任建委，任明輝

（西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西藏拉薩 850000）

放線菌是一類能夠產(chǎn)生抗生素、抗腫瘤活性物質(zhì)、免疫調(diào)節(jié)劑和酶抑制劑等多種活性物質(zhì)，具有較高經(jīng)濟(jì)價值的一類原核細(xì)胞微生物[1-2]。目前，國內(nèi)外研究人員對放線菌的開發(fā)與研究主要集中在放線菌的極端生境[3-5]。我國青藏高原地區(qū)被稱為“世界屋脊”“世界第三極”，具有海拔高、空氣稀薄、太陽輻射強等特點，放線菌資源比較豐富[6]，而且還存在一些未知的放線菌，非常值得展開青藏高原放線菌的研究。本研究對采自青藏高原拉薩地區(qū)羅布林卡公園的3 份土壤樣品進(jìn)行分離，探討了土壤預(yù)處理不同溫度對土壤放線菌分離的影響。

1 放線菌分離影響因素分析

放線菌分離過程中需要注意的問題是，在放線菌分離過程中既要保證抑制雜菌（細(xì)菌、真菌等）的生長，同時又不影響放線菌的生長。為了提高放線菌的分離率，許多學(xué)者對多種相關(guān)因素進(jìn)行研究，包括土壤預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、雜菌抑制劑等。

1.1 土壤預(yù)處理

土壤預(yù)處理是影響放線菌分離效率至關(guān)重要的一個步驟，適當(dāng)?shù)耐寥李A(yù)處理可以激活放線菌孢子的萌發(fā)及提高放線菌的檢出率。常用的土壤預(yù)處理方法包括風(fēng)干與加熱處理、超聲波處理和制作土壤稀釋液時的試劑處理等。何建清等[7]以土樣風(fēng)干，120℃干熱1h，制作土壤稀釋液后又加入0.05%SDS，40℃懸浮0.5h后涂布分離為土壤預(yù)處理方式得到放線菌。盛海彥等[8]用控制變量法對土壤預(yù)處理的條件（溫度、SDS、酵母膏）進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)在120℃處理1h、土壤懸浮液中加入SDS 0.5g/kg、6%酵母膏并于40℃常溫振蕩0.5h的條件下分離的放線菌數(shù)量最多，并有效抑制了細(xì)菌的生長。田華等[9]將樣品自然風(fēng)干0、2、4、6、8d，發(fā)現(xiàn)將土壤樣品風(fēng)干放置6d 前的時間里，分離的放線菌數(shù)目隨風(fēng)干天數(shù)增加，在一定程度上說明通過適當(dāng)風(fēng)干時間，有利于土壤中放線菌的活化；將土壤稀釋液分別進(jìn)行40℃、50℃、60℃、70℃加熱處理20min，發(fā)現(xiàn)以50℃為分界點，放線菌的數(shù)目也會隨著溫度升高而增加或減少，在某種程度上說明，適當(dāng)?shù)臏囟忍幚碛欣诜啪€菌的活化。毛寧等[10]對采集的土壤樣品分別進(jìn)行0s、20s、50s、100s 的超聲波處理，發(fā)現(xiàn)放線菌的種類和數(shù)量均不同，說明通過適當(dāng)時間的超聲波處理，有利于增加需分離的土壤放線菌的數(shù)量和種類。閆建芳等[11]分別用不同濃度的SDS 溶液（0.01%、0.05%、0.10%、0.20%）稀釋風(fēng)干土壤樣品涂布于高氏培養(yǎng)基后觀察放線菌數(shù)量，發(fā)現(xiàn)0.05%SDS 溶液稀釋的土壤樣品能有效分離土壤中黃瓜枯萎病菌的拮抗放線菌。茹祥等[12]采用了3 種預(yù)處理方法，其中放線菌出菌率最高的方法是向土壤稀釋液中加入1‰螯合樹脂—膽酸鈉溶液并用50W 超聲波水浴60s，得到稀釋液；另取土樣以磷酸鹽緩沖液為稀釋液，振蕩15min 后，將兩者混合，進(jìn)行涂布后培養(yǎng)得到放線菌的菌落數(shù)是最多的。來航線等[13]分離鹽堿土中的放線菌時，用20g/kg 腐殖酸溶液浸泡土壤，于40℃下振蕩20 min，結(jié)果可提高放線菌的出菌率并抑制了雜菌生長。

