鄭玉婷，朱曉帆，楊宇霞，郭瑞霞，孔祥東

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診內(nèi)科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stromal cell，MSC)是具有自我更新、多向分化和免疫調(diào)節(jié)特性的多能細(xì)胞[1]，它可以從多種組織獲得，如骨髓、脂肪組織、臍帶和胎盤[2-3]。2006年，國際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)確立了MSC細(xì)胞的基本判定標(biāo)準(zhǔn)，包括細(xì)胞表面表達(dá)CD90、CD105和CD73，以及不表達(dá)CD45、CD34、CD14、CD79和HLA-DR[4]，但該標(biāo)準(zhǔn)只定義了基本的形態(tài)和功能特征。MSC存在異質(zhì)性，且MSC的異質(zhì)性被認(rèn)為是其基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展以及MSC療法發(fā)展中的主要障礙[5-6]。人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞(amniotic fluid mesenchymal stem cell，AF-MSC)是在富含血清的培養(yǎng)條件下從羊水中分離出來的一種貼壁細(xì)胞[7-8]，在自體移植的臨床應(yīng)用中安全性較高[9]。對(duì)AF-MSC異質(zhì)性的潛在分子機(jī)制的研究有助于亞型的鑒定，細(xì)化其細(xì)胞亞群的體外分離。

近年來，單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)技術(shù)已成為研究組織和細(xì)胞異質(zhì)性的有力工具，而10x scRNA-seq平臺(tái)因其能一次性獲取大量單細(xì)胞而被廣泛應(yīng)用。ScRNA-seq可以在單細(xì)胞分辨率下生成單個(gè)細(xì)胞的獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組并建立基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，細(xì)化細(xì)胞亞群分類，獲得不同亞群間的分子標(biāo)志。本研究基于10x scRNA-seq平臺(tái)對(duì)體外培養(yǎng)的人AF-MSC進(jìn)行分析，確定人AF-MSC的細(xì)胞亞群和各群的分子標(biāo)志物，為人AF-MSC更好地應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 羊水獲取選取2018至2020年于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行孕期檢查的孕16～24周孕婦，于超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水10～15 mL，將常規(guī)檢查后提示正常的剩余羊水樣本保存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)該院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(KS-2018-KY-36)，并取得孕婦的知情同意。

1.2 人AF-MSC的分離和培養(yǎng)將收集到的正常羊水室溫下1 500 r/min離心8 min，沉淀用8 mL羊水細(xì)胞培養(yǎng)基(以色列 BI公司)重懸并轉(zhuǎn)移至2個(gè)T25培養(yǎng)瓶中。原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)7 d，鏡下觀察到有散在的貼壁細(xì)胞出現(xiàn)；更換培養(yǎng)液，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)3 d，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，標(biāo)記出成纖維樣細(xì)胞集落的生長范圍，然后用無菌細(xì)胞刮刀刮除標(biāo)定區(qū)域以外的上皮樣細(xì)胞集落，用PBS溶液輕輕沖洗3次，并向每個(gè)培養(yǎng)瓶中添加5 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液；重復(fù)上述操作3次，剩余成纖維樣細(xì)胞呈漩渦狀排列，即得到初步純化的成纖維樣細(xì)胞。待成纖維樣細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，按1∶3的比例傳代。通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)第5代貼壁細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行鑒定，確定其為AF-MSC細(xì)胞。

1.3 單細(xì)胞文庫制備和測(cè)序取檢測(cè)剩余第5代貼壁細(xì)胞，用2.5 g/L胰蛋白酶溶液(美國Sigma公司)消化，PBS洗滌3遍。使用Countess?Ⅱ Automated Cell Counter進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活率測(cè)定，要求細(xì)胞大小均一，細(xì)胞活率≥85%。調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL。采用10x scRNA-seq平臺(tái)，按照10x Genomics Single Cell 3′v3試劑盒(美國Genomics公司)說明書操作，進(jìn)行油包水實(shí)驗(yàn)，制備單細(xì)胞微滴并制備測(cè)序文庫。應(yīng)用Illumina測(cè)序平臺(tái)的雙端測(cè)序模式對(duì)建好的文庫進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析利用10x Genomics平臺(tái)推薦分析的軟件Cell Ranger 5.0對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、比對(duì)、定量，并對(duì)潛在的多細(xì)胞進(jìn)行篩選，最終得到各細(xì)胞的基因表達(dá)矩陣。采用R 4.1.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)用Seurat包中的FindClusters函數(shù)進(jìn)行細(xì)胞聚類分群，應(yīng)用CellCycleScoring函數(shù)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行判定，應(yīng)用FindAllMarkers函數(shù)獲得亞群的標(biāo)記基因，應(yīng)用Schwalie等[10]的方法對(duì)亞群的分化能力進(jìn)行預(yù)測(cè)；應(yīng)用ClusterProfiler包對(duì)亞群標(biāo)記基因進(jìn)行GO通路富集分析。同時(shí)對(duì)一些細(xì)胞表面標(biāo)志物在本研究中的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。

