劉文杰 張曉寒 吳佳歡 唐佳慧 姜淑玲 郭文強

(井岡山大學，吉安 343009)

來源于植物的微生物，如植物內(nèi)生菌，由于棲息于植物組織，但對植物沒有危害，因此一直未受到重視，直到20世紀90年代，從中發(fā)現(xiàn)了紫杉醇和紫杉烷及喜樹堿等具有重要藥用價值的天然產(chǎn)物，這些植物來源的微生物才引起了廣泛的關注[1]?；谥参飦碓凑婢渭壌x產(chǎn)物的大量研究發(fā)現(xiàn)，其在抗病毒、抗炎、抗菌和抗腫瘤等方面表現(xiàn)出巨大的開發(fā)潛力，已經(jīng)成為特殊生態(tài)環(huán)境來源新藥研發(fā)的熱點[2-5]。井岡山國家自然保護區(qū)地處我國江西省腹地，是一個極具南方紅壤丘陵特色、又兼顧森林地貌的生態(tài)環(huán)境，微生物群落豐富多樣[6]。植物龍腦樟作為井岡山地區(qū)重要的藥用樟品種，其枝葉精油中富含右旋龍腦，是提取天然冰片的主要來源。目前，國內(nèi)外對龍腦樟關注的焦點集中在包括冰片在內(nèi)的揮發(fā)性精油方面，鮮有其內(nèi)生菌方面的研究[7]。文獻報道，龍腦樟內(nèi)部微環(huán)境富含小分子精油，作為微生物的一種特殊的生存壓力，預示著與該植物相關的真菌可能具有獨特的代謝途徑。對樟樹來源真菌次級代謝產(chǎn)物開展的抗菌研究發(fā)現(xiàn)，其對導致花卉植物根部壞死的病原菌隱地疫霉(Phytophthora cryptogea)具有較強的生物活性[8]。植物微環(huán)境的特殊性，使得與其相關的微生物具有產(chǎn)生潛在藥用價值化合物的可能性。

本研究選擇物種資源豐富的井岡山地區(qū)，聚焦內(nèi)部微環(huán)境特殊的龍腦樟組織及樹周苔蘚，開展了可培養(yǎng)真菌的分離工作，并對其發(fā)酵產(chǎn)物進行抗菌活性檢測，以期獲得具有抗菌活性真菌菌株，為新活性化合物發(fā)現(xiàn)和全面了解井岡山地區(qū)藥用真菌資源奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品

新鮮健康的龍腦樟樹皮、樹葉、種子及樹周苔蘚樣品于2019年10月采集于江西省吉安市羅霄山脈中段。每個采樣區(qū)域采集的2～4份樣品，并按樣品類別分別合并為大樣品，用于可培養(yǎng)真菌的分離純化，樣品信息見表1。樣品采集后裝入無菌自封袋中，運抵實驗室后置于4℃冰箱中保藏。

表1 羅霄山脈中段采集的樣品信息Tab.1 Information of samples collected from middle part of Luoxiao Mountains

1.1.2 實驗儀器

循環(huán)水式真空泵(型號：SHK-Ⅲ，鄭州科泰實驗設備有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號：RE-2000A，鄭州科泰實驗設備有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(型號：DNP-9082P03Ⅳ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；超凈工作臺(型號：SW-CJ-2D，蘇州蘇潔凈化設備有限公司)；高壓滅菌器(型號：KXQ-LS，上海博訊有限公司)；低溫冷卻液循環(huán)泵(型號：DLSK-5/20，鄭州科泰實驗設備有限公司)；電子天平[型號：BSA-124SNMR，賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司]，高效液相色譜儀[型號：1515，沃特世科技(上海)有限公司]。

1.1.3 指示菌

草分枝桿菌BNCC359483、枯草芽胞桿菌BNCC109047、恥垢分枝桿菌BNCC134980、金黃色葡萄球菌BNCC186335、大腸埃希菌BNCC336902采購自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.1.4 真菌培養(yǎng)基

固體分離培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，g/L)：馬鈴薯200.0，葡萄糖20.0，瓊脂18.0。液體發(fā)酵培養(yǎng)基(真菌2號，g/L)：葡萄糖10.0，麥芽糖20.0，谷氨酸鈉10.0，甘露糖醇20.0，KH2PO40.5，玉米漿1.0，酵母浸粉3.0，MgSO4·7H2O 0.3，pH6.5。每種培養(yǎng)基添加抑制劑的種類、濃度參照文獻方法[9]。

