孟丹心，李益民，美合日阿依·約麥爾，陸治平，黃 進(jìn)

0 引 言

在臨床診療過程中使用碘對(duì)比劑(contrast media，CM)后發(fā)生的急性腎功能損害稱對(duì)比劑致急性腎損傷(contrast induced acute kidney injury，CI-AKI)[1-2]。目前，CI-AKI是醫(yī)院獲得性急性腎損傷第3個(gè)最常見原因，約占醫(yī)院獲得性腎衰竭患者的11%[3-4]。研究表明，CI-AKI的主要發(fā)病機(jī)制包括：對(duì)比劑的直接細(xì)胞毒性、ROS過度生成和腎髓質(zhì)缺血[5-6]。然而，除水化和改用低滲/等滲對(duì)比劑外，目前仍無確切防治CI-AKI的方法[7-8]。因此，有效防治CI-AKI是臨床醫(yī)師共同面臨的重大挑戰(zhàn)。

Elabela(ELA)是Chng等[9]在2013年發(fā)現(xiàn)的關(guān)于血管緊張素樣受體(putative receptor protein related to the type-1 angiotensin receptor，APJ)的一種新型內(nèi)源性配體，在成人腎中高表達(dá)[10-11]。ElA含54個(gè)氨基酸，可分割為含32個(gè)氨基酸的成熟肽(ELA32)和一個(gè)信號(hào)肽[12]。在所有脊椎動(dòng)物中，ELA32多肽的最后13個(gè)氨基酸高度保守，可繼續(xù)切割為ElA32、ElA22和ElA14等含有保守序列的生物活性片段[13-15]。研究表明ELA多肽可顯著降低腎缺血/再灌注損傷中腎小管細(xì)胞的炎性反應(yīng)、DNA損傷及細(xì)胞凋亡[9,16-18]。體外實(shí)驗(yàn)中，已證實(shí)ELA32在對(duì)比劑致腎小管上皮細(xì)胞損傷中具有保護(hù)作用，但降解后的ELA14片段在CI-AKI中的作用尚不明確。因此，本研究通過建立碘普羅胺(Iopromide，IOP)腎小管上皮細(xì)胞CI-AKI模型，觀察ELA14是否具備與ELA32相似的保護(hù)能力。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠NRK-52E細(xì)胞(上海中科院細(xì)胞庫)；ELA14、ELA32(R&D公司美國)，ELISA試劑盒、PCR試劑盒(Cusabio公司中國)，Caspase3、P-ATR、p-CHK抗體(Proteintec公司中國)，CCK-8試劑(Dojindo實(shí)驗(yàn)室日本)；流式細(xì)胞儀、電泳儀(BD公司德國)，熒光定量儀(Applied biosystems公司美國)。

1.2方法

1.2.1 篩選IOP及ELA多肽干預(yù)濃度用(0、25、50、100、150、200、250)mgI/mL的IOP及(0、300)pmol/L、(3、30、300)nmol/L、(3、15)μmol/L的ELA多肽干預(yù)NRK-52E細(xì)胞。CCK-8法測定細(xì)胞活性，選出IOP及ELA多肽的作用濃度。最終，IOP選用50%IC50值21 mgI/mL，ELA多肽選用30 nmol/L、3 μmol/L作為干預(yù)濃度。

1.2.2細(xì)胞分組對(duì)照組(正常培養(yǎng)的細(xì)胞)；IOP組(加入21mgI/mL IOP)；ELA32低劑量組(IOP組+30 nmol/L ELA32)；ELA32高劑量組(IOP組+3 μmol/L ELA32)；ELA14低劑量組(IOP組+30 nmol/L ELA14)；ELA14高劑量組(IOP組+3 μmol/L ELA14)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測將細(xì)胞移入流式檢測管，1000 r/min離心5 min，棄上清，用Binding Buffer 500 μL重懸細(xì)胞后加5 μL Annexin V-EGFP混勻，室溫遮光反應(yīng)20 min，再加入5 μL PI混勻，置于培養(yǎng)箱孵育5 min后上機(jī)檢測。

1.2.4線粒體活性氧測定PBS洗滌細(xì)胞，線粒體探針工作液孵育后，用4%多聚甲醛固定，洗滌后加入DAPI，最后加一滴抗熒光淬滅封片液，蓋蓋玻片避光保存，上鏡觀察并采集圖片。

1.2.5ELISA檢測將100 μL標(biāo)準(zhǔn)品和100 μL樣品加入細(xì)胞中孵育2 h，洗滌后依次加入稀釋抗體、酶標(biāo)抗體和底物液顯色孵育2 h，加入終止液；上機(jī)檢測并記錄450 nm吸光度。

1.2.6定量PCR用TRIzol提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照qPCR試劑盒說明加入引物進(jìn)行熒光定量。計(jì)算結(jié)果，以內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，用2-ΔΔCt法算出細(xì)胞mRNA表達(dá)量[19]。引物 ：NRF2基因，F(xiàn)orward PrimerGAGAAAACGACAGAAACCTCCAT，Reverse Primer TGTATCTGGCTTCTTGCTCTTGG；ICAM-1基因，F(xiàn)orward Primer CTGGAGAGCACAAACAGCAGAGAT，ReversePrimer ATGGGAGCTGAAAAGTTGTAGATTC；R-GAPDH基因，F(xiàn)orward Primer TATGTCGTGGAGTCTACTGGCGTCT，Reverse Primer AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATG。