2 結(jié)果

2.1 人AF-MSC的10x scRNA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果此次10x scRNA-seq實(shí)驗(yàn)中懸液上樣量為700～1 000個(gè)/μL，上樣體積<10 μL，單樣本捕獲量設(shè)定為3 000個(gè)細(xì)胞。上樣細(xì)胞得率為75%～80%，符合預(yù)期。下機(jī)結(jié)果分析后顯示共檢測(cè)到7 443個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞基因檢測(cè)數(shù)中位數(shù)為5 971。根據(jù)圖1中的基因數(shù)和線粒體數(shù)分別設(shè)置過濾參數(shù)及閾值。過濾掉多重細(xì)胞、基因數(shù)小于200以及線粒體基因比例大于20%的低質(zhì)量細(xì)胞，剩余 6 717個(gè)細(xì)胞參與后續(xù)分析。

A：AF-MSC的基因數(shù)，count數(shù)，線粒體比率的小提琴圖；B：AF-MSC的count數(shù)與線粒體基因比例和基因數(shù)之間的關(guān)系圖

2.2 人AF-MSC單細(xì)胞聚類結(jié)果利用Seurat包中的FindClusters函數(shù)，將主成分分析中的dim值設(shè)置為30，分辨率設(shè)置為0.2，細(xì)胞被細(xì)分為7個(gè)亞群(圖2A)。因?yàn)锳F-MSC具有自我更新的特性，故我們分析了細(xì)胞周期對(duì)細(xì)胞聚類產(chǎn)生的影響，結(jié)果見圖2B、C、D。其中亞群0、1、4、6由C1期、G2M期和S期細(xì)胞構(gòu)成，亞群0和1構(gòu)成比例相近，亞群4和6中G2M期細(xì)胞占比較低；亞群2和5由G1期和S期細(xì)胞組成，構(gòu)成比相近；亞群3中G1期細(xì)胞占比最多。

A、B：UMAP圖展示細(xì)胞聚類分布情況，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞；C：細(xì)胞周期對(duì)主成分分析的影響；D：不同周期細(xì)胞在亞群中的占比

2.3 不同亞群的標(biāo)記基因及其表達(dá)利用Seurat包中的FindAllMarkers函數(shù)獲得不同亞群細(xì)胞的標(biāo)記基因，并進(jìn)行表達(dá)熱圖匯總，結(jié)果見圖3A。對(duì)不同亞群標(biāo)記基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3B、C。與其他6組亞群相比，亞群4的基因表達(dá)量總體較低，且MSC表面標(biāo)志物基因CD105、CD73、CD90表達(dá)量均較低，考慮其可能為非MSC。

A：表達(dá)熱圖，顯示亞群前10個(gè)表達(dá)差異顯著的基因，黃色代表基因表達(dá)水平升高，顏色的亮度代表升高的程度，黃亮度最高的區(qū)域代表對(duì)應(yīng)細(xì)胞亞群中差異顯著的特異性標(biāo)記基因；B：氣泡圖，顯示亞群標(biāo)記基因的表達(dá)水平；C：小提琴圖，顯示所有亞群MSC標(biāo)記基因CD105、CD90、CD73、CD34的表達(dá)情況

2.4 不同亞群的分化能力預(yù)測(cè)及分析各亞群體外分化能力預(yù)測(cè)結(jié)果見圖4。其中亞群5向各個(gè)方向分化的評(píng)分均較高；亞群2與亞群5評(píng)分相近，但其在成肌細(xì)胞分化方向得分較低。亞群0和1在軟骨、成骨和神經(jīng)方向的分化評(píng)分相似，但亞群1在成肌細(xì)胞分化方向的得分更高。而亞群4在各個(gè)方向的分化潛能均處于較低水平。

圖4 不同細(xì)胞亞群(橫坐標(biāo))分化能力預(yù)測(cè)

2.5 亞群標(biāo)記物的通路富集分析對(duì)不同亞群的標(biāo)記基因進(jìn)行GO通路富集分析，結(jié)果見圖5。分析結(jié)果顯示亞群0和亞群1的標(biāo)記物主要與細(xì)胞分裂期的RNA表達(dá)相關(guān)，集中在姐妹染色單體分離、有絲核分裂、染色體分離等通路；亞群2主要與內(nèi)胚層的形成、細(xì)胞基質(zhì)黏附、成骨作用相關(guān)；亞群3主要與核轉(zhuǎn)錄mRNA分解代謝過程、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的定位相關(guān)；亞群4主要富集在氧化磷酸化、ATP代謝相關(guān)通路；亞群5主要與膠原代謝和對(duì)壓力激素的反應(yīng)相關(guān)；亞群6主要與細(xì)胞外基質(zhì)的組成相關(guān)。