1.2 方法

1.2.1 真菌分離與純化

用自來水將采集的龍腦樟各部位及樹周苔蘚樣品沖洗干凈，置于超凈臺晾干，用75%酒精浸泡處理1 min后，無菌水沖洗3次，5%次氯酸鈉溶液浸泡5 min后，再用無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸干樣品表面水分。組織樣品無菌操作，切成約0.5 cm2的組織塊,置于PDA固體培養(yǎng)基表面；樹周苔蘚樣品進行無菌研磨處理，研磨后的液體均勻涂抹在培養(yǎng)基表面，室溫培養(yǎng)3～5 d[9-10]。從培養(yǎng)基表面挑取單菌落，針刺法接種至PDA固體平皿，并在室溫下繼續(xù)培養(yǎng)36 h后分離純化得到不同形態(tài)的真菌菌落。通過對比菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地和孢子形態(tài)以及色素等培養(yǎng)特征，進行初步地去重復，最終得到純菌株。

1.2.2 真菌初步鑒定

采用生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成的ITS 通用引物：ITS1 (5'-AGAA GTCGTAACAAGGTTTC-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3')[11-12]。PCR擴增產(chǎn)物1%的瓊脂糖膠電泳檢測合格后，送至北京睿博生物科技有限公司測序。通過BLAST分析將鑒定出的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行分析，并在ClustalW軟件進行進一步比對[13]。利用Godinho提出的標準來分析驗證GenBank數(shù)據(jù)庫的BLAST結果：覆蓋率和序列同一性≥98%為同一個種；覆蓋率和序列同一性在95%～97%之間，可以確定為同一屬，而覆蓋率和序列同一性≤95%，則可以認為是新菌[14]。

1.2.3 真菌發(fā)酵培養(yǎng)與抗菌活性測試

將獲得的真菌分別接種至真菌2號液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，室溫靜置發(fā)酵培養(yǎng)30 d。采用與文獻[9]相同的菌株發(fā)酵條件及提取方法獲得發(fā)酵產(chǎn)物提取物。以5種指示菌進行粗提物抗菌活性篩選與評價，陽性對照為氯霉素。采用瓊脂紙片擴散法開展抑菌活性測試，紙片直徑為10.0 mm，制備含提取物的紙片的方法參照文獻[9]，將藥敏紙片放置在指示菌瓊脂表面上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。通過測量抑菌圈直徑來評價其抗菌活性強弱?？咕钚栽u價標準：抑菌圈直徑＜11.0 mm代表活性較弱；抑菌圈直徑11.0～15.0 mm代表中等活性；抑菌圈直徑＞15.0 mm代表活性較強。

1.2.4 次級代謝產(chǎn)物指紋圖譜分析與分離純化

真菌粗提物代謝物指紋圖譜分析采用高效液相(HPLC，美國Waters公司)，分析條件：5%～100%甲醇線性梯度洗脫45 min[9]。菌株JDWHS-7-081靜置發(fā)酵30 d，過濾后，菌體甲醇浸泡，超聲破碎；發(fā)酵液乙酸乙酯萃取兩次，減壓蒸餾。兩部分合并，獲得粗浸膏12.5 g。粗浸膏以硅膠柱層析進行分離，石油醚/丙酮系統(tǒng)(20:1～1:1)洗脫，所得7個組分進行抗菌活性測定。其中組分4表現(xiàn)出較好的抗菌活性，進一步采用甲醇為流動相的葡萄糖凝膠LH-20的色譜柱對組分4進行純化，收集8個組分，對獲得組分3采用ODS-C18半制備柱(YMC-Pack ODS-A,10 mm × 250 mm,5 μm,3 mL/min)，流動相比例：甲醇:水=65:35進行制備，獲得保留時間為28.6 min的化合物1純品。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析與處理

