盧覃培 劉少偉 胡辛欣 游學甫 孫承航,,*

(1 中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，微生物化學研究室，北京 100050；2 廣西醫(yī)科大學藥學院，廣西生物活性分子研究與評價重點實驗室，南寧 530021；3 中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，抗感染藥物研究北京市重點實驗室，北京 100050)

自青霉素和鏈霉素被用于臨床以來，抗生素對感染性疾病的治療和人類壽命的延長起到至關(guān)重要的作用。而放線菌是抗生素重要來源，今天使用的大多數(shù)抗生素仍是由放線菌產(chǎn)生，其中又有約75%是由鏈霉菌產(chǎn)生[1-2]。這些抗生素涵蓋了目前臨床上使用的幾乎所有重要藥物類別，如四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、糖肽類等[2]。幾十年來，由于對普通生境較易分離到的放線菌資源進行反復篩選與挖掘，導致目前從普通生境中發(fā)現(xiàn)新抗生素的幾率大大降低，因此，抗生素發(fā)現(xiàn)的重點逐漸轉(zhuǎn)向了以往難以到達或很少被探索的特殊生態(tài)環(huán)境(簡稱特境)如沙漠、深海、極地等，以期從棲息在這些特境的放線菌中找到具有重要生物活性的新型次級代謝產(chǎn)物。

沙漠具有日照持久、高溫干旱、蒸發(fā)強烈、紫外線輻射強、寡營養(yǎng)等特征，作為典型的特境，已成為抗生素研發(fā)的一個熱點，十幾年來，成果不斷，如從南美洲阿塔卡馬沙漠來源鏈霉菌中分離得到了具有顯著抗菌活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物chaxalactins A～C和安莎霉素類化合物chaxamycins A～D；從撒哈拉沙漠土壤鏈霉菌中分離得到具有羥肟酸結(jié)構(gòu)的化合物2-amino-N-(2-amino-3-phenylpropanoyl)-N-hydroxy-3-phenylpropanamide，該化合物對革蘭陽性菌和陰性菌、絲狀真菌等均表現(xiàn)出一定的抗菌活性等[3-8]。

塔克拉瑪干沙漠位于我國新疆南部塔里木盆地中心，是我國最大的沙漠，同時亦是世界第二大流動沙漠，本課題組對其進行了一系列的放線菌資源勘探、抗菌活性篩選、活性物質(zhì)分離與鑒定等研究工作，已發(fā)現(xiàn)了一系列有藥用價值的菌株及其活性化合物[9-18]。為進一步探索塔克拉瑪干沙漠來源產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)，本文對一株塔克拉瑪干沙漠土壤來源鏈霉菌Streptomycessp.90產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物進行研究，共分離得到6個化合物，通過波譜學方法對化合物進行了結(jié)構(gòu)解析，分別鑒定為collismycin A(1)、collismycin B(2)、pyrisulfoxin A(3)、SF2738C(4)、SF2738D(5)和SF2738F(6)(圖1)，并對其中主要活性化合物1的抗菌活性和穩(wěn)定性進行考察。

圖1 化合物1～6的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of compounds 1～6

1 材料與方法

1.1 儀器、材料及試劑

超凈工作臺(YT-CJ-1ND，北京亞泰科隆儀器有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(SQ810C，雅馬拓科技貿(mào)易(上海)有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(ZDP-2120)及搖床(ZHWY-211C，上海智城分析儀器制造公司)；離心機(Centrifuge 1-14、K-14、4-16KS，德國Sigma公司)；PCR擴增儀(Veriti 96 well Thermal Cycler,美國Thermofisher)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1100，東京理化器械株式會社)；電子天平(YP5002，上海越平科學儀器有限公司)；電子分析天平(BT 124S，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；十萬分之一電子分析天平(AB265-S，瑞士Mettler Toledo)；液相(LC-20AT)及液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LCMS-2020，島津企業(yè)管理(中國)有限公司)；核磁共振儀[Bruker AV Ⅲ-600 NMR instrument，布魯克(北京)科技有限公司]；快速制備液相色譜[Biotage Isolera One，拜泰齊貿(mào)易(上海)有限公司]；多點接種器(MIT-P，日本東京佐久間公司)。

