張鑫，冉小柯，趙云霞，陳茜，徐宗瑤，陳曉琦

1河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450000

2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃肝膽科，鄭州 450000

原發(fā)性肝癌是世界性的健康難題，預(yù)計到2025 年全球每年將有超過100 萬人受到肝癌的影響[1]。乙型或丙型肝炎病毒感染、酒精性肝損傷、肥胖等導(dǎo)致肝硬化和慢性肝病的因素與肝癌的發(fā)病密切相關(guān)，盡管進(jìn)行了相應(yīng)預(yù)防，但肝癌總體發(fā)病率始終居高不下[2]。肝癌是全球腫瘤的第三大死亡原因，而且主要死亡人口集中在東亞地區(qū)[3]。據(jù)中國癌癥中心統(tǒng)計，2012—2015 年中國肝癌患者的5 年生存率僅為12.1%[4]。肝癌的發(fā)生發(fā)展涉及眾多基因、通路的共同作用，其中原癌基因激活、抑癌基因失活及信號通路異?；罨c肝癌的發(fā)病密切相關(guān)[5]。從基因?qū)用嫒ヌ綄じ伟┑陌l(fā)生發(fā)展機(jī)制，挖掘精準(zhǔn)的生物標(biāo)志物和治療靶點，可更好地指導(dǎo)臨床診療，為肝癌診治帶來新的希望。本研究利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫的基因信息對肝癌進(jìn)行生物信息學(xué)分析，尋找其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，構(gòu)建肝癌生物標(biāo)志物預(yù)后模型，為尋找肝癌的治療靶點及臨床診療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 原始數(shù)據(jù)的下載及標(biāo)準(zhǔn)化處理

從TCGA 數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https://portal.gdc.cancer.gov/repository）下載肝癌及癌旁組織的臨床數(shù)據(jù)及基因表達(dá)量等信息，采用Perl軟件將原始數(shù)據(jù)提取為矩陣文件，從ensembl 網(wǎng)站（https://asia.ensembl.org/index.html）下載人類基因名與基因id 的對應(yīng)關(guān)系，通過Perl軟件將原始數(shù)據(jù)中的基因id轉(zhuǎn)換為基因名。

1.2 原始數(shù)據(jù)的差異基因分析

R 語言4.04 版本環(huán)境下（下同），引用“edgR”數(shù)據(jù)包進(jìn)行差異基因分析，設(shè)定篩選條件fold-Change=3（差異倍數(shù)﹥9），padj=0.01（糾正后P 值﹤0.01），引用“gplots”數(shù)據(jù)包進(jìn)行差異基因的“volcano”（火山圖）繪制，使結(jié)果可視化。

1.3 差異基因的功能和通路富集分析

引用“clusterProfiler”包，對差異基因中上調(diào)和下調(diào)基因進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，設(shè)定篩選條件為P value cut off=0.05（P﹤0.05）、Q value cut off=0.05（Q﹤0.05），引用“barplot”（柱狀圖）數(shù)據(jù)包使分析結(jié)果可視化。

1.4 差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及核心基因?qū)ふ?/h3>

采用String 數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/）對差異上調(diào)基因進(jìn)行蛋白功能互作（protein-protein interaction，PPI）生物分析，去除網(wǎng)絡(luò)無關(guān)基因并設(shè)定最小所需互動分?jǐn)?shù)為0.99，輸出圖形。采用R 軟件尋找PPI 網(wǎng)絡(luò)核心基因，引用“barplot”數(shù)據(jù)包使分析結(jié)果可視化。

1.5 差異基因的生存分析

引用“survival”數(shù)據(jù)包，采用Kaplan-Meier 法對差異基因進(jìn)行單基因生存分析，根據(jù)基因在所有組織中表達(dá)量的中位數(shù)將樣品分為高、低表達(dá)兩組，引用“survdiff”函數(shù)分析高、低表達(dá)組的生存差異，引用“plot”工具包使差異結(jié)果可視化，并以年為單位批量繪制5 年生存曲線。

