楊曉江，蔣明春，武振方，遆云帆，魯經(jīng)緯，趙建寧，孫國靜

0 引 言

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)容易引發(fā)骨折甚至導(dǎo)致骨缺損的發(fā)生，由于其骨再生能力弱且新骨力學(xué)不穩(wěn)，在臨床治療中面臨巨大挑戰(zhàn)[1-2]。盡管多孔鈦合金支架是目前修復(fù)骨缺損最廣泛的材料之一[3]，但由于其缺乏骨誘導(dǎo)和局部抗骨質(zhì)疏松作用，限制了其在OP骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用。因此可以考慮將抗骨質(zhì)疏松藥物如唑來膦酸(Zoledronic Acid，ZOL)與支架相復(fù)合，從而達(dá)到局部給藥促進(jìn)OP骨缺損的修復(fù)。明膠納米微球(gelatin nanoparticles，GNPs)藥物遞送體系具有密封性好，穩(wěn)定性高，可控緩釋等優(yōu)點(diǎn)[4]，因此可以考慮將其作為中間橋梁，介導(dǎo)ZOL與支架的復(fù)合，從而達(dá)到局部緩釋給藥抗骨質(zhì)疏松的效果。聚多巴胺(polydopamine，PDA)是一種常用的材料表面修飾物可以促進(jìn)生物分子黏附[5]，可以提高包裹ZOL的GNPs在多孔鈦合金支架上的負(fù)載效率。因此，本研究通過將“PDA涂層多孔鈦合金支架”與“ZOL-GNPs”相結(jié)合，構(gòu)建一種不但具有良好機(jī)械性能與生物相容性，而且還可以局部緩釋給藥抗骨質(zhì)疏松的新型多孔鈦合金支架，為OP骨缺損的臨床治療提供新思路、新方法。

1 材料與方法

1.1 負(fù)載ZOL-GNPs的PDA涂層多孔鈦合金支架的制備根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的孔徑及孔隙率[6]，利用Magics軟件構(gòu)建多孔鈦合金支架三維模型(單胞結(jié)構(gòu)：正十二面體單元，支架孔徑：(520±35)μm，孔隙率：(57.0±4.2)%；然后基于電子束熔融技術(shù)(Electron Beam Melting，EBM)利用醫(yī)用Ti-6Al-4V粉末進(jìn)行PDA涂層多孔鈦合金支架制備(圓柱支架：高度6 mm，直徑5 mm)[7]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道采用去溶劑化法制備GNPs，然后將GNPs浸入不同濃度的ZOL溶液中(1、10、50、100、500 μmol/L)制備ZOL-GNPs[8]。將PDA涂層多孔鈦合金支架與不同濃度的ZOL-GNPs放入離心管于4 ℃冰箱搖床孵育12 h，再于-80 ℃冰箱預(yù)冷凍10 h后負(fù)壓凍干，負(fù)載ZOL-GNPs的PDA涂層多孔鈦合金支架制備完成，電鏡觀察其表面形態(tài)特征。對照組：不含ZOL的PDA涂層多孔鈦合金支架(0μmol/L)；實(shí)驗(yàn)組：含不同濃度ZOL-GNPs的PDA涂層多孔鈦合金支架(1、10、50、100、500 μmol/L)。

1.2負(fù)載ZOL-GNPs的PDA涂層多孔鈦合金支架的載藥釋放檢測將不同ZOL濃度的新型多孔鈦合金支架與PBS在離心管中充分混合接觸，固定于恒溫?fù)u床(37 ℃)；分別在第1、4、7、14、21和28天取出離心管，利用高效液相色譜儀(型號(hào)AH1260，Agilent，USA)及ZOL濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出ZOL釋藥量及釋藥百分比。

1.3新型多孔鈦合金支架浸提液條件下破骨細(xì)胞的骨吸收能力檢測根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)(醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)：ISO 10993-5)，將支架經(jīng)r射線照射消毒及PBS沖洗后與a-MEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%青-鏈霉素)按照0.2 g/mL比例混合孵育24 h，其上清液與無血清的а-MEM培養(yǎng)基混合稀釋后加入10%胎牛血清無菌保存，新型多孔鈦合金支架的浸提液配置完成。利用Osteo Assay Surface Plates (Corning, MA)進(jìn)行骨吸收陷窩分析[9]。將BMMs (2×105cells)接種于微孔板中，6 h后將培養(yǎng)基替換為上述浸提液，并補(bǔ)充M-CSF(25 ng/mL)和RANKL(25 ng/mL)繼續(xù)孵育，10 d后將破骨細(xì)胞用5%次氯酸鈉溶液溶解；使用光學(xué)顯微鏡獲得吸收陷窩圖像，同時(shí)使用ImageJ software測量吸收陷窩面積。

