李菲 楊玲 王巧貞 許秀松 黃庶識(shí) 楊慧歡 覃仙玲,*

(1 廣西科學(xué)院廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007；2 廣西科學(xué)院 廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007；3 廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，桂林 541006；4 廣西師范大學(xué) 珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541006；5 南寧學(xué)院機(jī)電與質(zhì)量技術(shù)工程學(xué)院，南寧 530200)

柑橘是我國重要的水果產(chǎn)業(yè)，品種多，分布廣，種植規(guī)模和產(chǎn)量均居全球第一[1]。沃柑系以色列研發(fā)的雜交柑橘品種，由于晚熟高糖和早結(jié)豐產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，在我國廣受青睞[2-4]。沃柑晚熟，需要越冬，但又不防凍，因此適合我國廣西等積溫高的地區(qū)種植。截至2018年底，廣西沃柑種植面積約200萬畝(13.33萬hm2)，產(chǎn)量約100萬噸，位居全國第一位[5]。沃柑作為廣西柑桔產(chǎn)業(yè)的支柱產(chǎn)品，對(duì)廣西的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)有著重大意義。然而，柑橘培育過程中發(fā)生的病蟲害不容小覷。據(jù)美國植物病理學(xué)會(huì)網(wǎng)站記錄，柑橘真菌性病害60余種，其危害程度因地區(qū)和品種而異[6]。為順利開展沃柑病害中病原真菌的防控工作，本課題組在廣西南寧上林沃柑培育基地開展了沃柑病害的調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沃柑枝葉及果實(shí)在生長(zhǎng)過程中，會(huì)出現(xiàn)不同程度的真菌感染，病征與柑橘炭疽病、柑橘潰瘍病及柑橘黑點(diǎn)病的癥狀相似，為弄清病原真菌種類及尋找針對(duì)性的防治方法，本研究對(duì)沃柑葉斑病害中病原真菌進(jìn)行分離和初步鑒定，并開展了紅樹林放線菌抗沃柑病原真菌的研究。

放線菌，尤其是鏈霉菌是天然抗菌活性產(chǎn)物的主要來源，約2/3的抗生素是由放線菌產(chǎn)生[7]。放線菌作為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群，經(jīng)過數(shù)十年來大規(guī)模的挖掘和篩選后，普通生態(tài)環(huán)境中挖掘出新穎的放線菌資源越來越困難，故人們將目光轉(zhuǎn)向了特殊生態(tài)環(huán)境。紅樹林作為海陸交界的特殊生態(tài)系統(tǒng)，其微生物群落在適應(yīng)生態(tài)環(huán)境與自我保護(hù)中，通過通信、覓食、拮抗等互作的微生物生存機(jī)制，來適應(yīng)謂之“生命極限”的特殊環(huán)境，其獨(dú)特的生境必然會(huì)造成其代謝出更具特點(diǎn)的化合物及其相應(yīng)的生物活性[8]。研究發(fā)現(xiàn)，紅樹林土壤放線菌不僅產(chǎn)生多種功能酶[9]，而且還分泌具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化等藥用活性的代謝產(chǎn)物[9-12]。本研究以分離到的植物病原真菌為指示菌，從紅樹林放線菌中篩選出了具有顯著抑菌活性的菌株，為沃柑葉斑病害的防控奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試樣本

(1)病害樣本于2021年10月采集自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所的沃柑培育基地，采集有明顯病癥部位的葉片樣品，裝于密封袋帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。

(2)健康葉片樣本采自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研基地，選取形態(tài)相近且健康的沃柑帶葉枝條若干，放置于密封袋保存帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.2 主要試劑和儀器

(1)試劑 培養(yǎng)基原料、TAE緩沖液、2×EasyTaqMasterMix、引物(ITS1和ITS4)、DNA marker、GoldView核酸染料，Chelex 100樹脂(Bio-Rad)，其他有機(jī)試劑(分析純)等購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

