張旺，劉肖，楊海芳，田龍，胡逸民

1唐山市人民醫(yī)院放射治療中心，河北 唐山 063000

2河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院放療科，河北 張家口 075000

3中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院放療科，北京 100021

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，占所有顱內(nèi)腫瘤的12%～15%[1]。GBM 的治療方法主要為術(shù)后替莫唑胺（temozolomide，TMZ）聯(lián)合放療的自適應(yīng)同步放化療（concurrent chemo-radiotherapy，CCRT），但預(yù)后較差。GBM 患者的中位總生存期（overall survival，OS）約為15 個月，5 年生存率為5%～10%[2]。即使增加放療劑量、使用靶向藥物和基因免疫治療，均未顯著延長OS。尤其對于Ⅳ期GBM 患者，自噬和更廣泛的腫瘤突變造成其對放化療更嚴(yán)重的抗性和更差的預(yù)后，中位OS 僅為7 個月[3]。自噬是細(xì)胞在缺氧條件和代謝應(yīng)激期間維持能量水平、蛋白質(zhì)合成和基本代謝過程的重要手段，對于Ⅳ期GBM 細(xì)胞修復(fù)和存活具有重要意義[4]。另外，Ⅳ期GBM 患者表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）過表達(dá)也會誘導(dǎo)自噬發(fā)生[5]。因此，抑制自噬過程或許可以影響Ⅳ期GBM 的治療效果。氯喹（chloroquine，CQ）能夠阻斷細(xì)胞自噬過程，或許可用來增強(qiáng)Ⅳ期GBM 患者的細(xì)胞毒性并延長OS[6]。但目前國內(nèi)尚無關(guān)于CQ 用于Ⅳ期GBM 治療的臨床試驗。本研究采用最大耐受劑量（maximum tolerated dose，MTD）和藥代動力學(xué)試驗評價CQ 對Ⅳ期GBM 患者OS 的影響，以期量化其臨床應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018 年1 月至2021 年10 月唐山市人民醫(yī)院收治的36 例Ⅳ期GBM 初診患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為Ⅳ期GBM；②卡氏功能狀態(tài)評分≥60 分；③預(yù)計生存期≥3 個月；④血液化驗結(jié)果達(dá)到正常水平，包括中性粒細(xì)胞計數(shù)≥1.5×109/L，血小板計數(shù)≥100×109/L，肌酐和總膽紅素均≤1.5倍正常值上限；⑤術(shù)后接受TMZ 聯(lián)合放療的CCRT。排除標(biāo)準(zhǔn)：①具有放化療史；②具有心臟疾病史；③具有非腫瘤導(dǎo)致的眼病史。采用簡單隨機(jī)分組法將患者分為試驗組（n=18）和對照組（n=18），對照組患者接受TMZ 聯(lián)合放療的CCRT，試驗組患者在對照組的基礎(chǔ)上聯(lián)合CQ 治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 治療方法

對照組患者接受TMZ 聯(lián)合放療的CCRT。采用雙弧容積旋轉(zhuǎn)調(diào)強(qiáng)技術(shù)，設(shè)置處方劑量為59.4 Gy，1.8 Gy/33 d。放療期間TMZ 口服劑量為75 mg/（m2· d），放療結(jié)束后口服劑量為150～200 mg/（m2·d），連續(xù)5 天，之后停藥28 天，作為一個療程，共治療6 個療程[7]。

試驗組患者在對照組的基礎(chǔ)上聯(lián)合CQ 治療，于放療開始前一周每日口服CQ 直至放療結(jié)束。采用福爾馬林固定石蠟包埋的活檢組織，檢測EGFR 表達(dá)情況。EGFR 表達(dá)分為未表達(dá)（-），低于1%的過表達(dá)（+），1%～60%的過表達(dá)（++）和超過60%的過表達(dá)（+++）。

