侯建平 黃旭文 周鵬 曹敏 王鴻鵬 張云峰 曹飛 張秀敏,*

(1 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北省微生物育種與保育工程實驗室，河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用實驗室，保定 071002；2 河北大學(xué)藥學(xué)院，藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點實驗室，保定 071002)

鐵皮石斛(Dendrobium officinale)是一種具有補氣清熱、活血益胃等功效的名貴中藥。由于生長條件苛刻和長期挖掘使鐵皮石斛野生資源不斷減少[1]。有學(xué)者利用組織培養(yǎng)的技術(shù)來繁殖鐵皮石斛，雖然相關(guān)技術(shù)已經(jīng)成熟，但仍然存在一些問題，如組培的育苗成活率低且生長緩慢，長成的植株含藥成分少等[2]。

內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指生活在植物體內(nèi)并對植物不產(chǎn)生危害的一類真菌[3]。自1993年，Strobel等[4]在一株植物內(nèi)生真菌中分離得到紫杉醇之后，人們開始關(guān)注植物內(nèi)生真菌的藥用價值。由于植物內(nèi)生真菌與其寄生植物經(jīng)過長期協(xié)同進(jìn)化，促使內(nèi)生真菌產(chǎn)生一些特殊的化合物，其活性和藥用植物的功能也存在一定關(guān)系[5]，并且植物在抵御外界環(huán)境的變化和病原菌的侵害時，會促使內(nèi)生真菌代謝出新穎的活性化合物，主要包括一些生物堿類、萜類、甾體類、醌類、環(huán)肽及脂肪類等[6]。植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物具有多種生物活性，包括抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、殺蟲、免疫抑制和降糖等[8-11]。

目前報道的石斛內(nèi)生真菌包括柱孢霉屬(Cylindrocarpon)、枝頂孢霉屬(Acremonium)、瘤菌根菌屬(Epulorhiza)、蝕絲霉屬(Myceliophthoreae)、頭孢霉屬(Cephalosporium)、角菌根菌屬(Ceratorhiza)、簡梗孢霉屬(Chromosporium)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、叢梗孢屬(Moniliopsis)、毛殼菌屬(chaetomium)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、間座殼屬(Diaporthe)、球座菌屬(Guignardia)、脈孢菌屬(Neurospora) 、索氏菌屬(Sordaria)、青霉菌屬(Penicillium)、德巴利酵母(Debaryomyces)、圓錐陷球殼(Trematosphaeria)、白粉寄生孢屬(Ampelomyces)、節(jié)菱孢屬(Arthrinium)、裸胞殼屬(Emericella)等物種[12-17]。本研究對9株分離自安徽大別山鐵皮石斛(D.Officinale)根部的內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定，它們歸屬于3個屬，其中樹粉孢屬(Oidiodendron)和Acremoniopsis屬是未曾報道過的石斛內(nèi)生真菌物種，并且初步確定了枝頂孢霉屬的兩個潛在新種，以及樹粉孢屬的一個潛在新種。此外，還初步探究了9株鐵皮石斛內(nèi)生真菌的抗菌和抗腫瘤細(xì)胞活性及其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞

本實驗所用的9株鐵皮石斛內(nèi)生真菌分離自安徽大別山鐵皮石斛根部，菌株編號分別為205509、205513、205517-1、205514、205522、205525、205528、205529和2055495。病原指示細(xì)菌為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)。以上菌株和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7均保存在河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA和PDB培養(yǎng)基(Solarbio)，NA和NB培養(yǎng)基(Solarbio)、發(fā)酵培養(yǎng)基：大米200 g，去離子水170 mL，121℃滅菌25 min。RPMI-1640培養(yǎng)基(Solarbio)和DMEM培養(yǎng)基(Solarbio)。