培養(yǎng)基原料及瓊脂(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)；合成培養(yǎng)基(美國BD公司)；PCR試劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；Chelex-100樹脂(美國Bio-Rad公司)；中壓制備柱[Yamazen Ultra Pack Columns(26 mm×300 mm,5 μm)，日本山善株式會社]；半制備柱[Agilent ZORBAX SB-C18column(9.4 mm×250 mm,5 μm，安捷倫科技(中國)有限公司]；分析柱[Agilent ZORBAX SB-C18column(4.6 mm×150 mm,5 μm，安捷倫科技(中國)有限公司]。

色譜純甲醇和乙腈(迪馬科技有限公司)；其余分析純試劑如無水乙醇、乙酸乙酯和甲醇等試劑均為北京市通廣精細化工公司。

1.2 菌株來源

鏈霉菌Streptomycessp.90(Genbank No.MT705175) 分離自塔克拉瑪干沙漠阿和公路沿線土壤樣品，菌株保存于中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所微生物化學室。

活性測試的檢定菌由抗感染藥物研究北京市重點實驗室提供，詳細信息見表1；所有檢定菌均保存于中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所抗感染藥物研究北京市重點實驗室。

1.3 培養(yǎng)基

純化培養(yǎng)基為ISP2 固體培養(yǎng)基(葡萄糖4.0 g，酵母浸粉4.0 g，麥芽浸粉10.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2～7.4)；發(fā)酵培養(yǎng)基為ISP2液體培養(yǎng)基；活性測試檢定菌的培養(yǎng)基為Mueller-Hinton(MH)培養(yǎng)基。

1.4 菌株發(fā)酵

凍存的菌株Streptomycessp.90接種于ISP2純化培養(yǎng)基，28℃下恒溫培養(yǎng)7～10 d，用無菌竹簽刮取少量新鮮菌體接種于含100 mL ISP2液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在28℃，180 r/min條件下培養(yǎng)2 d左右，形成種子液，轉(zhuǎn)接于含1 L ISP2液體培養(yǎng)基的5 L錐形瓶中繼續(xù)發(fā)酵5～7 d即可收獲，共收集發(fā)酵液18 L。

1.5 提取與分離

將發(fā)酵完成的發(fā)酵液4300 r/min離心20 min后，取上清液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮至干，共得到有機萃取物2.3 g。萃取物用中壓制備液相色譜分離，甲醇-水梯度洗脫(10:90,30:70,50:50,70:30,90:10,100:0,V/V)，經(jīng)活性檢測和LCMS-2020分析后合并，共得到6個餾分(Fr.90a1～Fr.90a6)；活性餾分Fr.90a3進行凝膠LH-20色譜柱分離，甲醇洗脫，得到41個餾分，再通過活性和LCMS-2020檢測合并得到活性餾分(Fr.90a3a,Fr.90a3e～h)，餾分Fr.90a3f、Fr.90a3g、Fr.90a3h通過高壓液相制備，65%甲醇等度洗脫制備，累積得到化合物1(3.0 mg)和2(1.3 mg)；餾分Fr.90a3e通過制備液相，65%甲醇等度洗脫，制備得到化合物3(1.6 mg)。另外，對餾分Fr.90a4，以相同的分離方法得到化合物4(1.8 mg),5(1.3 mg)和6(1.4 mg)。

1.6 抗菌活性測試

1.6.1 活性跟蹤測試

參照文獻[16]，采用瓊脂-紙片擴散法，以碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌為檢定菌，37℃靜置培養(yǎng)12～24 h，觀察和測量抑菌圈，開展次級代謝產(chǎn)物活性追蹤。

