楊賽賽，吳慶華，陳 心，史惠蓉，任淑敏，焦智慧，翟儀穩(wěn)

鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦產醫(yī)學部遺傳與產前診斷中心 鄭州 450052

腎臟多發(fā)囊腫、肝臟囊腫及全內臟反位等是一組涉及多系統(tǒng)的纖毛疾病的較為常見的表現[1]。纖毛是從大多數哺乳動物細胞表面伸出的毛狀結構，為細胞表面細胞器，被連續(xù)的細胞膜包裹，中心有一微管軸絲。真核細胞纖毛和鞭毛的組裝通過鞭毛內轉運(intraflagellar transport,IFT)過程完成。纖毛裝配缺陷或纖毛信號傳導障礙均可導致纖毛相關疾病。該類疾病臨床表型變異廣泛并具有遺傳異質性，幾乎影響機體的每一個系統(tǒng)，如腦、眼、肝臟、腎臟、骨骼、生殖系統(tǒng)以及內臟左右對稱發(fā)育等[2]，多為人類發(fā)育性或退行性相關疾病?；蛟\斷是明確其遺傳學病因的最精準方法。本研究采用全外顯子組測序的方法對一例包括腎臟與肝臟多發(fā)囊腫、全內臟反位、腎功能不全、右側精囊缺如及甲狀腺功能不全等為主要特征的患者行基因篩查及家系分析，為深入了解該罕見疾病的臨床表型及病因學，以及為該家庭遺傳咨詢和生育相關指導提供了明確的遺傳學依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象先證者，男，15歲，因“乏力1個月，發(fā)現腎功能異常3 d”就診。入院后完善相關檢查。血液學檢查示：尿素21.2 mmol/L(正常值2.2～8.2 mmol/L)，肌酐714 μmol/L(正常值20～115 μmol/L)，胱抑素C 3.78 mg/L(正常值0.40～1.55 mg/L)，β2微球蛋白18.13 mg/L(正常值0.00～3.00 mg/L)，α1微球蛋白74 mg/L(正常值10～30 mg/L)，總蛋白48.3 g/L(正常值60.0～85.0 g/L)，球蛋白11.9 g/L(正常值20.0～35.0 g/L)，紅細胞計數2.64×109個/L(正常值4.30×109～5.80×109個/L)，血紅蛋白83.0 g/L(正常值130.0～175.0 g/L)，降鈣素原0.20 ng/L(正常值0.00～0.06 ng/L)，甲狀旁腺素138.94 ng/L(正常值4.09～17.71 ng/L)，N末端B型利鈉肽原200.56 ng/L(正常值0.00～34.06 ng/L)。尿潛血(+)，尿蛋白(+)，尿葡萄糖(±)。超聲檢查提示右位心，內臟反位，肝囊腫，雙腎彌漫性回聲改變并雙腎囊腫。64層CT平掃結果(圖1)顯示鏡面右位心，心臟增大、心包腔少量積液；雙側胸腔少量積液，雙肺下葉慢性炎癥；肝、膽、脾、胃反位，肝臟、雙腎多發(fā)囊腫，右側精囊缺如。心電圖示：部分導聯ST段改變。先證者父母及弟弟身體健康，家族中無遺傳病史。該家系經遺傳咨詢后，要求行遺傳學檢查并簽署知情同意書。

A：鏡面右位心(心尖朝右)；B：肝、膽、脾、胃反位；C：肝臟多發(fā)囊腫；D：雙腎多發(fā)囊腫；E：右側精囊缺如

1.2 遺傳學檢查

1.2.1DNA提取 采集先證者及家系其他成員的外周血各2 mL，采用北京天根公司的DNA提取試劑盒提取基因組DNA(gDNA)，采用Qubit 2.0熒光計(Termo Fisher Scientifc公司,美國)對DNA樣本進行定量。