1.6 Cox 單因素和多因素分析及Cox 風(fēng)險模型的建立

引用“survival”數(shù)據(jù)包對差異基因進(jìn)行Cox 單因素分析，得出風(fēng)險比（hazard ratio，HR）值、P 值等。采用R 軟件取兩項生存分析中P﹤0.0001 的交集基因，差異交集基因作為單線變量進(jìn)行Cox 多因素分析。采用“step”函數(shù)篩選出差異交集基因中信息量最大、基因數(shù)目最小的基因變量，得出基因變量X、回歸系數(shù)β，并得出模型基因變量的HR值，引用“survminer”數(shù)據(jù)包繪制森林圖使HR 值結(jié)果可視化。

引用“predict”函數(shù)，根據(jù)生存風(fēng)險評分（survival risk score，SRS）公式計算每個組織的SRS，根據(jù)所有組織SRS 的中位數(shù)將組織分為低風(fēng)險組和高風(fēng)險組。采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，驗證SRS 與預(yù)后的相關(guān)性。引用“survivalROC”數(shù)據(jù)包繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，評估SRS 預(yù)后模型的準(zhǔn)確性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用R 語言進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織和正常組織中的差異基因

本次下載共得到407 例肝癌組織、58 例癌旁組織中的60 244個基因表達(dá)信息。差異分析后得出差異顯著基因1913 個（差異倍數(shù)﹥9，糾正后P 值﹤0.01），其中上調(diào)基因1836個，下調(diào)基因77個。（圖1）

圖1 肝癌組織（n=407）和癌旁組織（n=58）中差異基因的火山圖

2.2 差異基因的富集分析

差異上調(diào)基因GO 富集分析顯示，過度激活基因主要聚集于DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性,特異性RNA 聚合酶Ⅱ，激素活性，被動的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性，門控通道活性，通道活性功能上（P﹤0.0001）（圖2A）。差異下調(diào)基因GO 富集分析顯示，表達(dá)被抑制的基因主要聚集在糖結(jié)合、甘露糖結(jié)合、受體配體活性、單糖結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體激活劑活性功能上（P ﹤0.0001）（圖2B）。

圖2 差異上調(diào)基因和下調(diào)基因的GO功能富集分析柱狀圖

差異上調(diào)基因KEGG 富集分析顯示，過度激活基因主要聚集于神經(jīng)活性配體受體相互作用、細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)消化吸收、尼古丁成癮通路上（P﹤0.001）（圖3）。差異下調(diào)基因由于基因數(shù)目較少，本次KEGG 分析并未富集出有意義的結(jié)果。

圖3 差異上調(diào)基因的KEGG通路富集分析柱狀圖

2.3 差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

差異上調(diào)基因PPI 網(wǎng)絡(luò)中的部分作用結(jié)果如下：基因染色體鄰域評分為0，基因融合評分最高值為細(xì)胞周期蛋白A2（cyclin A2，CCNA2）-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1）基因（0.007），系統(tǒng)并發(fā)發(fā)育評分最高值為serpin 家 族B 成 員3（serpin family B member 3，SERPINB3）-serpin 家 族B 成 員4（serpin family B member 3，SERPINB4）基因（0.449），同族評分最高值為SERPINB3-SERPINB4（0.984），共表達(dá)評分最高值為非SMC 凝聚素Ⅰ復(fù)合亞基G（non-SMC condensin Ⅰcomplex subunit G，NCAPG）-非SMC凝聚素Ⅰ復(fù)合亞基H（non-SMC condensin Ⅰcomplex subunit H，NCAPH）（0.994），實驗確定相互作用評分最高值為細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1，CCNB1）-CDK1、BUB1 有絲分裂檢查點絲氨酸/蘇氨酸激B（BUB1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase B，BUB1B）-細(xì)胞分裂周期20（cell division cycle 20，CDC20）（0.999），文本挖掘評分最高值為CCNB1-CDK1（0.983），數(shù)據(jù)注釋評分最高值為CCNB1-CDK1、NDC8 動粒復(fù)合體成分（NDC80 kinetochore complex component，NDC80）、NDC80 動粒復(fù)合體的SPC25 成分（SPC25 component of NDC80 kinetochore complex，SPC25）等（0.900），混合評分最高值為CCNB1-CDK1、NDC80-SPC25 等（0.999），R 軟件得出互作蛋白數(shù)最高的基因為CDK1（39）。

