O2損傷導(dǎo)致細(xì)胞膜上分布斷續(xù)且整體熒光強(qiáng)度降低，而這一現(xiàn)象在H2O2+5、10、20 μmol/L A971432組中有所改善，見(jiàn)圖3。

圖 3 激動(dòng)S1PR5抑制H2O2誘導(dǎo)的ZO-1熒光強(qiáng)度改變(×400)

2.3激動(dòng)S1PR5抑制H2O2誘導(dǎo)的bEnd.3細(xì)胞凋亡與H2O2組[(75.33±3.76)%]相比，H2O2+10、20 μmol/L A971432組[(93.34±0.49)%, (100.60±7.29)%]可以明顯逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H2O2組Bax/Bcl2比值和Caspase-3的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與H2O2組相比，H2O2+5、10、20 μmol/L A971432組的Bax/Bcl2比值和Caspase-3表達(dá)顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖4。選擇對(duì)凋亡影響較大的20 μmol/L A971432研究通路相關(guān)蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2+20 μmol/L A971432組可以顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的p-Erk1/2與Erk1/2比值增高(P<0.01)，見(jiàn)圖5。顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化，與對(duì)照組比，H2O2處理后細(xì)胞明顯回縮、形態(tài)不規(guī)則、排列疏松，且漂浮細(xì)胞增多。與H2O2組比，H2O2+5、10、20 μmol/L A971432組的細(xì)胞狀態(tài)維持良好，漂浮細(xì)胞更少，見(jiàn)圖6。

1：對(duì)照組；2：H2O2組；3：H2O2+5 μmol/L A971432組；4：H2O2+10 μmol/L A971432組；5：H2O2+20 μmol/L A971432組

1：對(duì)照組；2：H2O2組；3：H2O2+20 μmol/L A971432組

a：對(duì)照組；b：H2O2組；c：H2O2+5 μmol/L A971432組；d：H2O2+10 μmol/L A971432組；e：H2O2+20 μmol/L A971432組

2.4激動(dòng)S1PR5通過(guò)上調(diào)Nrf2/HO-1通路減輕H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)圖7顯示，與對(duì)照組相比，H2O2組的Nrf2、HO-1、SOD1和SOD2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。與H2O2組比，H2O2+5、10、20 μmol/L A971432組可以顯著增加Nrf2、HO-1、SOD1和SOD2蛋白表達(dá)水平(P<0.01)。

1：對(duì)照組；2：H2O2組；3：H2O2+5 μmol/L A971432組；4：H2O2+10 μmol/L A971432組；5：H2O2+20 μmol/L A971432組

DCFH-DA探針?lè)z測(cè)細(xì)胞活性氧水平，如圖8所示，與對(duì)照組相比，H2O2組中綠色熒光強(qiáng)度明顯增加，代表細(xì)胞內(nèi)的總活性氧含量顯著升高。與H2O2組相比，給予5、10和20 μmol/L A971432預(yù)處理能顯著降低細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度，減少活性氧含量。

圖 8 激動(dòng)S1PR5降低H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)總活性氧(×100)

3 討 論

BBB主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells, BMVECs)和鄰近的血管周圍細(xì)胞組成，是血液和大腦之間具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的生化及物理屏障，在調(diào)節(jié)血源性分子進(jìn)入大腦及維持神經(jīng)傳遞所需的離子穩(wěn)態(tài)微環(huán)境過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8]。BBB的完整性受到BMVECs之間的緊密連接分子(Claudin-5、Occludin和ZO-1)和黏附連接分子(VE-Cadherin)調(diào)節(jié)[9]。在AIS期間，急劇增加的活性氧可直接或者間接破壞BBB的完整性導(dǎo)致外周毒性細(xì)胞和分子進(jìn)入大腦加重腦損傷[10]。H2O2是一種具有代表性和穩(wěn)定性的活性氧，本研究選用外源性H2O2處理bEnd.3細(xì)胞，模擬AIS發(fā)生后BBB所處的氧化應(yīng)激環(huán)境。通過(guò)CCK8篩選發(fā)現(xiàn)2 mmol/L H2O2處理1.5 h能顯著降低bEnd.3細(xì)胞活力(P<0.01)，升高胞內(nèi)總活性氧水平，且明顯減少ZO-1、VE-Cadherin和Occludin 的蛋白表達(dá)，是一種穩(wěn)定有效的氧化應(yīng)激模型。