為評價龍腦樟來源優(yōu)勢真菌組成情況，分別統(tǒng)計分析真菌的分離率(isolation rate,IR)、定殖率(colonization rate,CR)、相對頻率(relative frequency，RF)[10]。分離率(IR)是指從樣本組織塊中得到的菌株數(shù)與全部樣本組織塊數(shù)的比值，IR=(組織塊中得到的菌株數(shù)/實驗供試的總組織塊數(shù))×100%。定殖率(CR)指樣本中受真菌侵染的組織塊數(shù)占全部樣本組織塊數(shù)的百分數(shù)，CR=(有真菌侵染的組織塊數(shù)/實驗供試的總組織塊數(shù))×100%。相對頻率(RF)是指樣本中分離到的某種真菌的菌株數(shù)占分離到總菌株數(shù)的百分數(shù)，RF=(樣本中分到的某種真菌的菌株數(shù)/分到的總菌株數(shù))×100%。

2 實驗結果與討論

2.1 龍腦樟來源真菌初步鑒定與分析

通過組織分離法從龍腦樟的各個樣品中獲得真菌197株，對其歸類分析發(fā)現(xiàn)涵蓋子囊菌類和接合菌類兩大真菌類群?；蛐蛄袑Ρ冉Y果顯示大部分菌株與數(shù)據(jù)庫最接近的種屬具有較高的相似度，初步推斷該來源真菌隸屬于10個目20個科29個屬(表2)。

表2 197株真菌的物種分布Tab.2 The genera distribution of 197 fungi

2.2 不同部位的真菌的分離率和定殖率

從龍腦樟的葉片、樹皮、種子及樹周苔蘚樣品中分別分離到真菌38、44、31和84株。真菌的分離率和定殖率在不同樣品中存在較大的差異，分離率依次為樹周苔蘚(71.8%)＞樹皮(63.2%)＞葉片(58.8%)＞種子(45.5%)；定殖率依次為樹周苔蘚(69.5%)＞樹皮(60.4%)＞葉片(55.7%)＞種子(40.6%)。結果顯示不同分離部位真菌的分離率和定殖率趨勢一致，但具有一定的差異性，其中樹周苔蘚的分離率和定殖率都最高，種子的分離率和定殖率最低(圖1)。

2.3 不同部位真菌組成及不同菌種的相對頻率

龍腦樟中優(yōu)勢菌屬為青霉屬和曲霉屬，它們相對頻率分別為28.93%和15.22%。盡管總體而言，青霉屬和曲霉屬為優(yōu)勢菌屬，但龍腦樟各部位之間優(yōu)勢屬真菌并不完全相同。從樹葉樣品分離到的38株真菌，分布于9個屬，以青霉屬(12株)為優(yōu)勢菌屬，占總數(shù)的31.57%；從樹皮樣品分離到的44株真菌，分布于11個屬，以曲霉屬(13株)為優(yōu)勢類群，占總數(shù)的29.54%；從種子樣品分離到的31株真菌，隸屬于7個屬,以青霉屬(10株)為優(yōu)勢類群，占總數(shù)的32.25%；從樹周苔蘚樣品分離到的84株真菌，隸屬于19個屬，以青霉屬為優(yōu)勢菌(24株)，占總數(shù)的28.57%。以上可見，不同部位的真菌群落組成各不相同，真菌群落的多樣性和分布因分離部位而異。

2.4 真菌次級代謝產(chǎn)物抗菌活性

所有分離到的真菌菌株，室溫靜置發(fā)酵30 d，獲得197個代謝粗提物，抗菌活性篩選結果發(fā)現(xiàn)，82株真菌的代謝產(chǎn)物至少對1種指示菌表現(xiàn)出抑制活性，總陽性率為41.62%，其中50株真菌顯示出廣譜的生物抑制活性(表3)。其中菌株JDWHS-7-081、JDWHS-7-086、JDWHS-9-27和JDWHS-10-02的次級代謝產(chǎn)物對多種指示菌顯示出較好的抑制活性，這為后續(xù)實驗奠定了基礎。

表3 龍腦樟來源真菌次級代謝產(chǎn)物抗菌活性Tab.3 Antibacterial activity of secondary metabolites of fungi from Cinnamomum camphora Chvar.Borneol

續(xù)表3

2.5 菌株JDWHS-7-081的次級代謝產(chǎn)物研究

對菌株JDWHS-7-081的代謝產(chǎn)物進行抗菌活性追蹤研究，從中獲得了1個代謝主產(chǎn)物化合物1，其NMR數(shù)據(jù)與文獻報道的已知化合物一致[15]，可以確定化合物1為混源萜類化合物Austin(圖2)。