1.2.3 儀器與試劑

儀器：精密電子天平(FA1004)天津天馬恒基儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱(250B)江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；高速冷凍離心機(jī)(Z14A080)貝克曼庫爾克公司；恒溫?fù)u床(DLHR-Q 200)北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司；PCR儀(BIOMETRA)美國Idaho Technology公司；熒光顯微鏡(BX51)奧林巴斯公司；CO2培養(yǎng)箱(HH.CP-01W-Ⅱ)上海坤誠科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(QUC-23050-J00)miVac；Biotage快速制備色譜儀(Isolera one)瑞典Biotage公司；高效液相色譜儀(L-2003) (HITACHI)日本日立公司；600 MHZ數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振波譜儀(AVAKCEⅢ 600 MHZ)瑞士布魯克公司。試劑：TE緩沖液(Solarbio)、苯酚(科密歐)、氯仿(科密歐)等提取真菌基因組相關(guān)試劑；胰蛋白酶(Solarbio)、臺盼藍(lán)(Solarbio)和順鉑(Solarbio)等細(xì)胞毒性測試相關(guān)試劑；二氯甲烷(科密歐)、甲醇(科密歐)等化合物分離純化相關(guān)試劑。

1.3 方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將活化好的實驗菌株接于無菌PDA平板上，將無菌蓋玻片以45度角斜插入培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～15 d，取不同培養(yǎng)時間的插片于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

采用酚-氯仿抽提法[18]對菌株的基因組DNA 進(jìn)行提取，使用真菌通用引物ITS1(5'-CCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')[19]擴(kuò)增ITS序列，用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，之后送至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3.3 活性篩選樣品的制備

將9株供試菌株在PDA斜面上進(jìn)行活化，之后分別接種于PDB培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)7 d。發(fā)酵結(jié)束后，將菌體過濾，加入相同體積的乙酸乙酯對發(fā)酵液萃取3～4次，然后濃縮蒸干，稱重，用10%DMSO(V/V)進(jìn)行溶解，使其終濃度為50 mg/mL，置于-20℃條件下冷凍保藏，用于活性測定。

1.3.4 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制活性測定

將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入適量含10%(V/V)的胎牛血清RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，每隔12 h進(jìn)行換液，在細(xì)胞生長到對數(shù)生長期，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，當(dāng)細(xì)胞變圓隆起時，去掉胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)基，制成單細(xì)胞懸液進(jìn)行反復(fù)吹打。用0.4%的臺盼藍(lán)測定人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的活性，細(xì)胞活性要達(dá)90%以上后，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞的密度調(diào)整為1×104個/mL，用排槍吸取細(xì)胞懸液于96孔板中，每孔120 μL，置于37℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)12 h后，待測樣品設(shè)置4個重復(fù)，每孔加入20 μL配好的樣品，陽性對照加入1 mg/mL的順鉑20 μL，空白對照加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液20 μL；置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，96孔板1000 r/min離心10 min，除去待測樣品和RPMI-1640培養(yǎng)液；培養(yǎng)24 h后，用倒置顯微鏡對培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行觀察記錄情況；每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，在5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4 h，以1000 r/min離心96孔板10 min，除去未反應(yīng)的MTT溶液，再加入DMSO 180 μL；在酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀下震蕩10 min，在波長492 nm條件下測定吸光度(A492值)；計算樣品對人乳腺癌MCF-7的抑制率，并使用以下公式對每株抗人乳腺癌MCF-7菌株發(fā)酵產(chǎn)生的粗提物進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。抑制率(%)=(1-樣品孔A492/空白對照孔A492)×100%。

1.3.5 抗菌活性測定

分別將病原指示菌接種于NB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，按1%的接種量將A600值為0.6的病原指示細(xì)菌培養(yǎng)液與冷卻至適溫的PDA培養(yǎng)基混勻倒平板。采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，分別將5 μL提取的待測樣品和空白對照(10% DMSO)，滴加在已滅菌濾紙片上，之后等距離放在含有不同病原指示菌的平板上，每個樣品設(shè)置一個平行，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1 d，觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)并測量抑菌圈的直徑。