(2)儀器 SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)(杭州佳濾設(shè)備有限公司)，HH·B11-BS-Ⅱ型恒溫培養(yǎng)箱(東莞市恒宇儀器有限公司)，Tgradient型PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra)，電泳儀(美國BioRad)，Gel Logic 2200Pro凝膠成像儀(Carestream)，VB-55型高壓滅菌鍋(德國Systec)，MINI-6k型迷你離心機(jī)(常州市國旺儀器制造有限公司)，MINIB-100型金屬浴(杭州米歐儀器有限公司)，恒溫振蕩器(美國Crystal)，N1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Eyela)和光學(xué)顯微鏡(日本Nikon)等。

1.1.3 培養(yǎng)基

真菌分離、純化及拮抗菌篩選培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基(土豆200.0 g，葡萄糖20.0 g，去離子水1000 mL，瓊脂14.0 g，pH 6.8～7.2)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：改良InternationalStreptomycesProject 2(ISP2)固體培養(yǎng)基[14]。

1.1.4 供試放線菌菌株

選取24株于2021年11月分離自廣西茅尾海紅樹林自然保護(hù)區(qū)內(nèi)桐花樹根際土壤的放線菌，通過EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(https://www.ezbiocloud.net/)在線比對(duì)[15]，這些放線菌隸屬于12屬，其中5株鏈霉菌屬(Streptomyces)，5株紅球菌屬(Rhodococcus)，3株微桿菌屬 (Microbacterium)，3株小單孢菌屬 (Micromonospora)，2株類諾卡菌(Nocardioides)，壤霉菌屬(Agromyces)、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、戈登菌屬(Gordonia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、棲白蟻菌屬 (Isoptericola)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)和Phycicoccus屬各1株；均保藏于廣西科學(xué)院北部灣海洋微生物種質(zhì)資源庫中，具體信息見表1。

表1 拮抗實(shí)驗(yàn)用紅樹林放線菌信息Tab.1 Actinomycete strains from mangrove for antagonistic assay

1.2 病原真菌分離與鑒定

1.2.1 菌株分離純化

用自來水沖洗患病葉片組織后，依次用75%乙醇和5%次氯酸鈉溶液浸泡組織各5 min，每次消毒后用滅菌水反復(fù)沖洗3次。處理后的病樣組織置于超凈工作臺(tái)晾干，用無菌剪刀將有病樣部位剪成小塊，分散鋪于PDA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3～5 d。觀察平板上菌落生長(zhǎng)情況，挑取肉眼可見菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，并將純化好的菌株接種至PDA試管培養(yǎng)基中，待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后進(jìn)行斜面保藏。

1.2.2 真菌生長(zhǎng)速率測(cè)定及形態(tài)觀察

用打孔器(直徑6 mm)取新鮮的菌苔邊緣的菌絲塊轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基(直徑90 mm)中央，置于28℃培養(yǎng)，每株菌3組平行。用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，待菌絲長(zhǎng)滿即停止測(cè)量，菌落平均生長(zhǎng)速率單位為mm/d。挑取PDA表面的分生孢子，在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)。

1.2.3 真菌菌株基因測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析

采用chelex-100樹脂[16]快速提取待測(cè)真菌的基因組DNA作為PCR模板，對(duì)待測(cè)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，特異性擴(kuò)增出各個(gè)菌株的ITS1-5.8S-ITS2區(qū)域，基因序列長(zhǎng)度約為550 bp；擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性8 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。序列經(jīng)BioEdit Sequence Alignment Editor軟件整理后，測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，分別獲得同源性相近的菌種序列，運(yùn)用MEGA7.0軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)樹，對(duì)各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進(jìn)行分析[17]。

1.2.4 致病性測(cè)定

參照趙洪濤等[18]的方法，按照柯赫氏法則，對(duì)分離到的疑似致病菌株進(jìn)行回接驗(yàn)證。具體操作如下，將新鮮葉子從枝條上剪下，用自來水進(jìn)行表面沖洗后，再用75%乙醇溶液對(duì)其表面消毒3次，每次消毒后用無菌水沖洗3遍，置于超凈工作臺(tái)中晾干。用無菌牙簽在葉面上有序扎數(shù)個(gè)孔。用無菌生理鹽水制備真菌分生孢子液，懸浮液濃度約為1×107CFU/mL。滴加10 μL在扎孔處，對(duì)照組則滴加10 μL無菌生理鹽水。接種后的葉片置于玻璃平皿中，底部放入潤(rùn)濕的無菌紗布，每組3張葉片，每組3個(gè)平行，置于28℃的人工氣候箱中，12 h光照/12 h黑暗交替培養(yǎng)，注意補(bǔ)水保濕；定期觀察葉片發(fā)病情況，對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌的分離和鑒定。