1.6.2 化合物1的MIC測定

參照CLSI指南[19]，用瓊脂二倍稀釋法測定化合物1的抗菌活性。陽性對照藥物為左氧氟沙星，化合物1分別溶于DMSO中，隨后用冷卻至50℃左右的MH培養(yǎng)基梯度稀釋，制備成含待測化合物的瓊脂平板?；衔?的終濃度為0.125～128 μg/mL。檢測菌株在MH肉湯中靜置培養(yǎng)24 h，然后稀釋到約108CFU/mL，隨之再稀釋100倍，制備成106CFU/mL的菌懸液，備用。用MIT-P多點接種儀(37個接種針)將待測菌懸液接種至制備好的瓊脂平板上，37℃孵育18 h后觀察結(jié)果，無菌生長的平皿中所含藥物的最小濃度即為最低抑菌濃度(MIC)。

1.7 化合物穩(wěn)定性考察

化合物1用甲醇溶解后，在光照，22℃恒溫的環(huán)境中，采用LC-MS監(jiān)測在不同時間段下，考察光照對化合物1穩(wěn)定性的影響；此外，采用錫紙包住化合物1液，隔絕光照的條件下，置于恒溫28℃培養(yǎng)箱中，采用LC-MS監(jiān)測在不同時間段下，考察溫度對化合物1穩(wěn)定性的影響。分析條件：分析柱，53%甲醇等度洗脫，檢測波長：240 nm，流速：1.0 mL/min。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定形粉末，溶于氯仿、二氯甲烷和甲醇；ESI-MSm/z276[M+H]+；1H NMR(600 MHz,CD3OD) δH: 8.02(s,H-3),8.94(s,H-7),4.11(s,H3-8),2.39(s,H3-9),8.54(d,J=7.8 Hz,H-3'),7.92(td,J=7.2,1.8 Hz,H-4'),7.46(dd,J=7.2,4.8 Hz,H-5'),8.65(d,J= 4.8 Hz,H-6');13C NMR(150 MHz,CD3OD) δC: 158.3(C-2),104.9(C-3),168.9(C-4),123.5(C-5),154.1(C-6),148.8(C-7),56.9(C-8),18.3(C-9),156.6(C-2'),123.4(C-3'),138.7(C-4'),125.8(C-5'),150.0(C-6')。經(jīng)查閱文獻，該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的collismycin A(SF2738A)[20-21]一致，故鑒定化合物1為collismycin A(SF2738A)。

化合物2：白色無定形粉末，溶于氯仿、二氯甲烷和甲醇；ESI-MSm/z276[M+H]+，提示該化合物可能為化合物1異構(gòu)體；1H NMR(600 MHz,CDCl3)δH: 8.16(s,H-3),8.70(s,H-7),4.17(s,H3-8),2.42(s,H3-9),8.13(d,J=7.8 Hz,H-3'),7.89(td,J=7.2,1.2 Hz,H-4'),7.40(m,H-5'),8.72(d,J=4.2,1.8 Hz,H-6');13C NMR(150 MHz,CDCl3) δC: 156.9(C-2),104.9(C-3),168.2(C-4),121.1(C-5),140.2(C-7),56.7(C-8),18.4(C-9),121.1(C-3'),137.5(C-4'),124.9(C-5'),149.4(C-6'),C-6和C-2',無明顯信號。經(jīng)查閱文獻，該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的collismycin B(SF2738B)[20-21]一致，故鑒定化合物2為collismycin B(SF2738B)。

化合物3：白色無定形粉末，溶于氯仿、二氯甲烷和甲醇；ESI-MSm/z292[M+H]+；1H NMR(600 MHz,CDCl3) δH: 8.11(s,H-3),8.87(br s,H-7),4.14(s,H3-8),3.07(s,H3-9),8.50(br s,H-3'),7.86(t,J=7.8 Hz,H-4'),7.34(t,J=6.0 Hz,H-5'),8.65(br s,H-6');13C NMR(150 MHz,CDCl3) δC: 159.8(C-2),104.5(C-3),165.8(C-4),150.8(C-6),147.6(C-7),56.8(C-8),39.4(C-9),154.4(C-2'),122.2(C-3'),137.4(C-4'),125.1(C-5'),149.2(C-6'),C-5,無明顯信號。經(jīng)查閱文獻，該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的pyrisulfoxin A[22]一致，故鑒定化合物3為pyrisulfoxin A。

