張王吉，左云，施曉婧，吳倍佩，倪晨，張永芹

蘇州大學(xué)附屬張家港醫(yī)院腫瘤科，江蘇 張家港 215600

胃癌是目前世界范圍內(nèi)第五大常見惡性腫瘤，也是腫瘤相關(guān)死亡的第四大原因，2020 年新增胃癌患者100 多萬例，估計(jì)有79.6 萬例死亡（相當(dāng)于全球每13 例死亡病例中就有1 例因胃癌所致）[1]。中國是胃癌的高發(fā)國家，2020 年中國胃癌新發(fā)病例和死亡病例分別占全球的62.3%和51.4%[1]。由于胃癌早期癥狀不典型及患者對(duì)癥狀的忽視，致使中國約80%的初治胃癌患者已處于進(jìn)展期和晚期[2-3]。胃癌晚期治療以化療、放療、靶向治療和免疫治療等綜合治療為主，但治療效果不盡如人意，5 年生存率僅為35.9%[4]。因此，了解胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的診斷和治療靶點(diǎn)成為胃癌治療的重中之重。線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶50（translocase of inner mitochondrial membrane 50，TIM50）是位于線粒體內(nèi)膜的TIM23 復(fù)合體的一個(gè)亞基，在線粒體蛋白輸入和分選中發(fā)揮重要作用[5]。人TIM50 由353 個(gè)氨基酸組成，大小約為40 kD[6]。在基礎(chǔ)條件下，TIM50 作為線粒體蛋白前序列受體，與TIM23亞基相互作用促進(jìn)前序列蛋白從線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶向TIM23 移交，也觸發(fā)了TIM23 前蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)通道基質(zhì)側(cè)的輸入馬達(dá)的組裝和激活，在線粒體蛋白輸入過程中起早期作用[7]。近年來，TIM50 促進(jìn)多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用日益受到關(guān)注。研究表明，TIM50作為潛在致癌因子在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、食管癌、腎母細(xì)胞癌等惡性腫瘤中呈高表達(dá)[8-12]。但TIM50 在人胃癌中的表達(dá)國內(nèi)外文獻(xiàn)尚無報(bào)道。因此，本研究對(duì)人胃癌組織中TIM50 的表達(dá)及其臨床意義進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016 年6 月至2018 年7 月蘇州大學(xué)附屬張家港醫(yī)院收治的85 例胃癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①接受胃癌切除術(shù)且經(jīng)病理檢查確診為胃癌；②術(shù)前未接受過放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤；②病歷資料不完整。85 例胃癌患者中，男性56 例，女性29 例；年齡：≥60 歲55 例，﹤60歲30 例；腫瘤直徑：≥5 cm 58 例，﹤5 cm 27 例；病理分級(jí)：Ⅰ/Ⅱ級(jí)25 例，Ⅲ/Ⅳ級(jí)60 例；TNM 分期：Ⅰ/Ⅱ期33 例，Ⅲ/Ⅳ期52 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25 例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移1 例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移84 例。取85 例胃癌患者的胃癌組織及癌旁組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 隨訪

以復(fù)診或電話方式對(duì)胃癌患者術(shù)后生存情況進(jìn)行隨訪，特殊患者必要時(shí)上門回訪。總生存時(shí)間為術(shù)后至隨訪截止時(shí)間或死亡時(shí)間的間隔。隨訪時(shí)間36 個(gè)月，隨訪截止時(shí)間為2021 年7 月。

1.3 主要試劑

兔抗TIM50 多克隆抗體（22229-1-AP）購自美國PROTEINTECH 公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗及CY3 標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗均購自Life 公司。

1.4 免疫組化檢測(cè)

取新鮮胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本，4%甲醛固定，脫水處理后用石蠟包埋，4 μm 厚度連續(xù)切片。切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，室溫下3%H2O2孵育10 min。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌3 min×3 次，抗原修復(fù)后加山羊血清室溫封閉1 h；加兔抗TIM50 多克隆一抗（1∶1000），4 ℃過夜；PBS 洗滌3 min×3 次，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30 min；PBS洗滌5 min×3 次，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色5 min；蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡，中性樹脂封片。待其干燥后，用光學(xué)顯微鏡（×200）觀察染色情況。

1.5 免疫組化評(píng)估

陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：無陽性細(xì)胞為0分，1%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，76%～100%為4 分。染色強(qiáng)度評(píng)分：無染色為0 分，弱染色為1 分（+），中等強(qiáng)度染色為2 分（++），強(qiáng)染色為3 分（+++）?？傇u(píng)分=陽性細(xì)胞百分比評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分。根據(jù)總評(píng)分將患者分為兩組，總評(píng)分0～4 分為TIM50 低表達(dá)組，總評(píng)分5～12 分為TIM50 高表達(dá)組。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank 檢驗(yàn)。以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TIM50 表達(dá)情況的比較