1.4新型多孔鈦合金支架浸提液條件下破骨細(xì)胞的凋亡檢測不同濃度ZOL的復(fù)合支架浸提液與BMMs共培養(yǎng)7 d待破骨細(xì)胞成熟后，進(jìn)行離心(以離心半徑10 cm、1500 r/min,5 min)，棄上清液；使用PBS溶液洗滌細(xì)胞，再次離心(1500 r/min,5 min)，棄上清液，并使用PBS溶液配制10%的破骨細(xì)胞懸液。按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行Annexin V-FITC/PI雙熒光染色，室溫避光放置15 min后，加入300 μL的PBS重懸細(xì)胞，混合均勻后使用流式細(xì)胞儀檢測；使用Cell Quest軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制單色散點(diǎn)圖(橫坐標(biāo)：FITC，縱坐標(biāo)：PI)。

1.5新型多孔鈦合金支架對OP骨缺損影響的動(dòng)物體內(nèi)研究

1.5.1 OP骨缺損模型構(gòu)建選擇新西蘭系純種大白兔36只(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYDW20210344)，雌性，5月齡，體重(3.0±0.24)kg,飼養(yǎng)環(huán)境：溫度，(22±1)℃；相對濕度：(50±1)%，明/暗周期：12/12 h。采用雙側(cè)卵巢切除去勢法建立兔骨質(zhì)疏松模型。在此基礎(chǔ)上采用外科技術(shù)利用骨科電鉆于股骨髁部，垂直骨干長軸且與冠狀面平行，制備直徑5 mm深度6 mm的圓柱形骨缺損；分別植入不同ZOL濃度的新型多孔鈦合金支架。

1.5.2Micro-CT掃描術(shù)后8周和12周分別獲取包含植入支架的單個(gè)骨塊，選擇支架周圍直徑5mm高6mm圓柱形區(qū)域?yàn)楦信d趣區(qū)，通過Micro-CT進(jìn)行掃描。使用容積重建軟件進(jìn)行三維重建，并使用GEHCV Micro-View 2.0軟件進(jìn)行骨生長定量分析，包括骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb. Th)、和骨小梁數(shù)目(Tb. N)。

1.5.3組織學(xué)檢測Micro-CT掃描后的樣品通過梯度乙醇溶液脫水后包埋于甲基丙烯酸甲酯中，使用硬組織切片機(jī)(Leica, Germany)進(jìn)行切片(厚度：100 μm)。將切片固定于載玻片，并用改良的VG染色液進(jìn)行染色。其中紅色代表骨組織，藍(lán)色為纖維軟骨組織，黑色為鈦合金支架材料。使用Leica LA自動(dòng)顯微鏡(OLYMPUS, BX53, Japan)獲取圖像，對比分析支架周圍骨長入情況。

1.5.4生物力學(xué)檢測分別于支架植入術(shù)后8周和12周，安樂死兔子后獲取包含植入支架及其周圍組織的單個(gè)骨塊，仔細(xì)刮除支架周圍骨質(zhì)及軟組織，保留長入支架內(nèi)部的骨質(zhì)，同時(shí)在4%中性福爾馬林固定液中固定24 h；然后將支架裝載于MTS 858(Minneapolis，USA)生物力學(xué)測試機(jī)，沿支架長軸垂直壓縮直至支架破壞后停止加載(加載速度：1 mm/min)。根據(jù)壓縮載荷與形變位移繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線，并計(jì)算支架彈性模量(△應(yīng)力/△應(yīng)變)；同時(shí)按照同樣方法測試新型支架植入動(dòng)物體內(nèi)前的彈性模量。

2 結(jié) 果

2.1 負(fù)載ZOL-GNPs的PDA涂層多孔鈦合金支架的表征分析新型多孔鈦合金支架制備完成后，經(jīng)電鏡掃描結(jié)果顯示：ZOL-GNPs成球性好，表面光滑，均勻復(fù)合于支架的表面及孔隙內(nèi)，球形規(guī)整無粘連，見圖1。

圖 1 負(fù)載ZOL-GNPs的PDA涂層多孔鈦合金支架的表征分析

2.2負(fù)載ZOL-GNPs的PDA涂層多孔鈦合金支架的載藥釋放檢測結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)第1天釋藥量及釋藥百分比明顯升高，在隨后的27 d中，藥物釋放逐漸緩慢增加。10、50、100 μmol/L同一時(shí)間點(diǎn)釋藥量、釋藥百分比組組內(nèi)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。這表明該新型支架在體外至少保持?jǐn)?shù)周穩(wěn)定的ZOL釋放速率。