1.3.6 菌株205509的培養(yǎng)及次級代謝產(chǎn)物的分離純化

將菌株205509接種在PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)2 ～ 3 d ，待長出大量孢子后，將平板切塊接種于無菌的500 mL/1000 mL三角瓶的無菌PDB培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)7 d作為種子液。按每瓶接種30 mL種子液于盛有200 g/1000 mL三角瓶的無菌大米培養(yǎng)基中，共接種100瓶，在室溫條件下發(fā)酵一個月。發(fā)酵完成后，將發(fā)酵物加入甲醇/二氯甲烷(1:1，V/V)混合溶液沒過菌體，超聲30 min，每瓶重復(fù)上述步驟3次，過濾除菌體，收集甲醇/二氯甲烷提取物。將提取物進(jìn)行減壓濃縮后，加入等體積的水和乙酸乙酯進(jìn)行3～4次萃取，將萃取液進(jìn)行減壓得粗浸膏49.87 g。將浸膏和硅膠(80～100目)按照質(zhì)量比1:1.5進(jìn)行拌樣，干法上樣，進(jìn)行Biotage正向硅膠柱層析，選擇石油醚:乙酸乙酯(1:0～0:1，V/V)和二氯甲烷:甲醇(1:0～0:1，V/V)對其先進(jìn)行初步的分離純化，經(jīng)薄層色譜檢測，合并樣品得到9個組分(Fr.1-9)。Fr.3和Fr.4再分別進(jìn)行Sephadex LH-20柱層析，均以甲醇:二氯甲烷(1:1，V/V)為流動相等度洗脫，分別得到組分Fr.3-1、Fr.4-1和Fr.4-2。將得到的3個組分進(jìn)行C18反相柱分離，以甲醇/水為流動相梯度洗脫，分別得到亞組分Fr.3-1-1、Fr.4-1-1、Fr.4-2-2和Fr.4-2-3。Fr.3-1-1經(jīng)過半制備高效液相色譜(甲醇:水，60:40，V/V)分離獲得化合物HXW-1(9 mg)；Fr.4-1-1經(jīng)過半制備高效液相色譜(甲醇:水，70:30)分離獲得化合物HXW-2(12 mg)；Fr.4-2-2經(jīng)過半制備高效液相色譜(甲醇:水，50:50，V/V)分離獲得化合物HXW-3(10 mg)；Fr.3-1-1經(jīng)過半制備高效液相色譜(甲醇:水，60:40，V/V)分離獲得化合物HXW-4(11 mg)。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

9株供試菌株在PDA培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)特征如圖1所示，菌絲和孢子等形態(tài)特征如圖2所示。

從菌落形態(tài)上來看，菌株205513和205517-1在PDA培養(yǎng)基上生長的形態(tài)與菌株205509基本相似，菌落表面為灰白色，毛絨狀，質(zhì)地稠密，背面為黃色；菌株205514在PDA培養(yǎng)基上生長緩慢，兩周左右形成直徑約2 cm的不規(guī)則圓形菌落,沒有明顯的菌絲，菌落表面比較光滑，質(zhì)地稠密；落背面無顏色。菌株205525菌落表面為灰色，絨毛狀，質(zhì)地致密；菌落背面為灰褐色。菌株205522與205528菌落形態(tài)相似，表面為深灰色，毛絨狀，質(zhì)地稠密，培養(yǎng)兩周后出現(xiàn)露珠狀分泌物。菌落背面為黑灰色，可見放射狀溝紋。菌株205529與菌株2055495的菌落形態(tài)相似，菌落表面為白色，毛絨狀，質(zhì)地稠密，培養(yǎng)兩周后出現(xiàn)露珠狀分泌物。菌落背面為黃褐色，可見放射狀溝紋。