1.3 拮抗菌的篩選及活性測(cè)試

1.3.1 菌株抑菌活性初篩

采用平板對(duì)峙法對(duì)24株供試菌株進(jìn)行拮抗活性篩選，用無菌打孔器將分離到的病原真菌制成6 mm菌餅，接種于PDA固體平板中央，放置28℃培養(yǎng)，病原真菌C1和C4培養(yǎng)2 d，C2和C3培養(yǎng)1 d后，再將待測(cè)放線菌接種于PDA固體平板四周，每板接4株細(xì)菌；以僅接種病原真菌菌餅的PDA固體平板為空白對(duì)照組，放置28℃培養(yǎng)5～7 d，觀察并記錄病原真菌的生長(zhǎng)情況。

1.3.2 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性測(cè)試

選取初篩活性良好的菌株進(jìn)行菌株發(fā)酵產(chǎn)物活性檢測(cè)，旨在確定活性產(chǎn)物極性。選擇改良ISP 2培養(yǎng)基作為搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。采用與文獻(xiàn)[19]相同的菌株發(fā)酵條件及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取方法。受試菌株留存3類樣品：①發(fā)酵液離心后的上清原液(下文簡(jiǎn)稱為原液)；②上清乙酸乙酯萃取后的甲醇濃縮物(下文簡(jiǎn)稱酯相)；③菌體丙酮浸提后的甲醇溶解液(下文簡(jiǎn)稱菌體浸提物)；3種樣品均用一次性過濾器(0.22 μm孔徑)處理后使用。采用牛津杯法[20]檢測(cè)菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性，以改良ISP2液體培養(yǎng)基/甲醇溶液為空白對(duì)照，每個(gè)牛津杯加入初始樣液150 μL，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，觀察并記錄指示真菌的生長(zhǎng)情況，并計(jì)算拮抗菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌率，公式如下：

抑菌圈直徑=對(duì)照組病原菌直徑-實(shí)驗(yàn)組病原菌直徑

抑菌率=抑菌圈直徑/對(duì)照組病原菌直徑×100%

1.3.3 活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物的病害防治測(cè)試

選取真菌C4侵染健康的沃柑葉片，測(cè)試活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物的病害防治效果。試驗(yàn)設(shè)計(jì)2組，按“1.2.4”處理新鮮的待試沃柑葉片。試驗(yàn)1：用無菌牙簽在葉面上有序扎8～10個(gè)孔，將發(fā)酵原液/酯相均勻噴灑至葉片的正面和背面，晾干后，在扎孔處滴加10 μL真菌C4的分生孢子液(濃度約為1×107CFU/mL)。試驗(yàn)2：用無菌牙簽在待試沃柑葉面上有序扎8～10個(gè)孔，將10 μL真菌C4的分生孢子液(濃度同上)滴加在扎孔處，培養(yǎng)至葉片出現(xiàn)病斑，再將發(fā)酵原液/酯相均勻噴灑接種至葉片的正面和背面。兩組實(shí)驗(yàn)均以噴灑改良的ISP2液體培養(yǎng)基/甲醇溶液作為空白對(duì)照，接種后的葉片均置于玻璃平皿中，底部放入潤(rùn)濕的無菌紗布，每組20張葉片，置于28℃的人工氣候箱中，12 h光照/12 h黑暗交替培養(yǎng)，注意補(bǔ)水保濕，定期觀察葉片發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)葉片上病斑數(shù)量，并計(jì)算沃柑葉片的病情指數(shù)和菌株發(fā)酵產(chǎn)物的防治效果。

參照文獻(xiàn)[18]方法，將病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)制定如下：0級(jí)，無病斑；1級(jí)，每葉有1～3個(gè)病斑；3級(jí)，每葉有4～6個(gè)病斑；5級(jí)，每葉有7～10個(gè)病斑。

病情指數(shù)=[Σ(各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值)/(試驗(yàn)總?cè)~數(shù)×5)]×100%