化合物1白色粉末；ESI-MS:m/z501 [M+H]+(C27H32O9)。1H NMR (500 MHz,DMSO-d6)δH: 6.88(1H,s),6.72 (1H,d,J= 9.5 Hz),6.07 (1H,s,J= 10.0 Hz),5.80 (1H,s),5.75,5.26 (2H,s),4.82 (1H,q,J= 6.0 Hz),3.31 (2H,m),3.28 (2H,m),2.00 (3H,s),1.69 (3H,s),1.54(3H,s),1.46 (3H,s),1.29 (3H,s),1.15 (3H,d,J= 6.0 Hz),1.11 (3H,s)。13C NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC: 171.8,169.2,169.2,163.6,148.2,142.0,137.7,133.5,119.6,118.1,85.7,83.4,81.1,79.3,74.9,63.4,46.7,42.4,26.8,26.7,26.2,23.9,22.6,21.0,20.4,15.3,12.3。

3 討論

3.1 可培養(yǎng)真菌的多樣性

樟樹在我國南部各省份廣泛分布，是南方重要的藥用和綠化樹種。對該屬植物化學成分研究發(fā)現(xiàn)，其中多含揮發(fā)油、生物堿、瑞諾烷類二萜、芳香化合物、多酚、黃酮和有機酸等，現(xiàn)代藥理研究也發(fā)現(xiàn)其具有多種生物活性[16-17]。龍腦樟作為井岡山地區(qū)樟樹的一個重要樹種，內(nèi)部環(huán)境復雜且具有特點，棲息其中的真菌可能因生存壓力而進化出獨特的生物合成代謝途徑，針對其研究可能獲得結構類型新穎的活性天然產(chǎn)物。本研究以井岡山地區(qū)龍腦樟的各個部位樣本作為研究對象，獲得了197株歸屬于10個目20個科29個屬的可培養(yǎng)真菌，顯示出較好的物種多樣性。同時，在我們的研究中還發(fā)現(xiàn)真菌群落的多樣性和豐度在不同樣品之間存在差異，不同部位間的真菌類屬也具有明顯的差異?？傮w來說，江西龍腦樟不同部位的微環(huán)境差異可能會影響其中微生物分布特征。

3.2 可培養(yǎng)真菌的生物活性

近幾十年來，植物來源真菌作為特殊生境來源的微生物受到越來越多的關注，已成為生物活性物質(zhì)重要的資源庫[18]。研究發(fā)現(xiàn)，植物真菌已經(jīng)進化出適應植物微環(huán)境的遺傳和代謝機制，這意味著該來源的真菌具有產(chǎn)生結構類型獨特的代謝產(chǎn)物的潛力[19]。本研究以瓊脂紙片法研究了197株龍腦樟可培養(yǎng)真菌在實驗室條件下次級代謝產(chǎn)物的抗菌生物活性，發(fā)現(xiàn)50株具有廣譜抗菌活性的菌株，其中JDWHS-7-081和JDWHS-10-27表現(xiàn)出較為突出的抑菌活性。這些未開發(fā)的活性菌株有待進一步開展天然產(chǎn)物研究。

通過對活性菌株JDWHS-7-081代謝產(chǎn)物研究獲得了混源萜類類化合物1，該類化合物通常從真菌，尤其是曲霉屬和青霉屬[20-21]真菌培養(yǎng)產(chǎn)物中獲得。混源萜類化合物是類異戊二烯來源的天然產(chǎn)物，其中混合聚酮-萜類是一類重要結構類型，并且起始于3,5-二甲基芥子酸(DMOA)的混源萜類化合物是最常見的亞類[22]。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100多種DMOA衍生的混源萜類化合物，其在抗菌、抗蟲和酶抑制活性領域表現(xiàn)出巨大的研究潛力[23-24]。

綜上所述，井岡山地區(qū)龍腦樟來源可培養(yǎng)真菌的物種多樣性較為豐富，獲得的抗菌活性菌株為后續(xù)深入開展天然產(chǎn)物研發(fā)研究奠定了菌株基礎。