表 1 負(fù)載ZOL-GNPs的PDA涂層多孔鈦合金支架的載藥釋放檢測

2.3新型多孔鈦合金支架浸提液條件下破骨細(xì)胞的骨吸收能力檢測結(jié)果顯示：1 μmol/L ZOL組和10 μmol/L ZOL組骨板吸收面積[(28.22±4.17、33.41±3.23)mm2]明顯高于對照組[(22.52±2.78)mm2]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而在50 μmol/L的組所形成骨板吸收面積明顯低于10 μmol/L ZOL組(P<0.01)，且隨著濃度升高，骨板吸收面積持續(xù)降低，見圖2。

a:對照組; b-f：分別為1 、10 、50 、100 、500 μmol/L ZOL組

2.4新型多孔鈦合金支架浸提液條件下破骨細(xì)胞的凋亡檢測結(jié)果顯示破骨細(xì)胞凋亡率隨ZOL的濃度呈線性增加，所有實(shí)驗(yàn)組均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

a:對照組; b-f：分別為，1 、10 、50 、100 、500 μmol/L ZOL組

2.5新型多孔鈦合金支架成功植入OP骨缺損模型成功構(gòu)建了OP股骨髁骨缺損模型，并將不同支架植入模型中，術(shù)后X線片提示支架在位良好，見圖4。

圖 4 OP骨缺損模型的構(gòu)建及新型多孔鈦合金支架的植入

2.6新型多孔鈦合金支架在OP骨缺損動(dòng)物體內(nèi)的Micro-CT掃描Micro-CT三維重建中黃色代表新長入的骨組織，白色代表多孔鈦合金支架，對比顯示：支架周圍及內(nèi)部均有不同程度的骨長入，50 μmol/L ZOL組的骨生長情況明顯優(yōu)于其他組，見圖5。進(jìn)一步定量分析發(fā)現(xiàn)：BV/TV、Tb. Th、和Tb. N在低濃度時(shí)隨著ZOL濃度的升高而升高；當(dāng)ZOL濃度為50 μmol/L時(shí)相關(guān)參數(shù)均為峰值(P<0.05)，隨后均持續(xù)降低，見表2。

表 2 不同ZOL濃度新型多孔鈦合金支架植入動(dòng)物體內(nèi)的骨生長參數(shù)

2.7新型多孔鈦合金支架在OP骨缺損動(dòng)物體內(nèi)的組織學(xué)檢測支架植入12周后進(jìn)行組織學(xué)改良V-G染色顯示支架內(nèi)部可見明顯骨長入，隨著ZOL濃度的升高，新生骨量逐漸增多，當(dāng)ZOL濃度為50 μmol/L時(shí)新骨量最大；隨后隨著ZOL濃度的升高，新生骨量逐漸減少，當(dāng)ZOL濃度達(dá)到500 μmol/L時(shí)僅可發(fā)現(xiàn)少量骨再生,見圖6。

a:對照組; b-f：分別為1 、10 、50 、100 、500 μmol/L ZOL組

2.8新型多孔鈦合金支架在OP骨缺損動(dòng)物體內(nèi)的生物力學(xué)檢測根據(jù)應(yīng)力-應(yīng)變曲線計(jì)算其彈性模量，對照組、100 μmol/L ZOL組和500 μmol/L ZOL組的8周[(1.86±0.08、1.95±0.15、1.89±0.16)GPa]和12周[(1.88±0.14)、1.87±0.12、1.91±0.17)GPa]支架彈性模量與支架植入前的[ (1.81±0.14)GPa]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而1 μmol/L組、10 μmol/L組和50 μmol/L組的支架8周[ (2.11±0.11、2.26±0.13、2.58±0.09)GPa]和12周[ (2.23±0.07、2.48±0.16、2.91±0.10)GPa]彈性模量均顯著高于支架植入前的彈性模量(P<0.05)，并且50 μmol/L組的支架彈性模量最高，接近人體松質(zhì)骨彈性模量的同時(shí)，抗壓性能較好。

3 討 論

盡管多孔鈦合金支架具有較好的生物相容性和良好的耐腐蝕性，已成為修復(fù)骨缺損最廣泛的金屬支架材料[10]。但OP骨缺損與一般骨缺損相比具有骨再生能力弱、新骨力學(xué)不穩(wěn)、骨折再發(fā)率高等特點(diǎn)，普通多孔鈦合金支架又缺乏骨誘導(dǎo)和抗骨質(zhì)疏松作用，所以O(shè)P骨缺損修復(fù)后仍有較高風(fēng)險(xiǎn)出現(xiàn)骨折再發(fā)、延遲愈合、內(nèi)植物松動(dòng)塌陷等情況[1-2]。因此，我們基于GNPs的藥物遞送體系構(gòu)建了一種負(fù)載ZOL-GNPs的PDA涂層多孔鈦合金支架，該支架彈性模量接近人體松質(zhì)骨，可避免應(yīng)力遮擋影響，最重要的是該支架可保持?jǐn)?shù)周穩(wěn)定的ZOL釋放速率。