化合物4：白色無定形粉末，溶于氯仿、二氯甲烷和甲醇；ESI-MS:m/z263[M+H]+；1H NMR(600 MHz,CDCl3) δH: 7.99(s,H-3),4.95(s,H2-7),4.12(s,H3-8),2.36(s,H3-9),8.42(d,J=7.8 Hz,H-3'),7.84(t,J=7.8 Hz,H-4'),7.34(dd,J=7.8,4.8 Hz,H-5'),8.66(d,J=4.8 Hz,H-6');13C NMR(150 MHz,CDCl3) δC: 160.6(C-2),102.9(C-3),167.4(C-4),117.8(C-5),155.0(C-6),62.7(C-7),56.5(C-8),17.6(C-9),155.5(C-2'),121.3(C-3'),137.2(C-4'),124.4(C-5'),149.3(C-6')。經(jīng)查閱文獻，該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的SF2738C[21]一致，故鑒定該化合物為SF2738C。

化合物5：白色無定形粉末，溶于氯仿、二氯甲烷和甲醇；ESI-MSm/z258[M+H]+；1H NMR(600 MHz,CDCl3) δH: 8.19(s,H-3),4.14(s,H3-8),2.54(s,H3-9),8.47(d,J=7.8 Hz,H-3'),7.85(td,J=7.8,1.8 Hz,H-4'),7.37(dd,J=7.8,6.0 Hz,H-5'),8.66(d,J=4.8 Hz,H-6');13C NMR(150 MHz,CDCl3) δC:158.6(C-2),105.8(C-3),167.1(C-4),127.4(C-5),137.4(C-6),116.6(C-7),56.8(C-8),18.1(C-9),153.9(C-2'),121.9(C-3'),137.4(C-4'),125.0(C-5'),149.2(C-6')。經(jīng)查閱文獻，該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的SF2738D[21]一致，故鑒定該化合物為SF2738D。

化合物6：白色無定形粉末，溶于氯仿、二氯甲烷和甲醇；ESI-MSm/z244[M+H]+；1H NMR(600 MHz,CDCl3) δH: 8.10(s,H-3),9.13(s,H-7),4.14(s,H3-8),8.56(d,J=7.8 Hz,H-3'),7.88(t,J=7.8 Hz,H-4'),7.38(br s,H-5'),8.72(br s,H-6');13C NMR(150 MHz,CDCl3) δC: 159.0(C-2),99.7(C-3),160.4(C-4),136.4(C-5),154.1(C-6),156.2(C-7),56.2(C-8),155.5(C-2'),121.6(C-3'),137.1(C-4'),124.3(C-5'),149.0(C-6')。經(jīng)查閱文獻，發(fā)現(xiàn)該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的SF2738F[21]一致，故鑒定該化合物為SF2738F。

2.2 化合物生物活性測試

采用紙片瓊脂擴散法測試，發(fā)現(xiàn)化合物1具有較為明顯的抑菌圈，因此，采用瓊脂稀釋法測定化合物1對37株常見的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的抗菌活性。結(jié)果如表1所示，化合物1 對甲氧林敏感和耐藥的表皮葡萄球菌均表現(xiàn)出較明顯的抑制作用，MIC值在8～16 μg/mL之間；對某些甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌活性表現(xiàn)出一定抑制作用，MIC在32～64 μg/mL；此外，化合物1對革蘭陰性菌表現(xiàn)出一定的抑制作用，對碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌的MIC值為64 μg/mL，對銅綠假單胞菌的MIC值為64～128 μg/mL。