1.3 不良反應(yīng)評價

MTD 放療開始后每周和放療結(jié)束后每個月對試驗組患者進(jìn)行體檢，采用美國國立癌癥研究所通用毒性標(biāo)準(zhǔn)（National Cancer Institute-common toxicity criteria，NCI-CTC）4.03 版評價患者的CQ 相關(guān)不良事件（adverse event，AE）。CQ劑量限制毒性（dose limiting toxicity，DLT）標(biāo)準(zhǔn)如下。①非血液毒性：≥Ⅲ級心臟毒性，包括左心室功能障礙、心力衰竭、心肌缺血、心律失常、高血壓等；≥Ⅲ級視網(wǎng)膜毒性；Ⅱ級肝腎功能毒性例數(shù)/總例數(shù)≥50%或出現(xiàn)Ⅲ級毒性；Ⅳ級惡心、嘔吐。②血液毒性：中性粒細(xì)胞計數(shù)≤500/μl 且持續(xù)超過7 天；粒細(xì)胞減少性發(fā)熱（≥38.5 ℃）；≥Ⅲ級血小板減少（﹤25×109/L）；其他與CQ 有關(guān)且造成任何治療中斷的情況。

1.4 CQ MTD 的確定方法

采用貝葉斯最優(yōu)區(qū)間（Bayesian optimal interval，BOIN）設(shè)計并確定CQ MTD[8-9]。將18 例患者平均分為3 組，每日CQ 劑量分別為100、200、300 mg，預(yù)定目標(biāo)毒性概率為30%。登錄網(wǎng)站https://trialdesign.org，將參數(shù)輸入軟件后計算決定劑量上升的判斷界值下限λe和決定劑量下降的判斷界 值 上 限λd，兩 界 值 滿足0≤λe﹤λd≤1。按 照BOIN 設(shè)計，由100 mg 組開始，若該組DLT 發(fā)生率P100≤λe，則進(jìn)行200 mg 組試驗。若P100≥λd則終止試驗或設(shè)置更低劑量組。若λe≤P100≤λd，則維持該劑量水平并確定為MTD。200、300 mg 劑量水平重復(fù)上述過程。

1.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

①采集血漿樣品。末次CQ 服用后在規(guī)定時間采集靜脈血，處理后取上清液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析[10]。②色譜條件。色譜柱：Thermo Fisher Scientific HyPURITY C18（50 × 2.1 mm，3 μm）；流動相：0.02 mol/L，pH=3.5 的甲酸銨（A 相）和甲醇（B相）；流速：0.5 ml/min；梯度洗脫。③質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（electron spray lonization，ESI），采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測；CQ 離子對為質(zhì)荷比137→質(zhì)荷比92，內(nèi)標(biāo)CQ-D4離子對為質(zhì)荷比143→質(zhì)荷比92；碰撞能量為10 eV；錐孔電壓為8 V。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M（P25，P75）]表示，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank 檢驗，包括：①試驗組中EGFR（-）和EGFR（+、++、+++）患者OS 分析和比較；②試驗組與對照組患者OS 分析和比較。以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTD 及與CQ 有關(guān)的AE

通過軟件計算獲取的預(yù)定目標(biāo)毒性概率為30%情況下λe和λd分別為23.6%和35.8%。由100 mg 組開始，該組發(fā)生1 例Ⅲ級惡心、嘔吐，DLT 發(fā)生率P100為16.7%≤λe，因此升高劑量水平繼續(xù)試驗。200 mg 組發(fā)生Ⅲ級視網(wǎng)膜毒性（視覺模糊，但未喪失）和Ⅳ級心臟毒性（QT 校正間期延長）各1 例，λe≤P200（33.3%）≤λd，因此維持該劑量水平并擬定為MTD。300 mg 組發(fā)生2 例Ⅳ級視網(wǎng)膜毒性（視覺喪失）和1 例Ⅳ級心臟毒性（心力衰竭），P300≥λd，因此降低劑量水平并最終確定200 mg 為MTD。上述DLT 中Ⅳ惡心、嘔吐和心臟毒性均在CQ 停用后一定時間內(nèi)恢復(fù)，但≥Ⅲ級視網(wǎng)膜毒性均未恢復(fù)，18 例患者與CQ 有關(guān)的全部AE 見表1。