防治效果=(對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對(duì)照組病情指數(shù)×100%

1.4 目標(biāo)菌株基因組序列antiSMASH在線預(yù)測(cè)與分析

對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行基因組測(cè)序分析。將菌株接種于改良ISP2液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min搖瓶震蕩培養(yǎng)5 d，8000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌水洗滌3次后裝入15 mL離心管，迅速冷凍后寄送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成基因組的提取、測(cè)序、組裝和注釋?；蚪M序列通過antiSMASH服務(wù)器(https://antismash.secondarymetabolites.org/)進(jìn)行次級(jí)代謝生物合成基因簇的預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原真菌分離與鑒定

2.1.1 菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率及分生孢子等形態(tài)學(xué)觀察

從病樣組織中分離出7個(gè)菌株，根據(jù)其菌落及分生孢子形態(tài)特征(圖1)分為4種真菌：①C1菌落呈棕黑色，橙紅色氣生菌絲致密，常產(chǎn)生橙色露珠狀液滴使之呈紅色，生長(zhǎng)緩慢(8.02 mm/d)；分生孢子呈短桿狀或橢圓狀。②C2菌落呈紫紅色，后期產(chǎn)生紫紅色色素，氣生菌絲白色濃密，生長(zhǎng)較快(16.21 mm/d)；分生孢子呈鐮刀形。③C3菌落呈粉紅色，氣生菌絲白色濃密，生長(zhǎng)較快(16.13 mm/d)；分生孢子呈鐮刀形。④C4菌落呈白色或奶白色，氣生菌絲灰白色濃密，生長(zhǎng)較慢(12.58 mm/d)；分生孢子呈磚格狀或鐮刀形。

圖1 病樣分離菌株的菌落及分生孢子形態(tài)Fig.1 Colony and conidia morphology

2.1.2 病原真菌的分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)測(cè)序比對(duì)，真菌C1的ITS基因序列與Boeremia exigua(登記號(hào)MH484014.1)完全一致；真菌C2、C3和C4均屬于鐮刀菌屬(Fusarium)菌株，其ITS基因序列分別與層出鐮刀菌Fusariumproliferatum(登記號(hào)HQ380763.1)，藤黑鐮孢菌Fusariumfujikuroi(登記號(hào)KJ000429.1)和腐皮鐮刀菌Fusarium solani(登記號(hào)KT184399.1)一致，并對(duì)其構(gòu)建Neighbour-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)；并根據(jù)真菌鑒定手冊(cè)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[21-25]，這些真菌的分子鑒定結(jié)果與觀察到的生物學(xué)特性相吻合。

圖2 基于ITS基因序列構(gòu)建菌株C1，C2，C3和C4的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 N-J phylogenetic tree of the strain C1,C2,C3 and C4 based on the ITS gene sequences

2.1.3 致病性測(cè)定

按照柯赫氏法則，通過針刺接種法將疑似致病菌株C1～C4的分生孢子接種到健康的沃柑葉片上。結(jié)果表明，接種C1的葉片在第5天出現(xiàn)褐色病斑，棕色處呈凹陷空洞，病健交界處出現(xiàn)黃綠暈圈(圖3a)；接種C4的葉片在第2天出現(xiàn)黑色病斑，外延微微隆起，黑色病斑向外擴(kuò)張，病癥惡化速度極快(圖3d)；且從各自發(fā)病的葉片上，重新分離到C1和C4菌株。接種層出鐮刀菌C2(圖3b)和藤黑鐮孢菌C3(圖3c)則均與對(duì)照組的表征相同，未見病灶?？梢?，真菌C1和C4均能感染沃柑葉片，且真菌C4的感染情況較真菌C1的感染情況嚴(yán)重。

圖3 C1-C4菌株致病性測(cè)定結(jié)果(真菌感染5～7d)Fig.3 Orah leaf infected by fungal strain C1-C4 after 5-7 days