顯微形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，菌株205509、205513和205517-1表現(xiàn)出相似生長特征，營養(yǎng)菌絲隔開，透明，光滑且壁薄。分生孢子梗直立，多數(shù)分枝，透明光滑，分生孢子為單細(xì)胞，近球形或卵球形，稍具細(xì)尖的基部，透明或近透明，排列成頭狀花序。菌株205514生長緩慢，菌絲透明，光滑且壁薄，分生孢子梗直立，分枝少，細(xì)長狀，分生孢子為單細(xì)胞，近球形或卵球形，透明或近透明，排列成頭狀花序。菌株205522、205525和205528表現(xiàn)出相似的生長特征，菌絲有隔膜，分生孢子梗出現(xiàn)分枝，一般分成3～6枝，分生孢子干燥，鏈狀，單細(xì)胞，球狀到近球形。菌株205529和2055495形態(tài)特征相似，菌絲有分隔，光滑且壁薄，分生孢子單細(xì)胞，球狀或近球形，頭狀花序。

2.2 分子學(xué)鑒定

通過ITS序列分析表明，菌株205509、205513、205517-1和205514屬于枝頂孢霉屬，其中菌株與205509、205513和205517-1與A.citrinumCBS 384.96最相近，序列相似性分別為99.04%、98.46%和99.22%，菌株205514與A.vitellinumCBS 248.83最相近，序列相似性為95.21%；菌株205528、205522和205525屬于樹粉孢屬，其中菌株205522和205528與O.fuscumUAMH 8511最相近，序列相似性均為94.65%，菌株205525與O.tenuissimumUAMH 1523最相近，序列相似性為98.52%；菌株2055495和205529屬于Acremoniopsis屬，二者都與A.suttoniiCBS H21936最相近，序列相似性分別為98.91%和99.81%。利用軟件MEGA7.0，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3～4。雖然菌株205514與A.vitellinumCBS 248.83 (MH631181)最相近，但在系統(tǒng)發(fā)育樹中，二者相聚較遠(yuǎn)(圖3)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征可以初步判斷該菌株代表枝頂孢霉屬的一個潛在新種；菌株205522和205528聚在一起，并形成了一個獨立的分支(圖4)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征可以初步判斷它們?yōu)闃浞坻邔俚囊粋€潛在新種；菌株205529和2055495屬于Acremoniopsis屬，但在GenBank中檢索到該屬只有A.suttonii一個種，因此，它們的物種地位還有待進(jìn)一步研究。

2.3 抗腫瘤活性測定

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制活性結(jié)果見表1，菌株205509、205513、205528、205529和2055495表現(xiàn)出對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7明顯的抑制率，其中菌株205509對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7具有良好的抑制作用(圖5)，菌株205509發(fā)酵萃取物的活性成分影響腫瘤細(xì)胞的正常生長，MCF-7細(xì)胞由正常的梭形皺縮成近似球形。

表1 9株供試菌株發(fā)酵萃取物對細(xì)胞MCF-7的抑制率Tab.1 Inhibitory rate of the fermentation extracts from 9 tested strains against human MCF-7 cells

2.4 抗菌活性的測定

抗菌活性統(tǒng)計結(jié)果見表2，可以看出只有菌株205529和2055495沒有表現(xiàn)出抗菌活性，其他的7株供試菌株表現(xiàn)出至少抑制一種病原指示菌的活性，菌株205509、205513、205517-1、205522、205525和205528表現(xiàn)出抑制至少3種病原菌，其中，菌株205509、205522和205528表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性。

表2 9株供試菌株發(fā)酵萃取物的抗菌活性Tab.2 Antibacterial activity of fermentation extracts from 9 tested strains

綜上，鐵皮石斛內(nèi)生真菌具有多種生物活性，值得進(jìn)行深入研究。從中選擇1株抗菌活性和細(xì)胞毒活性較好且次級代謝較豐富的菌株205509，對其次級代謝產(chǎn)物活性進(jìn)行了研究(圖6)。

2.5 菌株205509次級代謝產(chǎn)物的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒別

菌株205509批量發(fā)酵并經(jīng)乙酸乙酯萃取后得到了49.87 g浸膏，利用硅膠色譜柱對發(fā)酵萃取物進(jìn)行粗分，石油醚:乙酸乙酯(V:V)分級洗脫(100%石油醚，9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，9:1，100%乙酸乙酯)，最終分為9個組分(Fr.1-9)，通過葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱、C18反相柱和HPLC分離，共獲得4個化合物，分別為：HXW-1、HXW-3、HXW-8和HXW-12，培養(yǎng)和分離過程詳見“1.3.6”項。

