陶佳嫦，秦國(guó)慧，李 玲，張 毅

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心和腫瘤中心 鄭州 450052

正常生理?xiàng)l件下，骨髓中的造血干細(xì)胞向祖細(xì)胞分化，之后分化為未成熟的髓細(xì)胞，遷移至外周器官后分化為樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等。但腫瘤、自身免疫性疾病的發(fā)生導(dǎo)致細(xì)胞因子異常累積，阻斷未成熟髓細(xì)胞分化，導(dǎo)致具有免疫抑制功能的髓細(xì)胞累積，這群細(xì)胞被稱為髓源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)。MDSC可通過抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的功能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[1]。除此之外，在腫瘤微環(huán)境中，MDSC可以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cell，Treg) 的累積[2]、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage，TAM) 的形成[3]、成纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblast，CAF) 分化，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤患者的不良預(yù)后[4]。MDSC、Treg、TAM和CAF為腫瘤微環(huán)境中具有免疫抑制作用的主要細(xì)胞，這些細(xì)胞在病理狀態(tài)下的激活會(huì)導(dǎo)致免疫抑制物質(zhì)的產(chǎn)生[5]，這些物質(zhì)可抑制CD8+T細(xì)胞或NK細(xì)胞的增殖和功能，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。目前研究[6-7]表明，體內(nèi)循環(huán)中MDSC水平與腫瘤患者生存有關(guān)并增加腫瘤患者對(duì)免疫檢查抑制劑耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。因此，明確MDSC免疫抑制功能的機(jī)制將為靶向MDSC、提高腫瘤免疫治療效果提供基礎(chǔ)。

RNA甲基化是轉(zhuǎn)錄組學(xué)中一種重要的修飾，通過甲基轉(zhuǎn)移酶來催化和維持。METTL3為甲基化過程中主要的甲基轉(zhuǎn)移酶。研究[8-10]表明，METTL3在腦膠質(zhì)瘤、肝癌及乳腺癌等多種腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用。METTL3全基因敲除小鼠具有胚胎致死性，鑒于MDSC由骨髓細(xì)胞分化而來，因此作者擬構(gòu)建髓細(xì)胞條件性METTL3基因敲除小鼠，為研究METTL3在MDSC中的作用提供動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：METTL3(flox/flox)雄性小鼠從中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所童明漢教授處獲得，Lyz2-cre雌性小鼠購(gòu)于集萃藥康生物科技股份有限公司，均為C57BL/6遺傳背景，野生型C57BL/6小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗條件下，自由進(jìn)食和飲水，所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(GDY1801016)。動(dòng)物飼養(yǎng)均在河南省肝病藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。主要試劑：通用基因組DNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeSTAR(日本TaKaRa公司),DNA Marker、瓊脂糖粉(美國(guó)Invitrogen公司)，SYBR Green Mix(荷蘭Bioconnect公司),重組METTL3抗體、山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor?488，英國(guó)Abcam公司)，PE/Cyanine7抗鼠/人CD11b抗體(美國(guó) Biolegend公司)。

1.2 髓細(xì)胞條件性METTL3基因敲除小鼠的構(gòu)建策略METTL3(flox/flox)小鼠是在METTL3基因4號(hào)外顯子兩端各插入一個(gè)LoxP位點(diǎn)(圖1)的小鼠?；赾re/LoxP位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)原理，METTL3(flox/flox)小鼠與髓細(xì)胞特異表達(dá)Cre酶的Lyz2-cre小鼠交配后，Cre重組酶特異性識(shí)別LoxP位點(diǎn)，通過同源重組實(shí)現(xiàn)髓細(xì)胞中靶基因的特異性敲除。

圖1 METTL3基因LoxP位點(diǎn)的插入情況

1.3 構(gòu)建過程METTL3(flox/flox)雄性小鼠與Lyz2-cre(+/+)雌性小鼠雜交得到METTL3(flox/-)Lyz2-cre(+/-)小鼠，METTL3(flox/-)Lyz2-cre(+/-)小鼠自交最終得到METTL3(flox/flox)Lyz2-cre(+/+)小鼠。