2.2 拮抗菌活性測(cè)試

2.2.1 拮抗菌的篩選

采用平板對(duì)峙法對(duì)24株紅樹林放線菌進(jìn)行拮抗活性初篩，篩選到1株鏈霉菌M2020對(duì)4株病原真菌表現(xiàn)出顯著活性(圖4A組)。再用牛津杯法對(duì)菌株M2020的發(fā)酵原液、發(fā)酵液酯相及菌體浸提物進(jìn)行抑制病原真菌C1～C4的活性測(cè)試。結(jié)果顯示，M2020菌體浸提物對(duì)真菌C1～C4均無抑菌活性，M2020的發(fā)酵原液對(duì)真菌C1、C2和C3無抑制作用，對(duì)真菌C4有抑制活性，抑菌圈小于等于22.74 mm，抑菌率為45.33%。M2020的發(fā)酵液酯相對(duì)真菌C1、C2、C3和C4均有抑制效果(圖4B組)，抑菌圈直徑分別為25.70、47.60、37.10和25.30 mm，抑菌率分別為63.61%、62.63%、53.22%和47.65%。

圖4 鏈霉菌M2020抗真菌C1～C4活性Fig.4 Antifungal activities of strain M2020 against fungal strains C1～C4

2.2.2 鏈霉菌M2020的防病害效果

以致病真菌C4作為指示菌株，通過針刺接種法將其分生孢子接種到健康的柑桔葉片上，用菌株M2020的發(fā)酵原液和酯相處理葉片，觀察葉片出現(xiàn)病害的情況，從而判斷M2020菌株的防病害效果。結(jié)果表明，菌株M2020的發(fā)酵原液和酯相對(duì)真菌C4侵染有顯著抑制效果。試驗(yàn)1中，發(fā)酵原液處理組有2片葉子出現(xiàn)褐色病斑，部分葉片的扎孔處均有患病后結(jié)痂痕跡(圖5A-1)，酯相處理組中有5片明顯病征的葉子，部分病斑出現(xiàn)中心斑塊淡化(圖5A-2)；結(jié)合葉片患病指數(shù)和防治效果(表2)，試驗(yàn)1中發(fā)酵原液處理后的葉片患病率較低(患病指數(shù)為8.42%)，即發(fā)酵原液防止真菌C4侵染效果較好(防治效果為89.87%)。試驗(yàn)2中，發(fā)酵原液處理組有5葉片出現(xiàn)黑色病斑，有3處黑斑呈向外擴(kuò)張惡化嚴(yán)重(圖5B-1)；酯相處理組中多數(shù)葉斑呈現(xiàn)結(jié)痂狀態(tài)。從表2可知，試驗(yàn)2中發(fā)酵酯相處理的葉片患病率較低(患病指數(shù)為5.00%)，即發(fā)酵液酯相在沃柑葉片出現(xiàn)葉斑后的控制效果佳(防治效果為94.56%)。綜上，在沃柑葉斑病害(真菌C4感染)的防治上，可先用菌株M2020發(fā)酵原液處理葉片來預(yù)防病原真菌侵染；若葉片出現(xiàn)病癥，可用發(fā)酵液酯相控制該病害的擴(kuò)大。

圖5 M2020發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)沃柑葉片患病前/后處理的藥效試驗(yàn)圖Fig.5 Field test of strain M2020 fermentation products on pretreatment or post treatment of Ora

表2 M2020發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)沃柑葉片患病前/后處理的藥效試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Field test of strain M2020 fermentation products on pretreatment or post treatment of Orah

2.3 鏈霉菌M2020次級(jí)代謝產(chǎn)物合成潛力分析

基于基因組信息對(duì)鏈霉菌M2020合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛力進(jìn)行預(yù)測(cè)，菌株M2020基因全長(zhǎng)8.1 Mbp，GC含量為72.2 mol%。經(jīng)antiSMASH預(yù)測(cè)分析，其潛在的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster，BGC)共有38個(gè)(表3)，主要包含聚酮類(T1PKS、T2PKS和T3PKS)、非核糖體多肽類(NRPS)、萜烯類(terpene)、非α-多聚氨基酸類(NAPAA)、核糖體合成和翻譯后修飾肽(RiPP-like) 、羊毛硫肽類(lanthipeptide)、嗜鐵素(siderophore) 和四氫嘧啶(ectoine)等已知基因簇。

表3 M2020次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇Tab.3 Secondary metabolite biosynthesis gene clusters of M2020