免疫組化結(jié)果顯示，胃癌組織中TIM50 主要定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖1）。85 例胃癌組織中58 例（68.2%）患者TIM50 高表達(dá)，27 例（31.8%）患者TIM50 低表達(dá)；85 例癌旁組織中11 例（12.9%）患者TIM50 高表達(dá)，74 例（87.1%）患者TIM50 低表達(dá)；胃癌組織中TIM50 高表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=53.886，P﹤0.01）。

圖1 胃癌組織及癌旁組織中TIM50的表達(dá)情況（免疫組化染色，×200）

2.2 不同臨床特征胃癌患者的胃癌組織中TIM50表達(dá)情況的比較

不同病理分級(jí)胃癌患者的胃癌組織中TIM50表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）；不同年齡、性別、腫瘤直徑、TNM 分期、T 分期、N 分期、M 分期胃癌患者的胃癌組織中TIM50 表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征胃癌患者的胃癌組織中TIM50 表達(dá)情況的比較

2.3 生存情況的比較

采用Kaplan-Meier 法繪制胃癌患者生存曲線，結(jié)果表明，TIM50 高表達(dá)與TIM50 低表達(dá)胃癌患者的3 年生存率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.862，P=0.172）。（圖2）

圖2 TIM50高表達(dá)（n=58）與低表達(dá)（n=27）胃癌患者的生存曲線

3 討論

胃癌是中國常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均居第二位，嚴(yán)重危害居民的生命健康[13]。目前國內(nèi)外研究明確胃癌的病因包括幽門螺桿菌感染、不良飲食習(xí)慣、非甾體抗炎藥等，但胃癌發(fā)生發(fā)展分子生物學(xué)機(jī)制尚未明確[14]。

越來越多證據(jù)表明，TIM50 除參與線粒體蛋白輸入外，還參與其他功能。研究發(fā)現(xiàn)，人TIM50 在腎上腺和睪丸類固醇合成中發(fā)揮重要作用[15]。此外，TIM50 也參與了白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-1 受體相關(guān)激酶2（interleukin-1 receptor-associated kinase 2，IRAK2）線粒體易位抑制脂肪細(xì)胞氧化代謝途徑[16]。有趣的是，TIM50 可以通過降低氧化應(yīng)激來減輕病理性心肌肥厚[17]，有望成為防治心肌肥厚和心力衰竭的新靶點(diǎn)。多篇報(bào)道表明，TIM50 基因突變與先天代謝缺陷疾病3-甲基戊烯二酸尿癥相關(guān)，此外研究者對(duì)患者線粒體功能綜合分析后發(fā)現(xiàn)，TIM50 突變通過靶向線粒體的幾個(gè)關(guān)鍵方面，包括維持線粒體形態(tài)、Oxphos 組裝和線粒體呼吸能力，導(dǎo)致線粒體功能的普遍缺陷[18-21]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，TIM50 水平與各種腫瘤細(xì)胞的生長和增殖直接相關(guān)[10]。據(jù)報(bào)道，TIM50 的表達(dá)可能通過p53 突變體的過度表達(dá)而上調(diào)，從而導(dǎo)致乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌的生長和化學(xué)耐藥[9]。研究表明，TIM50 可能抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。在非小細(xì)胞肺癌中，TIM50 水平與腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和總生存率直接相關(guān)。同一項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，TIM50 通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤進(jìn)展并預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后[10]。據(jù)報(bào)道，肉瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用的miRNA-7 可調(diào)節(jié)TIM50 的表達(dá)[22]。食管癌中，LOC100133669 表達(dá)上調(diào)與預(yù)后不良相關(guān)，在研究潛在致癌機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，其與TIM50 相互結(jié)合通過抑制泛素化上調(diào)其蛋白水平。此外，LOC100133669 基因被敲低時(shí)，過表達(dá)TIM50 可挽救食管癌細(xì)胞的生長[12]。研究發(fā)現(xiàn)，TIM50可能是腎母細(xì)胞瘤中原癌基因MYCN的靶基因，表達(dá)水平隨著MYCN的耗竭而下調(diào)[8]。為了分析TIM50在胃癌中扮演的角色，本研究檢測(cè)并分析了TIM50 在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況及與患者臨床特征的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，85 例患者胃癌組織中TIM50 高表達(dá)率明顯高于癌旁組織，說明TIM50 與胃癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中TIM50 蛋白表達(dá)與病理分級(jí)有關(guān)，病理分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)胃癌患者的胃癌組織中TIM50 陽性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)患者（P﹤0.05）；TIM50 表達(dá)與年齡、性別、腫瘤直徑、T 分期、N 分期、M 分期、TNM 分期無關(guān)。該結(jié)論提示TIM50 表達(dá)與胃癌惡性程度有關(guān)。本研究還表明，TIM50 高表達(dá)患者的3 年生存率較TIM50 低表達(dá)患者低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與隨訪時(shí)間太短有關(guān)，將繼續(xù)隨訪，探求5 年生存率差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，TIM50 在胃癌組織中呈高表達(dá)，與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，TIM50 有可能成為新的臨床胃癌早期診治靶點(diǎn)，并對(duì)評(píng)價(jià)胃癌惡性程度、早期診斷具有重要意義。