1.4 小鼠基因型鑒定通過PCR反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳鑒定其基因型。DNA提?。杭羧〗慌浜蟮?代子鼠(3～4周齡)尾尖2～5 mm，置于 1.5 mL Eppendorf 管中，采用通用基因組DNA提取試劑盒提取DNA。使用Sangon Biotech公司合成的引物進(jìn)行PCR，引物序列見表1。DNA擴(kuò)增體系(25 μL)：PrimeSTAR 12.5 μL,模板DNA 1 μL,DEPC水 9.5 μL，10×上、下游引物各1 μL。LoxP位點(diǎn)PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃5 min；94 ℃15 s，65 ℃30 s，72 ℃50 s，10個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)降低1 ℃)；94 ℃15 s，55 ℃30 s，72 ℃50 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min，4 ℃保存。Cre位點(diǎn)PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃5 min；98 ℃30 s，65 ℃30 s，72 ℃45 s，20個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃)；98 ℃30 s；55 ℃30 s；72 ℃45 s；72 ℃5 min；10 ℃保存。PCR產(chǎn)物鑒定:用瓊脂糖和1×TAE電泳緩沖液配制混合液，將凝膠移至裝有1×TAE電泳緩沖液的電泳槽中，在樣品槽中加入DNA樣品，145 V恒壓電泳，最后采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察分析。基因型電泳條帶大?。篗ETTL3(flox/flox)為一199 bp的條帶，METTL3(flox/-)為兩條帶，分別為199、159 bp，METTL3(-/-)為一159 bp的條帶；Lyz2-cre(+/+)為一1 413 bp條帶，Lyz2-cre(+/-)為1 413、357 bp兩條帶，Lyz2-cre(-/-)為一357 bp條帶。

表1 用于基因鑒定的PCR引物序列

1.5 METTL3基因敲除效果驗(yàn)證1.3中自交得到16只小鼠，經(jīng)1.4基因型鑒定確認(rèn)6、11號(hào)小鼠為含有cre位點(diǎn)的flox純合子小鼠，以下鑒定采用編號(hào)“6”的純合子小鼠。

基因水平敲除效果的鑒定：待小鼠4周齡后，取野生型小鼠及6號(hào)小鼠骨髓細(xì)胞。提取DNA，使用特異性引物進(jìn)行PCR，METTL3上游引物序列5’-GATGCTGTTTCCATCCGTCT-3’，下游引物序列5’-GAGGCAGGCATCCTAAGTGA-3’，產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

骨髓細(xì)胞中METTL3 mRNA表達(dá)的檢測(cè)：取野生型小鼠及6號(hào)小鼠骨髓細(xì)胞，加入Trizol提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA;METTL3上游引物序列5’-GGGCCCAGGTGCAAGAATTTTG-3’,下游引物序列5’-CACCCCCAACACTCTGTGTAAGA-3’，以 2 μL cDNA 為模板，加入10 μL SYBR Green Mix染料，上、下游引物各4 μL進(jìn)行qPCR，結(jié)果以 2-ΔΔCt表示。采用GraphPad Prism 8對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

骨髓細(xì)胞中METTL3蛋白表達(dá)的檢測(cè)：取野生型小鼠及6號(hào)小鼠骨髓細(xì)胞，PBS重懸，加入1 μL CD11b流式抗體(髓系細(xì)胞的表面標(biāo)志物)，4 ℃孵育15 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入400 μL多聚甲醛,4 ℃固定20 min，離心棄上清。加入1×破膜劑，4 ℃靜置20 min，離心棄上清。加入用破膜劑以1∶400的比例稀釋的METTL3一抗，4 ℃孵育15 min，離心棄上清。加入用PBS以1∶2 000的比例稀釋的熒光二抗，孵育20 min。PBS重懸細(xì)胞，離心棄上清。加入200 μL PBS，用成像流式細(xì)胞儀檢測(cè)METTL3、CD11b的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 METTL3(flox/flox)Lyz2-cre(+/+)小鼠鑒定METTL3(flox/-)Lyz2-cre(+/-)自交，得到16只小鼠，分別進(jìn)行METTL3和Lyz2-cre基因型鑒定。

2.1.1METTL3(flox/flox)基因型鑒定 METTL3(flox/-)自交得到3種子代，分別為METTL3(flox/flox)、METTL3(flox/-)、METTL3(-/-)。基因型鑒定結(jié)果見圖2,僅可以擴(kuò)增出159 bp條帶的為野生型(第2、5、12、15號(hào))，可以同時(shí)擴(kuò)增出159、199 bp條帶的為雜合子(第3、4、7、9、10、13、14號(hào))，僅可以擴(kuò)增出199 bp條帶的為METTL3(flox/flox),即需要的純合子(第1、6、8、11、16號(hào))。

圖2 小鼠1～16 METTL3(flox/flox)基因型鑒定結(jié)果

2.1.2Lyz2-cre基因型鑒定 Lyz2-cre(+/-)自交得到3種子代，分別為L(zhǎng)yz2-cre(+/+)、Lyz2-cre(+/-)和Lyz2-cre(-/-)。基因型鑒定結(jié)果見圖3。其中基因型為L(zhǎng)yz2-cre(+/+)的子代可以擴(kuò)增出1 413 bp的條帶(如5、6、9、11、12、15)，基因型為L(zhǎng)yz2-cre(+/-)的子代可以擴(kuò)增出1 413 bp和357 bp的條帶(如1、3、4、7、10、13、14、16)，而基因型Lyz2-cre(-/-)的子代可以擴(kuò)增出357 bp的條帶(如2、8)。