2.4 差異基因的生存分析

生存分析顯示，1913 個差異基因中360 個基因與樣品生存時間相關(guān)（P﹤0.05），34 個基因顯著相關(guān)（P﹤0.0001），如基質(zhì)金屬蛋白酶10（matrix metalloproteinase 10，MMP10）、甲狀腺激素受體相互作用物13（thyroid hormone receptor interactor 13，TRIP13）、細(xì)胞分裂周期相關(guān)8（cell division cycle associated 8，CDCA8）等。

2.5 差異基因的Cox 生存分析及預(yù)后模型

Cox 單因素生存分析結(jié)果顯示，1913 個差異基因中632個基因與樣品生存時間相關(guān)（P﹤0.05），97個基因顯著相關(guān)（P﹤0.0001）。Kaplan-Meier 生存分析、Cox 單因素分析中的顯著相關(guān)基因共有29 個交集基因，選取前10個基因建立預(yù)后模型。（圖4）

圖4 交集基因的森林圖

由預(yù)后模型得出的402個樣品的SRS中位數(shù)將樣品分為高風(fēng)險組（n=201）和低風(fēng)險組（n=201）。Kaplan-Meier 生存分析顯示，高風(fēng)險組患者生存情況明顯差于低風(fēng)險組患者（P﹤0.01）。（圖5）

圖5 高風(fēng)險組（n=201）與低風(fēng)險組（n=201）肝癌患者的生存曲線

繪制ROC 曲線評估SRS 基因模型預(yù)測預(yù)后的價值，結(jié)果顯示，曲線下面積（area under the curve，AUC）=0.724，表明SRS 基因模型預(yù)測肝癌患者預(yù)后具有較高的價值。（圖6）

圖6 SRS基因模型預(yù)測肝癌患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

原發(fā)性肝癌以其早期診斷困難、中晚期轉(zhuǎn)移迅速、治療難度大等特點嚴(yán)重威脅著中國人民的生命健康[6]?？刂颇[瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是治療腫瘤的核心問題，目前抗腫瘤血管生成藥物及免疫檢查點抑制劑的臨床應(yīng)用在患者的客觀緩解率和總生存率上取得了令人鼓舞的治療效果[7]，但仍需深入挖掘新的治療靶點以達(dá)到更佳的治療效果。本文基于TCGA 數(shù)據(jù)庫對肝癌組織和癌旁組織的差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析出原癌基因與抑癌基因的主要功能及通路富集點，揭示了肝癌的可能發(fā)生發(fā)展機(jī)制。同時通過對差異基因的多層次預(yù)后分析，尋找到與肝癌患者預(yù)后密切相關(guān)的10個核心基因，并構(gòu)建出相關(guān)預(yù)后模型，ROC 曲線分析證明該模型對患者的預(yù)后預(yù)測具有較高的價值。

本研究通過PPI 生物學(xué)分析證明原癌基因CDK1 在肝癌發(fā)生發(fā)展調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中居核心位置。CDK 是重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，CDK 家族中CDK1 可以單獨促進(jìn)細(xì)胞周期，對細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞分裂至關(guān)重要[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，CDK1 在胰腺癌組織中高表達(dá)，且CDK1 的高表達(dá)與腫瘤大小、組織學(xué)分級、不良預(yù)后相關(guān)[9]。CDK1 可以促進(jìn)5-氟尿嘧啶耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲并抑制其凋亡，抑制CDK1的表達(dá)可以增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性[10]。以上研究與本研究結(jié)果一致，但目前關(guān)于CDK1 與肝癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系并無明確闡述，值得深入探討。