2.5.1 化合物結(jié)構(gòu)的鑒別

化合物HXW-1，白色粉末，HPLC-M S：[M+H]+，m/z397.34。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:0.60(3H，s，H-18)，0.79(3H，d，J=7.6 Hz，H-26)，0.81(3H，d，J=6.8 Hz，H -27)，0.89(3H，d，J=6.8 Hz，H-28)，0.92(3H，s，H-19)，1.01(3H，d，J=6.8 Hz，H-21)，5.15(1H，m，H-22)，5.19(1H，m，H-23)，5.36(1H，q，J=2.8 Hz，H-7)，5.54(1H，dd，J=2.8 Hz，5.4 Hz，H-6)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:38.5(C，C-1)，32.2(C，C-2)，70.6(C，C-3)，40.9(C，C-4)，140.0(C，C-5)，119.7(C，C-6)，116.5(C，C-7)，141.5(C，C-8)，46.4(C，C-9)，37.2(C，C-10)，21.3(C，C-11)，39.3(C，C-12)，43.0(C，C-13)，54.8(C，C-14)，23.2(C，C-15)，28.5(C，C-16)，55.9(C，C-17)，12.3(C，C-18)，16.5(C，C-19)，40.6(C，C-20)，21.3(C，C-21)，135.8(C，C-22)，132.2(C，C-23)， 43.0(C，C-24)，33.3(C，C-25)，19.8(C，C-26)，20.1(C，C-27)，17.8(C，C-28)。該化合物的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道[20]的麥角甾醇(ergosta-6，8(9)，22-trien-3β-ol)基本一致，分子量為396。因此化合物HXW-1為麥角甾醇(ergosta-6，8(9)，22-trien-3β-ol)分子式為C28H44O，化合物HXW-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖7。

化合物HXW-3，棕黃色油狀物，[M+H]+，m/z277。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.09(1H，s，H-5)，5.24(1H，q，J=6.6 Hz，H-12)，5.16(1H，d，J=9.2 Hz，H-8)，3.95(3H，s，H-14)，2.64(2H，s，H-10)，1.67(1H，s，H-7)，1.57(3H，d，J=5.6 Hz，H-13)，1.59(3H，s，H-18)，1.46(3H，s，H-17)，1.29(3H，d，J=6.9 Hz，H-16)；13C NMR(151MHz，CDCl3)δ：162.3(C，C-1)，99.0(C，C-2)，179.5(C，C-3)，109.1(CH，C-4)，165.5(C，C-5)，35.6(CH，C-6)，125.8(CH，C-7)，135.8(C，C-8)，55.84(CH，C-9)，133.0(C，C-10)，120.2(CH，C-11)，13.3(CH3，C-12)，55.8(CH3，C-13)，6.4(CH3，C-14)，18.2(CH，C-15)，15.6(CH3，C-16)，14.9(CH3，C-17)。該化合物的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道[21]的acrepyrone A基本一致，分子量為276，分子式為C17H24O3。化合物HXW-3的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖8。

化合物HXW-8，棕黃色油狀物，1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：5.87(1H，dd，J=17.3和1.1 Hz，H-14)，5.13(2H，dd，J=14.2和1.1 Hz，H-15)，4.78(1H，d，J=1.2 Hz，H-17)，4.36(1H，d，J=1.2 Hz，H-17)，2.20(2H，ddd，J=12.9 Hz，8.5 Hz，H-7)，1.80(1H，dd，J=12.5 Hz，H-5)，1.54(2H，m，H-1)，1.67(2H，m，H-2)，1.79(2H，m，H-3)，1.39(2H，dddd，J=12.9 Hz，H-6)，1.66(1H，m，H-9)，1.39(2H，m，H-11)，1.54(2H，m，H-12)，1.27(1H，s，H-16)，1.13(1H，s，H-18)，0.94(1H，s，H-20)；13C NMR(151MHz，DMSO-d6)δ：38.6(C，C-1)，18.4(C，C-2)，41.2(C，C-3)，47.4(C，C-4)，51.2(C，C-5)，27.6(C，C-6)，38.7(C，C-7)，146.3(C，C-8)，57.5(C，C-9)，38.7(C，C-10)，17.4(C，C-11)，41.2(C，C-12)，71.7(C，C-13)，144.7(C，C-14)，110.7(C，C-15)，27.6(C，C-16)，108.9(C，C-17)，17.4(C，C-18)，180.0(C，C-19)，16.6(C，C-20)。該化合物的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道[22]的4-epi-Cupressic acid(20-環(huán)氧基-13-羥基-異丁烯-14-烯-18-辛酸)基本一致，分子量為320，分子式為C20H32O3，化合物HXW-8的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖9。