1.2.2全外顯子組測序 應用Illumina DNA Flex LPK Enrichment文庫制備和富集試劑盒對片段化的gDNA進行文庫構建，然后采用Illumina NovaSeq 6000測序平臺(美國)PE150模式進行測序。20×覆蓋度達到95%，平均測序深度不少于100×，捕獲效率不低于80%，讀長150～200 bp。使用Illumina DRAGEN Bio-IT平臺將測序原始BCL數據拆分為FASTQ文件，采用上海瀚垚生物醫(yī)學億解基因數據解讀系統(tǒng)(簡稱EGIS系統(tǒng))進行變異注釋和解讀。采用Sentieon軟件進行基因序列比對和基因變異分析；采用Sentieon軟件組件進行基于數據層面包括測序數據質量、比對率、深度、覆蓋度等，進行變異初步過濾；采用SNPEFF軟件進行變異信息注釋，通過與已知的和基因功能相關的多種數據庫，如OMIM、ClinVar、人類基因突變數據庫(Human Gene Mutation Database,HGMD)、dbSNP、GnomAD等，對變異進行注釋;采用EGIS系統(tǒng)多種數據解讀工具進行臨床數據解讀，包括bpVast智能篩選、bpPheno表型篩選、bpCNV Scan CNV變異分析、bpBAM在線分析等工具，對變異數據結合臨床表型和相關數據庫注釋信息等進行分析，判斷變異與疾病和表型關聯的優(yōu)先級順序。

1.2.3PCR擴增及Sanger測序 對全外顯子組測序篩查出的可疑致病突變位點應用PCR擴增及Sanger測序進行驗證。應用Primer 5設計引物，所有引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。采用ABIBigDye 3.1測序試劑盒在ABI3130X基因測序儀上對產物進行雙向測序，SnapGene軟件將測序結果與正常序列進行比對分析，驗證基因突變位點。對發(fā)現的基因突變，依據HGMD及PubMed文獻搜索以確定是否為新發(fā)突變；依據美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)最新基因變異數據解讀指南對突變的致病性進行分析。

2 結果

2.1 全外顯子組測序結果先證者攜帶IFT172基因c.4630C>T(p.R1544C)和c.4120T>C(p.W1374R)復合雜合突變。

2.2 Sanger測序及致病性分析Sanger測序結果見圖2。Sanger測序結果確定先證者IFT172基因的這兩個突變分別來自其父母，先證者弟弟未攜帶這兩個突變位點。IFT172基因c.4630C>T(p.R1544C)突變在HGMD專業(yè)版數據庫中已有報道，為致病性變異；IFT172基因c.4120T>C(p.W1374R)突變?yōu)殄e義變異，未見其致病性的相關報道，根據ACMG指南，該變異判定為疑似致病性變異，包括2個中等證據(PM1+PM3)+3個輔助證據(PP3+PP4+PM2)。綜合臨床表型，認為該基因突變?yōu)樵摷蚁迪茸C者的致病原因的可能性大。

圖2 患者及正常對照Sanger測序結果

3 討論

IFT復合體包含20多種IFT蛋白，可以分為IFT-A和IFT-B，IFT-A及其驅動蛋白均已被證明與人類纖毛病相關，特別是與骨骼發(fā)育不良相關；IFT-B包含14個亞基，在人類疾病中的作用尚不清楚。在IFT過程中，大的蛋白顆粒通過微管被驅動蛋白和動力蛋白運送，參與纖毛和鞭毛的安裝、維持[3]。IFT也參與Shh、Wnt等信號傳導和細胞周期調控[4-6]。纖毛蛋白編碼基因或其相關信號通路的基因突變可導致纖毛病變，表現為復雜的多器官系統(tǒng)發(fā)育障礙。根據臨床表型和主要受累器官，可以分為腎病相關性纖毛病與骨骼性纖毛病[7]。腎病相關性纖毛病臨床表現為慢性腎病或慢性腎炎，并導致終末期腎病而需進行腎移植，部分患者表現為腎臟早期囊性發(fā)育不良、肝纖維化等；骨骼性纖毛病包括Ellis-Van Crevel綜合征、窒息性胸營養(yǎng)不良(Jeune 綜合征)、Mainzer-Saldino綜合征和多指綜合征等。