1.2.7蛋白免疫印跡提取總蛋白并測定濃度，煮沸后用SDS-PAGE法分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，并與caspase3、P-ATR、P-CHTL和β-actin一抗在4 ℃下孵育過夜。用TBS-T洗滌后放入二抗中孵育。TBST洗滌，滴加顯影劑曝光，統(tǒng)計(jì)并分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 ELA14干預(yù)可改善IOP引起的細(xì)胞凋亡與對(duì)照組相比，IOP干預(yù)后細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。相比IOP組，不同劑量ELA14和 ELA32均使細(xì)胞凋亡率下降，并都有劑量依賴性(P<0.05)；但同劑量ELA14組與ELA32組作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見圖1 。

1：對(duì)照組；2：IOP組；3：IOP+ELA32低劑量組；4：IOP+ELA32高劑量組；5：IOP+ELA14低劑量組;6：IOP+ELA14高劑量組

2.2ELA14干預(yù)可改善IOP引起的細(xì)胞炎癥反應(yīng)如表1，IOP干預(yù)后，上清液IL-6、TNF-a因子及細(xì)胞NRF2和ICAM-1mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)；與IOP組相比，不同劑量ELA14和ELA32均明顯降低炎性因子并下調(diào)NRF2 mRNA表達(dá)(P<0.05)但同劑量ELA14與ELA32差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相比IOP組，高劑量ELA14可下調(diào)ICAM-1mRNA表達(dá)(P<0.05)，而低劑量ELA14無該作用(P>0.05)；不同劑量ELA32均可下調(diào)ICAM-1 mRNA表達(dá)，但高劑量ELA14與ELA32作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表 1 各組細(xì)胞炎癥指標(biāo)檢測

2.3ELA14干預(yù)可改善IOP引起的ROS生成與對(duì)照組相比，IOP組細(xì)胞內(nèi)MitoSOX熒光信號(hào)明顯增加(P<0.05)；與IOP組相比，不同劑量ELA14和ELA32均降低了MitoSOX熒光信號(hào)(P<0.05)，且均呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)；而同劑量ELA14與ELA32效果無明顯差異(P>0.05)，見圖2。

1：對(duì)照組；2：IOP組；3：IOP+ELA32低劑量組；4：IOP+ELA32高劑量組；5：IOP+ELA14低劑量組;6：IOP+ELA14高劑量組

2.4ELA14干預(yù)可改善IOP引起的細(xì)胞凋亡、DNA損傷相關(guān)蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比，IOP組中細(xì)胞caspase3/C-caspase3凋亡蛋白及p-ATR和p-CHK1 DNA損傷蛋白表達(dá)上調(diào)；ELA14干預(yù)可下調(diào)C-caspase3表達(dá)并呈劑量依賴性(P<0.05)，不同劑量ELA32干預(yù)呈現(xiàn)相似演變。與IOP組相比，高劑量ELA14可下調(diào)P-ATR和p-CHK1表達(dá)(P<0.05)，低劑量ELA14未能顯著下調(diào)p-CHK1(P>0.05)；不同劑量ELA32均可下調(diào)P-ATR和p-CHK1蛋白(P<0.05)，但高劑量ELA14與ELA32對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用相同(P<0.05)。見圖3。

1：對(duì)照組；2：IOP組；3：IOP+ELA32低劑量組；4：IOP+ELA32高劑量組；5：IOP+ELA14低劑量組;6：IOP+ELA14高劑量組

3 討 論

碘對(duì)比劑是X線下心血管顯影的基本用藥，其以非離子形式從腎清除，可誘發(fā)急性腎損傷[20-21]。本研究選用低滲對(duì)比劑IOP，構(gòu)建了NRK-52E細(xì)胞CI-AKI模型，并發(fā)現(xiàn)Elebela的另一活性片段ELA14對(duì)腎損傷的保護(hù)作用與ELA32相當(dāng)，同樣可減少IOP誘導(dǎo)的ROS生成及DNA損傷等途徑，來降低NRK-52E細(xì)胞凋亡。

在20世紀(jì)中期，已發(fā)現(xiàn)碘對(duì)比劑對(duì)細(xì)胞有毒性作用[22]。本課題組前期研究提示[23]：等滲對(duì)比劑碘克沙醇可加劇細(xì)胞氧化應(yīng)激、線粒體損傷等途徑，增加NRK-52E細(xì)胞凋亡和自噬。本研究中，低滲對(duì)比劑IOP干預(yù)后，NRK-52E細(xì)胞中炎癥因子IL-6、TNFa、NRF2及ICAM-1表達(dá)及ROS生成明顯增多；同時(shí)DNA凋亡和損傷基因Caspase、p-CHK1、p-ATR表達(dá)也明顯上調(diào)，表明低滲對(duì)比劑同樣能通過線粒體損傷、氧化應(yīng)激、DNA損傷等多個(gè)途徑，增加NRK-52E細(xì)胞凋亡。

ELA32-AA成熟肽在體內(nèi)高度保守，末端13個(gè)氨基酸在脊椎動(dòng)物中保持穩(wěn)定[24]。目前，ELA片段活性及其生理作用成為研究熱點(diǎn)。Xi等[25]表明：重組的外源性ELA21在血漿中的半衰期顯著延長，并可改善心肌梗死大鼠模型的心臟功能。研究表明，ELA32在體內(nèi)主要依賴ELA14活性片段激活A(yù)PJ受體而發(fā)揮作用[26]，且ELA14比ELA32和Apelin13更能有效促進(jìn)動(dòng)物腎代謝；ELA11 (不包含完整13個(gè)殘基)在缺氧/復(fù)氧損傷中具有腎小管細(xì)胞保護(hù)作用，并可使細(xì)胞免受阿霉素誘導(dǎo)的DNA損傷[27]。本研究中，ELA14與ELA32作用相當(dāng)，同樣能抑制IOP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)及DNA損傷，并減少細(xì)胞凋亡，可作為替代ELA32治療心腎疾病的關(guān)鍵短肽。