1.2 培養(yǎng)基成分

培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分對微生物生長至關(guān)重要。一種培養(yǎng)基中所含營養(yǎng)物質(zhì)不可能滿足所有放線菌的生長要求，所以試驗者可根據(jù)目的改變培養(yǎng)基的成分，從而分離出相關(guān)目的放線菌菌株。閆建芳等[11]利用7 種培養(yǎng)基對瓜類枯萎病菌拮抗放線菌進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)高氏一號培養(yǎng)基、淀粉瓊脂培養(yǎng)基和HVG 培養(yǎng)基對拮抗放線菌的分離效果較好，聯(lián)合培養(yǎng)能夠盡可能多地分離放線菌。茹祥等[12]利用高氏一號培養(yǎng)基、BN 培養(yǎng)基、葡萄糖-天冬門素培養(yǎng)基和腐殖酸培養(yǎng)基，結(jié)果表明，BN 培養(yǎng)基在分離放線菌的種類和數(shù)量上比其他3種培養(yǎng)基的分離效果好。周娟等[14]采用9 種培養(yǎng)基對分離的土樣進(jìn)行放線菌分離，LNMS 培養(yǎng)基培養(yǎng)的放線菌數(shù)量最多，燕麥瓊脂培養(yǎng)基分離種類最多，但由于培養(yǎng)基成分種類和比例不同，分離出放線菌數(shù)量和種類是不同的。李菲等[15]從紅樹林土壤中共分離到444株放線菌，其中3 株放線菌為潛在新種。在酶活性方面，至少有1 種酶活性的放線菌共56 株，2 種酶活性的放線菌共31 株，蘊藏著新的且功能酶活性顯著，具有較大的挖掘潛力。

1.3 雜菌抑制劑

雜菌抑制劑在分離放線菌過程中，主要作用是排除雜菌如細(xì)菌、真菌及其他非目的放線菌等微生物，不影響目的放線菌的分離。在分離放線菌時，向培養(yǎng)基中加入一定量的抑制劑，會抑制細(xì)菌和真菌的數(shù)量，減少放線菌分離時兩者的干擾，進(jìn)而有效提高放線菌檢出率。因此，有效抑制細(xì)菌和真菌的生長是放線菌分離雜菌抑制方面需要解決的重要問題。閆建芳等[11]以重鉻酸鉀（K2CrO2）、放線菌酮、鏈霉素、青霉素和氟哌酸等作為雜菌抑制劑，發(fā)現(xiàn)1μg/mL 青霉素、40μg/mL氟哌酸、75μg/mL K2CrO2適合作為土壤放線菌分離的雜菌抑制劑，其中以1μg/mL 青霉素效果最明顯。司美茹等[16]在培養(yǎng)基中加入化學(xué)抑制劑（75μg/mL K2CrO2+2μg/mL 青霉素），培養(yǎng)基中細(xì)菌數(shù)量明顯減少，但不影響放線菌種類和數(shù)量；若化學(xué)抑制劑和土樣加熱雙重處理，細(xì)菌數(shù)量比單純使用分離方法明顯減少，放線菌的數(shù)量和種類比單純使用化學(xué)抑制劑明顯增加。安德榮等[17]向高氏一號培養(yǎng)基中加入4 種（放線菌酮、制霉素、多菌靈、K2CrO2）化學(xué)抑制劑，發(fā)現(xiàn)放線菌酮和K2CrO2是理想的放線菌分離抑制劑，既可以作為土壤中細(xì)菌和真菌的抑制劑，又不會影響放線菌的正常生長。

2 放線菌分離的材料與方法

2.1 試驗材料

采用五點取樣法取土壤樣品3 份，樣品來源于羅布林卡公園5～20cm 深土層。將3 份土壤分別過2 層醫(yī)用紗布。

2.2 土壤預(yù)處理

將土壤樣品分為2 份，一份做常溫風(fēng)干處理；一份做65℃烘干處理。

2.3 培養(yǎng)基使用

本試驗分離放線菌采用2 種培養(yǎng)基，即高氏一號瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。高氏一號瓊脂培養(yǎng)基成品、PDA 成品，按照說明書配制培養(yǎng)基，121℃滅菌20min。