化合物HXW-12，白色無定形粉末，1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.84(1H，d，J=2.1 Hz，H-4)，6.80(1H，d，J=2.1 Hz，H-5)，2.29 (3H，s，H-7)，3.91(3H，s，OCH3)；13C NMR(151 MHz，DMCO-d6)δ：183.0(C-2)，136.4(C-3)，147.3(C-4)，103.2(C-5)，155.4(C-6)，26.8(C-7)，59.1(OCH3)。該化合物的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道[23]的對葉百部吡喃酮A基本一致，分子量為131，分子式為C7H8O3，化合物HXW-12化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖10。

2.6 化合物生物活性測定

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法測定抗菌活性，具體見“1.3.4”項，結(jié)果見圖11，化合物HXW-3對蠟樣芽胞桿菌，鼠傷寒沙門菌和嗜水氣單胞菌顯示出抑制活性。

3 討論

本研究將9株鐵皮石斛內(nèi)生真菌鑒定為3個屬，包括枝頂孢霉屬、樹粉孢屬和Acremoniopsis屬；其中樹粉孢屬和Acremoniopsis屬是兩個未曾報道過的石斛內(nèi)生真菌屬種，并初步確定了枝頂孢霉屬的一個潛在新種，以及樹粉孢屬的一個潛在新種，研究結(jié)果豐富了鐵皮石斛內(nèi)生真菌的物種資源。

病原指示菌和人乳腺癌MCF-7抑制活性測定結(jié)果顯示，在供試的9株鐵皮石斛內(nèi)生真菌中，7株菌表現(xiàn)出對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞具有明顯的抑制作用，有7株菌至少抑制一種病原指示菌。對篩選獲得的，具有較好抗菌和細(xì)胞毒活性的菌株205509開展了次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)研究，共分離得到4個化合物，HXW-1、HXW-3、HXW-8和HXW-12，分別為麥角甾醇，acrepyrone A，4-epi-Cupressic acid和對葉百部吡喃酮A。其中麥角甾醇曾從真菌Omphalia lapidescens培養(yǎng)液中分離得到[23]；acrepyrone A曾從真菌Acremonium citrinumSS-g13培養(yǎng)液中被分離得到[24]，文獻(xiàn)對該化合物進(jìn)行了A549、MDA-MB-231和Hct116的細(xì)胞毒活性測試，以及對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌開展了抑菌活性檢測，均未檢測到相關(guān)活性；4-epi-Cupressic acid是從番荔枝科植物葉中分離得到的，文獻(xiàn)[22]中評估了該化合物針對K562細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性，其IC50值為17.20 μmol/L，但并未報道其抑菌活性；對葉百部吡喃酮A最先是從對葉百部Stemona tuberosaLour根中分離出來的一個新的吡喃酮化合物[23]，并無相關(guān)活性的報道。在本研究中，發(fā)現(xiàn)化合物HXW-3 (acrepyrone A)在濃度為3 μg/mL時對嗜水氣單胞菌、鼠傷寒沙門菌和蠟樣芽胞桿菌表現(xiàn)出了抑制活性，之前未曾報道過該化合物對這些菌株的抑制活性。以上初步研究為進(jìn)一步對從鐵皮石斛內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)具有藥理作用的化合物奠定了菌株基礎(chǔ)。