圖3 小鼠1～16 Lyz2-cre基因型鑒定結(jié)果

2.1.3METTL3(flox/flox)Lyz2cre(+/+)小鼠個(gè)體的獲得 綜合分析METTL3(flox/flox)基因型和Lyz2-cre基因型鑒定結(jié)果，確認(rèn)6、11號(hào)子代鼠基因型為METTL3(flox/flox)Lyz2-cre(+/+)，是敲除了METTL3的目的鼠。

2.2 METTL3基因敲除效果的驗(yàn)證見圖4。基因水平敲除效果的鑒定:PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示6號(hào)小鼠編碼區(qū)外顯子4被敲除。

A：野生型小鼠與6號(hào)小鼠骨髓細(xì)胞基因組DNA的測(cè)序結(jié)果；B：野生型小鼠與6號(hào)小鼠METTL3 DNA改變的示意圖

骨髓細(xì)胞中METTL3 mRNA表達(dá)水平：qPCR結(jié)果顯示6號(hào)小鼠骨髓細(xì)胞中METTL3 mRNA的水平低于野生型小鼠[(0.301±0.060)vs(0.997±0.003)，t=4.712，P=0.009]，提示METTL3基因敲除成功。

骨髓細(xì)胞中METTL3蛋白表達(dá)水平：與野生型小鼠相比，6號(hào)小鼠骨髓細(xì)胞中METTL3蛋白的表達(dá)水平降低(圖5)。

A、B、C：野生型小鼠；D、E、F：6號(hào)小鼠

3 討論

RNA是基因表達(dá)的中心組成部分，起著連接遺傳信息(DNA)和蛋白的作用。調(diào)控基因表達(dá)涉及多種機(jī)制。RNA在轉(zhuǎn)錄期間或轉(zhuǎn)錄后的化學(xué)修飾可參與基因表達(dá)的調(diào)控。在所有的RNA物種中發(fā)現(xiàn)了超過100種的轉(zhuǎn)錄后修飾[11]。在這些修飾中，真核mRNA中的N6甲基腺苷(m6A)修飾是最廣泛的化學(xué)性修飾[12]。越來越多的證據(jù)[13-17]表明m6A參與多種類型的人類癌癥的發(fā)生發(fā)展，包括肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和急性髓系白血病。m6A的水平受到甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和結(jié)合蛋白的嚴(yán)格調(diào)控。甲基轉(zhuǎn)移酶主要包括METTL3、METTL14、METTL16等蛋白。METTL3作為主要的甲基轉(zhuǎn)移酶，已被證實(shí)在腦膠質(zhì)瘤、肝癌及乳腺癌等多種腫瘤[8-10]中發(fā)揮促癌作用，但在免疫細(xì)胞中報(bào)道有限。目前的研究[18-20]證明METTL3 可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的激活，并參與維持T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)與分化的調(diào)節(jié)。MDSC是腫瘤微環(huán)境中的重要細(xì)胞成分，可抑制T細(xì)胞的功能，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。因此，靶向MDSC的免疫治療也可作為未來腫瘤免疫治療的新方向。而探究METTL3在MDSC中的作用和機(jī)制則可為靶向MDSC的免疫治療提供新的思路。

基因敲除小鼠是在小鼠全部組織或特定組織中使某基因功能缺少，是闡明該基因功能最直接有效的方式之一。全基因敲除小鼠也被用于研究某基因的作用[21]。

Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)是目前用于條件性基因敲除最常用的系統(tǒng)工具之一。LoxP序列中的特殊回文結(jié)構(gòu)可以被Cre酶特異性識(shí)別結(jié)合并催化 2 個(gè) LoxP 序列之間的片段發(fā)生同源重組，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)該片段的基因敲除。

本研究為構(gòu)建髓源細(xì)胞METTL3基因條件性敲除小鼠。該小鼠的構(gòu)建為在METTL3的4號(hào)外顯子左右各插入一個(gè)LoxP位點(diǎn)，通過與髓系細(xì)胞中特異表達(dá)Cre酶的Lyz2-cre小鼠雜交，最終獲得METTL3(flox/flox)Lyz2-cre(+/+)小鼠。由于MDSC是由髓細(xì)胞分化而來，而METTL3在髓細(xì)胞中被敲除，因此骨髓細(xì)胞在體外被誘導(dǎo)成MDSC后，可使METTL3在MDSC中不能正常表達(dá)。而由于Lyz2是在髓細(xì)胞中特異表達(dá)的酶，因此METTL3(flox/flox)Lyz2-cre(+/+)小鼠也為研究METTL3在其他髓源細(xì)胞如巨噬細(xì)胞或中性粒細(xì)胞中的作用提供了動(dòng)物模型。