2.4 土壤稀釋液制備及純種分離

稱取1g 土壤加入到10mL 滅菌的無菌水中，震蕩10min，獲得土壤懸液為10%濃度的土壤稀釋液。向裝有9mL 無菌水的試管里加入上述稀釋液1mL，需用移液管吸取，搖勻，制成1%濃度的土壤稀釋液。按照1∶10 的比例，依次稀釋至0.1%濃度梯度的土壤稀釋液。整個稀釋過程都在超凈工作臺中進(jìn)行。在土壤稀釋過程中，發(fā)現(xiàn)即便土壤經(jīng)過過篩后，試管下仍沉積很多類似于沙子的不溶物。因曾做過預(yù)試驗，發(fā)現(xiàn)至0.1%土壤稀釋濃度已經(jīng)很少有放線菌存在。所以本試驗只稀釋到0.1%土壤稀釋度。

完成等濃度梯度稀釋土壤稀釋液的制備之后，配制高氏一號培養(yǎng)基，121℃15 min，待其冷卻至55～60℃時，倒平板。待凝固以后，用移液槍分別吸取等量的濃度為10%、1%、0.1%的土壤稀釋液于無菌平板上，最后用燒灼后的無菌玻璃涂布器分別均勻涂布，并且在平板上做標(biāo)記。靜置20min 左右后將平板倒置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d。每個稀釋梯度重復(fù)2 次。

2.5 放線菌分離結(jié)果

以65℃溫度處理、3 號土壤為例，采用土壤濃度稀釋法，用高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌，分離結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，在培養(yǎng)皿中長有細(xì)菌菌落，在其他的培養(yǎng)皿中還長有真菌，對放線菌菌落大概數(shù)目做初步統(tǒng)計見表1。

圖1 經(jīng)65℃預(yù)處理的3 號土壤

表1 放線菌菌落的數(shù)目約數(shù) 單位：個/mL

2.6 放線菌培養(yǎng)特性及染色

圖3 部分放線菌培養(yǎng)插片法

圖4 部分放線菌插片法后的染色情況

放線菌制片染色方法包括印片法和插片法，前者主要觀察放線菌孢子絲的形態(tài)、孢子的排列及其形狀等，但形態(tài)特征可能有所改變（使用的是石炭酸復(fù)紅染液）；后者可觀察到放線菌自然生長狀態(tài)下的特征和不同生長期的形態(tài)，也是放線菌染色常用的方法。本次放線菌初步培養(yǎng)鑒定使用的是插片法，具體步驟如下：①接種。采用無菌接種法接種挑取放線菌，在高氏一號培養(yǎng)基約一半面積上密集劃線接種。②插片。無菌操作法用鑷子取無菌蓋玻片，在劃線接種區(qū)內(nèi)45°角插入平板瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，另一半未劃線的區(qū)域也以同樣的方式插入數(shù)塊蓋玻片。③培養(yǎng)。平板倒置28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5d。④鏡檢。取蓋玻片，用紙擦去背面培養(yǎng)物，菌面向上放載玻片上，滴0.1%堿性美蘭染液。

3 討論

采樣時，用五點取樣法在同一地方采集3 份土壤，不同份數(shù)土壤中，統(tǒng)計放線菌菌落數(shù)的大概數(shù)目并不相同，并且有些形成的菌落顏色也不相同，這可能是在取土壤樣品時，附近生長的植物不同。

溶解土壤時，發(fā)現(xiàn)土壤的沙化，即便用2 層醫(yī)用紗布篩過后，仍有大部分土壤無法溶解并沉在試管底部，這樣每克土壤樣品中含有放線菌的數(shù)量減少，所以用稀釋涂布平板法培養(yǎng)放線菌時，土壤稀釋濃度（10%、1%、0.1%）與普通土壤稀釋度（0.1%、0.01%、0.001%）不同。

使用高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌時，培養(yǎng)基中會有細(xì)菌菌落和霉菌菌落，需要添加真菌抑制劑和細(xì)菌抑制劑來抑制除放線菌以外的其他雜菌的生長。