此外，T1PKS(5451、18350和46353 bp)terpene(20950 bp) lanthipeptide class Ⅲ(22729 bp)RiPP-like(10227 bp和10842 bp) lassopeptide(22442 bp)other(32525 bp) butyrolactone (10342 bp和10920 bp)基因簇未匹配到同源基因簇的序列。

3 結(jié)論與討論

廣西的沃柑種植面積位居全國第一位，對(duì)廣西的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)意義明顯。本研究針對(duì)沃柑真菌病害，從廣西南寧采集的沃柑葉片上分離到代號(hào)C1～C4的4株真菌，經(jīng)初步鑒定，分別為大豆莖點(diǎn)霉、層出鐮刀菌、藤黑鐮孢菌和腐皮鐮刀菌。文獻(xiàn)調(diào)研表明，大豆莖點(diǎn)霉是破壞性極強(qiáng)的病原真菌，可導(dǎo)致棉花[26]、秋葵[27]、煙草[28]及大豆[29]等農(nóng)作物患病。鐮刀菌是另一類分布廣泛的植物病原真菌，能侵染多種糧食和飼料作物的根、莖、葉及果實(shí)而引起根腐、穗腐和莖腐等病害[30]。其中腐皮鐮刀菌是由厚垣孢子可通過微小創(chuàng)面進(jìn)入植物體的維管束中萌發(fā)，導(dǎo)致一系列植物腐爛病害[31]。本研究的回接實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大豆莖點(diǎn)霉C1和腐皮鐮刀菌C4能導(dǎo)致沃柑的健康葉片染病。

在此基礎(chǔ)上，利用廣西紅樹林特境來源的24株放線菌對(duì)4株病原真菌(代號(hào)C1～C4)進(jìn)行拮抗活性篩選，其中鏈霉菌M2020對(duì)真菌C1～C4均表現(xiàn)出拮抗活性，其活性物質(zhì)分布在發(fā)酵原液和酯相中。經(jīng)16S rRNA基因序列比對(duì)分析，菌株M2020與鏈霉菌Streptomyces angustmyceticusNRRLB-2347T系統(tǒng)發(fā)育最為密切，相似率為100%。文獻(xiàn)調(diào)研表明，Streptomyces angustmyceticus對(duì)植物病原真菌具有高效廣譜抑制活性，如對(duì)大白菜葉斑病病原菌Colletotrichumsp.和Curvularia lunata的抑菌率達(dá)75.6%和69.5%[32]，對(duì)植物病原真菌尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum，F(xiàn)oc)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)均有很好的抑制作用[33]。為預(yù)測(cè)菌株M2020潛在合成產(chǎn)物，對(duì)其全基因組進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇比對(duì)分析。菌株M2020的基因組中預(yù)測(cè)出38個(gè)BGC，其中與已有基因簇相似度較高(30%～100%)的BGC有12個(gè)，對(duì)應(yīng)合成具有抑菌活性的已知化合物有4類，即大環(huán)內(nèi)酯caniferolide A/B/C/D、硫肽類抗生素環(huán)噻唑霉素cyclothiazomycin、創(chuàng)新霉素chuangxinmycin和聚酮類piericidin A1，菌株M2020可能會(huì)產(chǎn)生這些具有抑菌活性的化合物或其類似物。此外，有15個(gè)BGC與已有基因簇相似值低于30%，11個(gè)BGC未匹配到同源基因簇，這些未知BGC的存在暗示菌株M2020有產(chǎn)生新抗生素的潛力。值得一提的是，S.angustmyceticusNRRLB-2347T生產(chǎn)的一種核苷類抗生素狹霉素(angustmycins)，具有很好的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)活性和一定抑菌活性[34]?？傊?，鏈霉菌M2020具有顯著且廣譜的抑制真菌活性效果，在沃柑真菌病害防治上得到了一定的驗(yàn)證。然而，該菌株的抑菌活性是由何種次級(jí)代謝產(chǎn)物決定，是否產(chǎn)生狹霉素，其對(duì)田間沃柑真菌病害的藥效如何，是否對(duì)柑橘其他真菌病害有防治潛力等問題，均是亟須進(jìn)一步研究的內(nèi)容。