表1 18 例Ⅳ期GBM 患者與CQ 有關(guān)的AE

2.2 藥代動力學(xué)分析結(jié)果

本研究對200 mg CQ 組的6 例患者進(jìn)行了藥代動力學(xué)分析，結(jié)果顯示：①吸收。達(dá)峰時間（tmax）為0.41（0.12～0.85）h，藥峰濃度（Cmax）為（592.32±133.16）μg/L。②分布。藥時曲線下面積（AUC）0～t為（933.42±276.31）（μg· h）/L，AUC0～∞為（894.57±217.39）（μg·h）/L。③消除。末端消除半衰期（t1/2）為（1.73±0.54）h，消除速率常數(shù)（λZ）為（0.37±0.05）。與一般口服化療藥物相比，CQ 隨血液循環(huán)在體內(nèi)吸收、分布、代謝、消除較快。

2.3 試驗組中EGFR（-）和EGFR（+、++、+++）患者臨床特征和生存情況的比較

試驗組中EGFR（-）和EGFR（+、++、+++）患者的年齡、性別比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）；EGFR（-）和EGFR（+、++、+++）患者的卡氏功能狀態(tài)評分、O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）啟動子甲基化情況、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）1 突變情況、IDH2 突變情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）（表2）。Kaplan-Meier分析顯示，試驗組中EGFR（+、++、+++）患者的中位OS為11.13個月，長于EGFR（-）患者的7.62個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.266，P=0.034）（圖1）。

表2 試驗組中EGFR（-）和EGFR（+、++、+++）Ⅳ期GBM患者臨床特征的比較

圖1 試驗組中EGFR（-）（n=8）和EGFR（+、++、+++）（n=10）Ⅳ期GBM患者的OS曲線

2.4 試驗組和對照組患者臨床特征和生存情況的比較

試驗組和對照組患者的年齡、性別、EGFR 表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）；試驗組和對照組患者的卡氏功能狀態(tài)評分、MGMT 啟動子甲基化情況、IDH1 突變情況、IDH2 突變情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）（表3）。Kaplan-Meier 分析結(jié)果顯示，試驗組患者的中位OS為10.22 個月，長于對照組患者的6.62 個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.044，P=0.013）（圖2）。

圖2 試驗組（n=18）和對照組（n=18）Ⅳ期GBM患者的OS曲線

表3 試驗組和對照組患者臨床特征的比較

3 討論

CQ是一種4-氨基喹啉，通常用于預(yù)防和治療瘧疾、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝阿米巴病和紅斑狼瘡等[11]。目前，國內(nèi)外關(guān)于CQ 用于腫瘤的研究較少，國內(nèi)尚無CQ 用于Ⅳ期GBM 治療的相關(guān)研究。本研究首次將CQ 用于Ⅳ期GBM 治療中，取得了理想結(jié)果。通過應(yīng)用目前國內(nèi)外最新、準(zhǔn)確度最高的MTD 試驗設(shè)計方法——BOIN 設(shè)計，確定了CQ MTD，并計算了藥代動力學(xué)參數(shù)，為未來臨床試驗提供了重要的理論和數(shù)據(jù)參考，并評價了CQ 對患者OS 的影響，發(fā)現(xiàn)CQ 能夠顯著延長Ⅳ期GBM 患者的OS，尤其是EGFR（+、++、+++）患者。本研究不僅填補(bǔ)了國內(nèi)空白，也為開辟新的臨床標(biāo)準(zhǔn)治療方案提供了參考。

國外相關(guān)研究取得了與本研究相似的結(jié)果。Bilger 等[12]在5 例復(fù)發(fā)性GBM 患者應(yīng)用CQ（口服，250 mg/d）治療的臨床試驗中未發(fā)現(xiàn)CQ 相關(guān)DLT，且顯著延長了患者的OS。Sotelo 等[13]在GBM 術(shù)后采用CQ（口服，150 mg/d）和卡莫司汀聯(lián)合放療的CCRT，發(fā)現(xiàn)CQ 試驗組患者的中位OS 為24 個月，對照組患者的中位OS 為11 個月，且未發(fā)現(xiàn)CQ 相關(guān)DLT。另外，Rosenfeld 等[14]還進(jìn)行了羥基氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）和TMZ 聯(lián)合放療 的CCRT，發(fā)現(xiàn)HCQ 的MTD 為600 mg/d，高于CQ 的200 mg，而且HCQ 心臟和視網(wǎng)膜毒性風(fēng)險更低。但HCQ 與CQ 治療后患者的OS 并無顯著差異，且不易穿過血腦屏障而在GBM 細(xì)胞中累積。或許未來經(jīng)優(yōu)化后的HCQ 可代替CQ 進(jìn)行試驗。