ZOL作為最常用的雙磷酸鹽，是一種高效的靜脈用氨基雙膦酸鹽，已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)被批準(zhǔn)用于原發(fā)性或繼發(fā)性骨質(zhì)疏松患者[11-12]。但由于ZOL輸注全身治療時(shí)的不良反應(yīng)導(dǎo)致患者的依從性較差[13]，因此在骨缺損局部進(jìn)行緩釋給藥有可能避免這種全身使用所帶來的副作用。本研究設(shè)計(jì)了不同濃度ZOL新型支架以分析ZOL-GNPs的釋藥效果，結(jié)果顯示該新型支架可在體外至少保持?jǐn)?shù)周穩(wěn)定的釋放速率(表1)，這表明該支架可作為局部藥物遞送的有效載體，這可能歸因于GNPs的降解控制[14]。我們將鼠BMMs與不同ZOL濃度的新型多孔鈦合金支架制備的浸提液共培養(yǎng)。通過對比Osteo Assay Surface Plate上形成的骨板吸收面積來量化評(píng)估骨吸收活性。1 μmol/L ZOL組和10 μmol/L ZOL組所形成的骨板吸收面積明顯高于對照組，而在50 μmol/L的組所形成骨板吸收面積明顯低于對照組(0 μmol/L)，且隨著濃度的升高，骨板吸收面積持續(xù)降低(圖2)。進(jìn)一步使用雙熒光標(biāo)記法對破骨細(xì)胞進(jìn)行浸提液條件下凋亡檢測，結(jié)果量化對比分析顯示破骨細(xì)胞凋亡率隨ZOL的濃度呈線性增加(圖3)。

雙側(cè)卵巢切除已經(jīng)成為構(gòu)建絕經(jīng)后OP模型的經(jīng)典方法[15]。兔和人類具有相似的骨密度和骨強(qiáng)度，因此兔子是最常用的骨缺損模型[16]，因此本研究在新西蘭大白兔骨質(zhì)疏松模型建立且驗(yàn)證成功的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用外科手術(shù)構(gòu)建OP股骨髁缺損模型，然后分別植入不同ZOL濃度的新型多孔鈦合金支架，術(shù)后X線片顯示支架位置良好(圖4)。既往研究表明，骨質(zhì)疏松性骨缺損處新生組織的質(zhì)量和力學(xué)強(qiáng)度明顯低于正常骨組織[17]，因此植入物的力學(xué)穩(wěn)定性是骨質(zhì)疏松性骨缺損部位修復(fù)的先決條件。本研究中，在支架植入8周和12周分別對不同ZOL濃度的植入支架進(jìn)行進(jìn)行垂直力學(xué)壓縮實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示1 μmol/ L組、10 μmol/ L組和50 μmol/ L組的支架彈性模量均顯著高于支架植入前的彈性模量(P<0.05)，并且50 μmol/L組的支架彈性模量最高，接近人體松質(zhì)骨彈性模量的同時(shí)，抗壓性能較好(表3)。通過Micro-CT對骨生長情況進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)：無論是在8周還是12周，在BV/TV、Tb. Th、和Tb. N的對比分析中，在低濃度ZOL中呈現(xiàn)濃度依賴正相關(guān)，隨著ZOL濃度的升高而升高；當(dāng)ZOL濃度為50 μmol/L時(shí)相關(guān)參數(shù)均為峰值(表2，圖5)。組織學(xué)染色結(jié)果也顯示隨著ZOL濃度的升高，新生骨量逐漸增多，當(dāng)ZOL濃度為50 μmol/ L時(shí)新骨量最大(圖6)。

本研究具有一定的局限性。各實(shí)驗(yàn)組之間的ZOL濃度差別較大，對于ZOL-GNPs藥物遞送體系中的最佳載藥濃度值得進(jìn)一步研究；該新型支架對于其他類型骨質(zhì)疏松癥(比如：老年男性骨質(zhì)疏松癥、繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥)是否有效，還需要進(jìn)一步研究證明。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了一種負(fù)載ZOL-GNPs的PDA涂層多孔鈦合金支架，該支架可保持?jǐn)?shù)周穩(wěn)定的ZOL釋放速率，具有局部藥物緩釋抗骨質(zhì)疏松作用，促進(jìn)新生骨組織與支架之間的良好骨整合，為OP骨缺損的治療提供新思路和新方法。