S1P是一種具有多種生物活性的鞘磷脂代謝物，它通過(guò)結(jié)合5個(gè)受體(S1PR1-S1PR5)影響細(xì)胞的遷移、增殖、分化、存活等生物過(guò)程[11]。其中S1PR1、S1PR2和S1PR3在血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)，S1PR4主要在免疫細(xì)胞中表達(dá)，S1PR5在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分布較多[12-15]。在體外，激動(dòng)S1PR5通過(guò)降低NF-κB活性來(lái)減少人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫炎癥反應(yīng)，并可通過(guò)減少單核細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移來(lái)維持BBB完整性[4]；新型的S1PR5選擇激動(dòng)劑A971432可提高人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮電阻進(jìn)而影響內(nèi)皮完整性[5]。長(zhǎng)期低劑量服用A971432(0.1 mg/kg)可通過(guò)調(diào)節(jié)Akt和Erk等通路來(lái)減少亨廷頓模型小鼠的突變蛋白聚集并保持BBB完整性[6]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，A971432(0.1 mg/kg)可有效改善小鼠與年齡相關(guān)的認(rèn)知障礙[5]。研究顯示，短暫性大腦中動(dòng)脈缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭?，S1PR5在造模后第1天和第5天在梗死周圍區(qū)高表達(dá)，到第28天逐漸降低[16]。但是S1PR5對(duì)AIS后BBB完整性的作用仍缺少直接的證據(jù)。

本研究用H2O2干預(yù)bEnd.3模擬AIS后BBB所處氧化應(yīng)激環(huán)境，發(fā)現(xiàn)H2O2處理后S1PR5表達(dá)降低。給予S1PR5選擇性激動(dòng)劑A971432預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)FITC標(biāo)記葡聚糖滲透增加的現(xiàn)象。通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)到激活S1PR5可以通過(guò)增加ZO-1、VE-Cadherin和Occludin的蛋白表達(dá)，增加內(nèi)皮的連接功能和完整性，從而減少H2O2損傷造成的血管內(nèi)皮高通透性。在AIS動(dòng)物模型中，MMP-9高表達(dá)是導(dǎo)致血腦屏障破壞和出血轉(zhuǎn)化的重要原因[17]。本實(shí)驗(yàn)中A971432也可顯著降低H2O2處理后MMP-9的蛋白表達(dá)，從減少損傷的方面減少內(nèi)皮屏障的破壞。

H2O2處理引起的過(guò)度損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡發(fā)生[7,18]。在損傷刺激下，細(xì)胞凋亡可被內(nèi)源性的線粒體途徑和外源性的死亡受體途徑激活。內(nèi)源性途徑中，Bcl2和Bax蛋白分別發(fā)揮著抗凋亡和促凋亡的作用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活；而外源性途徑中，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物形成后，將激活Caspase-8及下游的效應(yīng)器Caspase-3和Caspase-7[19]。與先前研究一致[18]，我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2會(huì)打破Bax和Bcl2之間的平衡，增加Bax與Bcl2的比值，并顯著增加凋亡的關(guān)鍵蛋白Caspase-3的表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞暴露于H2O2會(huì)激活細(xì)胞存活相關(guān)的復(fù)雜信號(hào)通路，Erk通路最常與細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和分化的調(diào)節(jié)相關(guān)，但不少研究表明Erk的激活在H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[7,18]，用Erk上游激酶 Mrk的特異性抑制劑U0126可以顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[18]。在本研究中，H2O2處理bEnd.3顯著增加p-Erk1/2與Erk1/2蛋白的比值，與先前研究一致；而激動(dòng)S1PR5可以顯著降低凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)以及p-Erk1/2與Erk1/2蛋白的比值，結(jié)合既往研究推測(cè)A971432激動(dòng)S1PR5后減輕細(xì)胞凋亡可能與抑制Erk通路激活有關(guān)，而激動(dòng)S1PR5是否通過(guò)其他機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡并保護(hù)血管內(nèi)皮通透性，后期將進(jìn)一步研究。

氧化應(yīng)激是AIS血腦屏障損傷及再灌注損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，過(guò)量的活性氧能誘導(dǎo)血管擴(kuò)張并增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，進(jìn)而加劇血腦屏障完整性和功能破壞。在本研究中，A971432預(yù)處理可以減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)總活性氧，而且通過(guò)增加抗氧化分子Nrf2及其下游靶分子HO-1和下游抗氧化酶SOD1、SOD2的蛋白表達(dá)，來(lái)減輕H2O2造成的氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，本研究顯示在H2O2損傷后，bEnd.3的S1PR5表達(dá)下調(diào)，A971432選擇性激動(dòng)S1PR5可以維持內(nèi)皮屏障功能并減少細(xì)胞凋亡，這可能與抑制Erk通路有關(guān)，同時(shí)激動(dòng)S1PR5可以通過(guò)上調(diào)Nrf2/HO-1信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗氧化作用，但A971432總體的保護(hù)作用沒(méi)有明顯的濃度依賴性。結(jié)合S1PR5在急性氧化應(yīng)激損傷中對(duì)血管內(nèi)皮完整性的保護(hù)作用，我們推測(cè)S1PR5可以作為AIS血腦屏障損傷治療的重要靶分子。后期將增加糖氧剝奪模型以及腦缺血再灌注動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)，來(lái)進(jìn)一步探索S1PR5在AIS中的作用及分子機(jī)制，為AIS的臨床治療提供一定思路。