本家系中先證者具有纖毛疾病相關的典型臨床表現，包括多囊腎、多囊肝及全內臟反位等，但纖毛疾病種類多且臨床表現重疊，難以明確其具體疾病類型，遺傳學檢查確定其攜帶IFT172基因c.4630C>T(p.R1544C)和c.4120T>C(p.W1374R)復合雜合突變，分別來自正常臨床表型的父母。IFT172基因c.4630C>T(p.R1544C)突變的致病性在HGMD專業(yè)版數據庫中已有報道，與短肋胸廓發(fā)育不良伴或不伴多指綜合征10型(short-rib thoracic dysplasia 10 with or without polydactyly,SRTD10)有關，軟件預測顯示為有害，綜上并根據ACMG指南，該變異判定為致病性變異。IFT172基因c.4120T>C(p.W1374R)突變?yōu)槲磮蟮肋^的新突變，該突變?yōu)殄e義變異，軟件預測其有害，根據ACMG指南判定其為疑似致病性變異。綜合臨床表型，認為該突變?yōu)橄茸C者致病原因的可能性大，從病因上得以明確診斷。

短肋多指綜合征(short-rib polydactyly syndrome,SRPS)是一組由纖毛功能障礙引起的常染色體隱性或雙基因隱性骨骼發(fā)育不全綜合征，SRTD10是其中的1種類型。IFT172蛋白屬于IFT-B，其突變是SRTD10的唯一病因，導致的纖毛疾病在臨床上較為罕見，到目前為止相關病例報道極少。IFT172基因編碼的膜相互作用蛋白，是纖毛發(fā)生所必需的最大的細胞IFT亞基。與其他纖毛疾病類似，IFT172基因突變導致的臨床表現具有異質性，可以骨骼系統(tǒng)異常為主要表現或以非骨骼系統(tǒng)表現為主要表現，骨骼系統(tǒng)異?？梢姸嘀富?、長骨短、胸廓發(fā)育不良等[8]；非骨骼系統(tǒng)異?？梢娙珒扰K反位、慢性腎病、肝腎囊腫、視網膜色素變性、小腦蚓部發(fā)育不全、肥胖、甲狀旁腺功能亢進等[9]。本研究中先證者肝臟及雙腎多發(fā)囊腫、右位心、全內臟反位、腎功能不全、腎性貧血、甲狀旁腺功能亢進、右側精囊缺如，而無明顯的骨骼系統(tǒng)發(fā)育異常。

IFT172基因缺陷也可導致除SRTD10外的其他遺傳綜合征，如Jeune綜合征和Mainzer-Saldino綜合征[9]。經典Jeune綜合征是由IFT80和DYNC2H1基因突變引起的，常不表現出骨骼外癥狀[10]；IFT140基因突變是Mainzer-Saldino綜合征和Jeune綜合征的常見原因，常伴有多種骨骼外病變，包括腎消耗疾病(nephronophthisis,NPHP)、視網膜變性和肝臟異常等[11-12]。而由IFT172基因突變導致的Jeune綜合征具有復雜的表型，常累及骨骼外系統(tǒng)，特別是NPHP、肝纖維化、視網膜變性、肥胖等，大多數患者在兒童時期表現為NPHP伴進行性腎功能不全，并在20歲之前發(fā)展為終末期腎病[7]。

肝臟及腎臟多囊性改變和內臟反位等是纖毛疾病的典型且常見表現，然而，纖毛疾病種類繁多且有相似的臨床癥狀，僅根據臨床表現不能明確病因，高通量測序是一種特異、高效的基因篩查手段，可作為疑似纖毛病患者的第一線檢查方法，對于家庭遺傳咨詢、疾病隨訪和治療以及生育相關指導具有重要的應用價值。