2.3 化合物穩(wěn)定性考察

在分離過程中發(fā)現(xiàn)化合物1較不穩(wěn)定，因此，研究者對化合物1的穩(wěn)定性進行考察。首先考察光照條件下，不同時間，化合物1的穩(wěn)定性。如圖2所示，在光照條件下，1 h后，化合物1會部分轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?，說明化合物1對光照不穩(wěn)定。其次，研究者還考察了溫度對化合物1穩(wěn)定性的影響。結(jié)果如圖3所示，在隔絕光照、恒溫28℃環(huán)境下，化合物1溶液放置72 h，沒有發(fā)生變化，說明化合物1隔絕光照在28℃下穩(wěn)定性良好。

圖2 光照對化合物1穩(wěn)定性的影響Fig.2 The effect of light on the stability of compound 1

圖3 溫度(28℃)對化合物1穩(wěn)定性的影響Fig.3 The effect of temperature(28℃) on the stability of compound 1

3 討論與結(jié)論

本文對塔克拉瑪干沙漠來源鏈霉菌Streptomycessp.90的次級代謝產(chǎn)物進行了研究，共分離得到6個化合物，化合物1～6均屬于聯(lián)吡啶類化合物，除了化合物3是1999年報道外，其余化合物均在1993年報道過[21]，其中1具有弱抗細菌和抗真菌活性，而2顯示出比1更弱的抗菌活性，4～6沒有抗菌活性，這和本文實驗結(jié)果相吻合；此外，化合物1和2有良好的抗腫瘤作用，而且1在腹腔注射給藥劑量為100 mg/kg時，并沒有顯示出急性毒性。在文獻中，化合物3僅報道了其具有抗腫瘤作用，而未見其抗菌活性相關(guān)報道[22]。文獻檢索發(fā)現(xiàn)，這類聯(lián)吡啶化合物的抗菌作用機制還尚未報道。

化合物1和2是C=N雙鍵的順反異構(gòu)體，分析它們的抗菌活性構(gòu)效關(guān)系，化合物1活性強于化合物2，說明肟基的順反異構(gòu)對活性影響較大。穩(wěn)定性方面，化合物1在光照條件下會逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?，這與之前文獻報道的聯(lián)吡啶類化合物在光照條件下不穩(wěn)定是一致的[23]，原因可能為肟基雙鍵上的羥基通過順反異構(gòu)，可與旁邊的N原子形成分子內(nèi)氫鍵。此外，有報道稱化合物1還可以通過與地塞米松-糖皮質(zhì)激素受體的結(jié)合而發(fā)揮抗炎作用[20]；這類化合物還報道了具有氧化應激抑制作用而成為神經(jīng)保護劑，并已申請了專利[24]；某些聯(lián)吡啶類化合物雖然沒有抑菌活性，但具有抑制細菌群體感應活性[23]，說明這類化合物具有作為新型抑菌劑的潛力。

本研究是筆者長期對塔克拉瑪干沙漠藥用資源微生物勘探的結(jié)果之一，盡管化合物1抗革蘭陰性菌的活性總體較弱，但其對碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌的MIC值為64 μg/mL為首次報道。如果進一步開展結(jié)構(gòu)修飾，有望在化合物1的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，獲得具有更強抗碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌的化合物。前期本課題組從塔克拉瑪干沙漠來源微生物中還發(fā)現(xiàn)了玄奘米星及和田霉素系列新抗生素，和田霉素系列新抗生素[25-28]是沙漠來源芽胞桿菌產(chǎn)生的，體外對耐藥金黃色葡萄球菌具有強活性的異香豆素類抗生素。玄奘米星是體內(nèi)外對耐萬古霉素糞腸球菌活性極強的硫肽類抗生素，它也是首個含4糖單元，目前分子量最大的硫肽類抗生素。結(jié)合本論文發(fā)現(xiàn)的系列聯(lián)吡啶類化合物的研究結(jié)果，預示塔克拉瑪干沙漠特境是開展新抗生素研發(fā)的理想特境。