本研究發(fā)現(xiàn)了與肝癌患者預(yù)后顯著相關(guān)的10個核心基因，其中NIMA 相關(guān)激酶2（NIMA related kinase 2，NEK2）、TOPBP1 交互檢查點和復(fù)制調(diào)節(jié)器（TOPBP1 interacting checkpoint and replication regulator，TICRR）、E2F 轉(zhuǎn)錄因子2（E2F transcription factor 2，E2F2）、RAD54 樣基因（RAD54 like，RAD54L）的表達(dá)量與肝癌患者的預(yù)后呈正相關(guān)。有研究通過免疫組化分析證明NEK2 在肝癌組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織，同時發(fā)現(xiàn)低表達(dá)的NEK2 與肝細(xì)胞肝癌的進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)[11]。有研究證明，S 期周期蛋白依賴激酶可以磷酸化TICRR 限制細(xì)胞S 期進(jìn)展，進(jìn)而可能會影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，E2F2 的轉(zhuǎn)錄活性有助于促進(jìn)成年肝細(xì)胞增殖和肝臟再生[13]，亦有研究證明E2F2 失活與Myc 基因表達(dá)共同促進(jìn)皮膚和口腔腫瘤的發(fā)展[14]。有研究證明，同源重組修復(fù)基因RAD54L 可以影響胰腺癌[15]、膀胱癌[16]患者的生存期。上述研究中，過表達(dá)的NEK2 對肝癌細(xì)胞的抑制作用與本研究結(jié)果一致，TICRR、E2F2、RAD54L被證實可以抑制腫瘤進(jìn)展，但與肝癌的關(guān)系仍需進(jìn)一步探討。

本研究證明，SRS 模型中霍利迪連接識別蛋白（Holliday junction recognition protein，HJURP）、CDCA8、TRIP13、nei 樣DNA 糖基化酶3（nei like DNA glycosylase 3，NEIL3）、分泌磷蛋白1（secreted phosphoprotein 1，SPP1）、SRY-box 轉(zhuǎn)錄因子11（SRY-box transcription factor 11，SOX11）的表達(dá)量與肝癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。HJURP 在體內(nèi)體外均能通過促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2 和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）信號通路使p21 不穩(wěn)定從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[17]。有研究通過體外實驗證明SPP1 特異性抗體能有效抑制肝癌細(xì)胞的侵襲，并在裸鼠體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移[18]。研究通過TCGA 數(shù)據(jù)分析證明CDCA8表達(dá)增加與肝癌預(yù)后不良顯著相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)CDCA8 可能通過細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、p53、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等信號通路促進(jìn)腫瘤發(fā)展[19]。有研究證明，TRIP13 能與肌動蛋白α4（actinin alpha 4，ACTN4）相互作用并正調(diào)控其表達(dá)，從而激活A(yù)KT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）通路驅(qū)動肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[20]。相關(guān)研究通過公共數(shù)據(jù)分析證明，SOX11 在肝癌組織中明顯上調(diào)，其mRNA表達(dá)水平與肝癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[21]。研究發(fā)現(xiàn)NEIL3 過表達(dá)的胰腺癌、肺腺癌等腫瘤患者的總生存期較差[22]，同時NEIL3 突變與受損的B 細(xì)胞功能和嚴(yán)重的自身免疫有關(guān)[23]；這揭示了NEIL3 可能成為腫瘤的潛在免疫治療靶點。以上研究證明，過表達(dá)的HJURP、CDCA8、TRIP13、SPP1、SOX11、NEIL3 均可促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展，這與本研究的結(jié)論一致。

本研究通過公共數(shù)據(jù)分析構(gòu)建并驗證了10 個核心基因組成的預(yù)后模型，通過模型求得的SRS可計算風(fēng)險分層，預(yù)測肝癌患者預(yù)后，為臨床的個體化精準(zhǔn)診療提供依據(jù)，而核心基因可作為高度特異性的生物標(biāo)志物為肝癌患者的診斷和治療帶來新的希望。