首先，自噬是一個吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器使其包被進(jìn)入雙膜囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，借此實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新并維持細(xì)胞循環(huán)[4]。因此，自噬維持了CCRT 導(dǎo)致的缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下Ⅳ期GBM 細(xì)胞存活，從而顯著增加了放化療抗性并縮短了患者的OS。另外，EGFR過表達(dá)會造成DNA 雙鏈斷裂修復(fù)增強(qiáng)和缺氧環(huán)境，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)自噬發(fā)生。因此，CCRT、EGFR對自噬的促進(jìn)使得Ⅳ期GBM 的治療難度大大增加。CQ 治療Ⅳ期GBM 的藥理學(xué)途徑包括：①通過在溶酶體中累積并改變pH 值，可有效阻斷自噬所必需的自噬體-溶酶體融合過程，從而增強(qiáng)細(xì)胞毒性和放化療敏感性。②通過自噬依賴機(jī)制提高溶酶體膜通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。③通過NOTCH1信號通路維持微血管結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)細(xì)胞生長并改變?nèi)毖醐h(huán)境，這不僅延緩了自噬發(fā)生，也降低了EGFR過表達(dá)的影響。④相比其他藥物（如HCQ）更容易穿過血腦屏障，在腦組織中累積達(dá)到高于血漿濃度的水平。但是，肯定CQ藥理作用時，其毒性依然值得警惕。目前公認(rèn)的由CQ 引起的較嚴(yán)重AE 包括心臟和視網(wǎng)膜毒性，尤其視網(wǎng)膜毒性具有不可恢復(fù)性，在未來臨床試驗和實踐中一定要注意。

本研究尚存在一些問題有待解決。①CQ 開始時間有待優(yōu)化。CQ 于同步放療前一周開始，但目前尚不清楚由開始時間決定的穩(wěn)定狀態(tài)劑量是否也是最佳自噬抑制劑量。②自噬抑制所需CQ劑量有待測定。有研究表明，患者每天攝入250 mg CQ并達(dá)到約3.2 mg 累積劑量為自噬抑制的有效劑量。但也有研究表明，有效抑制自噬需要更高劑量的CQ[15-16]。③自噬抑制直接測量技術(shù)有待開發(fā)。國外研究通過間接測量外周血細(xì)胞內(nèi)的微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3B-Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3B-Ⅱ，LC3BⅡ）來量化自噬抑制效果[17]，然而直接測量細(xì)胞內(nèi)自噬抑制效果的技術(shù)有待開發(fā)。④CQ 同步化療的效果有待評價。本研究中CQ在放療結(jié)束時停藥，或許延長CQ用藥時間會對CCRT 有所幫助。⑤有待采用Cox 回歸模型評估患者OS 的影響因素。本研究僅進(jìn)行了Kaplan-Meier單因素OS 分析，根據(jù)患者基線資料的Cox 多因素回歸分析有待執(zhí)行。預(yù)計未來毒性更小、更有效的自噬抑制劑（例如Lys05、Verteporfin）會應(yīng)用于臨床[18]。因此，自噬抑制劑聯(lián)合CCRT 有可能成為未來GBM新的治療標(biāo)準(zhǔn)，具有重要的臨床價值。

綜上所述，CQ 在體內(nèi)吸收、消除較快。CQ 聯(lián)合CCRT 顯著延長了Ⅳ期GBM 患者的OS，尤其是對于EGFR（+、++、+++）患者。CQ 具有重要的臨床價值，但仍需對其繼續(xù)進(jìn)行深入研究和開發(fā)。