圖5 不同亞群差異基因GO通路富集分析柱狀圖

2.6 人AF-MSC表面標(biāo)志物表達(dá)情況見圖6。多能干細(xì)胞表面標(biāo)志物Oct-4、Nanog，內(nèi)皮和造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45和CD133，選擇素如CD62E、CD62L、CD62P在人AF-MSC中均未見表達(dá)；整合素表面標(biāo)志物ITGB1和ITGA5陽性表達(dá)，ITGA4和CD11a未見明顯表達(dá)；表面抗原CD44陽性表達(dá)，而ICAM1和VCAM1在少量細(xì)胞中表達(dá)，CD31未見表達(dá)。

圖右側(cè)的縱向標(biāo)識(shí)顏色表示基因在單個(gè)細(xì)胞中的表達(dá)情況

3 討論

MSC在促進(jìn)組織再生、抑制炎癥、免疫治療等方面具有巨大潛力，具有向多個(gè)方向分化的能力，在細(xì)胞治療中具有重要的應(yīng)用前景，但MSC的異質(zhì)性卻成為其臨床轉(zhuǎn)化的主要障礙。近來有研究通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)培養(yǎng)型MSC的異質(zhì)性進(jìn)行了探究：Freeman 等[11]對(duì)小鼠骨髓MSC進(jìn)行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞間多能性相關(guān)基因表達(dá)水平基本一致，但與成骨、成軟骨、成脂、神經(jīng)及血管平滑肌分化相關(guān)基因的表達(dá)水平有差異，免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)也不一致；Wang等[12]進(jìn)一步證實(shí)了骨髓MSC在人體內(nèi)的異質(zhì)性；Huang等[13]分析了361個(gè)來自2個(gè)臍帶MSC的轉(zhuǎn)錄組，提出臍血MSC的異質(zhì)性有限，且主要是由不同細(xì)胞周期所致；Liu等[5]對(duì)來自3名供者的 24 358 個(gè)離體培養(yǎng)的脂肪來源的MSC進(jìn)行scRNA-seq，建立了脂肪MSC的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集。但人AF-MSC作為MSC的來源之一，其轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性尚未在單細(xì)胞水平上得到研究。

本課題組前期臨床研究[14]發(fā)現(xiàn)相同條件下體外培養(yǎng)的AF-MSC細(xì)胞表面標(biāo)志物符合MSC要求，且傳代后的細(xì)胞形態(tài)、染色體核型無明顯改變。本研究對(duì)AF-MSC進(jìn)行scRNA-seq，每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)基因中位數(shù)為5 971個(gè)基因，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的MSC的scRNA-seq結(jié)果相一致。對(duì)單個(gè)細(xì)胞中基因數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，部分細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)在2 500個(gè)左右存在一個(gè)小的峰值，進(jìn)一步對(duì)基因數(shù)為200～3 000的細(xì)胞進(jìn)行分析，結(jié)果顯示細(xì)胞聚類為7個(gè)亞群，且主要在亞群3(44%)和亞群4(48%)中，結(jié)合后續(xù)分析結(jié)果，考慮亞群3可能為初步分化的細(xì)胞，亞群4類型暫無法確定。本研究證實(shí)細(xì)胞周期對(duì)聚類分群產(chǎn)生了影響：不同周期細(xì)胞在亞群的分布情況及GO通路富集結(jié)果顯示，細(xì)胞周期對(duì)于亞群的影響較大，該結(jié)果與Huang等[13]、Sun等[15]的研究結(jié)果相似。同時(shí)我們對(duì)AF-MSC表面標(biāo)志物的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果與既往研究[16]結(jié)果相似。對(duì)于細(xì)胞表面標(biāo)志物VCAM1，在Di Trapani等[16]和Cananzi等[17]的研究結(jié)果中有差異，而在我們的結(jié)果中顯示在少量細(xì)胞陽性表達(dá)，提示單細(xì)胞測(cè)序可顯示單個(gè)細(xì)胞水平的基因表達(dá)，可對(duì)基因表達(dá)情況進(jìn)行更精確的判定。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)AF-MSC的研究結(jié)果相吻合；且通過scRNA-seq對(duì)AF-MSC可以進(jìn)行更細(xì)致的分群，為后續(xù)進(jìn)一步研究AF-MSC的特征提供了研究基礎(chǔ)。但本研究也有一定的局限性，由于納入樣本較少，且未進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)的結(jié)果僅具有一定的提示性，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。