任秀花，楊慶慶，張晶晶，張義丹，臧衛(wèi)東

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系 鄭州 450001

組蛋白去乙?；窼irtuin3(SIRT3)作為一種煙酰胺腺苷二核苷酸(NAD+)依賴性去乙酰化酶，廣泛表達(dá)于腦、心臟、肝臟等代謝旺盛的器官組織[1]。研究[2-3]顯示，SIRT3可通過(guò)激活超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶，促進(jìn)線粒體對(duì)活性氧的清除，保護(hù)線粒體免受氧化應(yīng)激損傷，與線粒體代謝、細(xì)胞死亡、免疫和炎癥等生物功能息息相關(guān)。背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)為初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的胞體所在部位，其氧化應(yīng)激水平在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展中起著重要作用[4]。本研究通過(guò)免疫印跡和免疫熒光標(biāo)記法，對(duì)小鼠DRG中SIRT3的表達(dá)及其在神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下的表達(dá)變化進(jìn)行了探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器SIRT3抗體購(gòu)自Affinity公司，DRG大直徑神經(jīng)元標(biāo)志物NF200、膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GS、β-actin抗體以及HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體和山羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，DRG小直徑非肽能神經(jīng)元標(biāo)志物IB4和中小直徑肽能神經(jīng)元標(biāo)志物CGRP抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG和488標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司。多聚甲醛、組織裂解液、蛋白濃度測(cè)定試劑盒、抗熒光淬滅劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。Von-Frey絲購(gòu)自法國(guó)Bioseb公司，體視顯微鏡、正置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司，小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)購(gòu)自深圳瑞沃德公司，全自動(dòng)超薄切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司，生物分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)Thermo公司，電泳、轉(zhuǎn)膜及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，低速瞬時(shí)離心機(jī)、磁力攪拌器購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組體重22～25 g的健康成年雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)DW2020070025)。小鼠購(gòu)買后正常飼養(yǎng)至少7 d以適應(yīng)環(huán)境(12 h/12 h光照周期，水食自取)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組(3只)、假手術(shù)組(共12只)和坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury，CCI)組(12只)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已獲得鄭州大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 CCI模型的建立使用異氟烷麻醉(體積分?jǐn)?shù)4%異氟烷用于誘導(dǎo)，體積分?jǐn)?shù)2%異氟烷用于維持)健康成年雄性C57BL/6小鼠，剃除手術(shù)部位及周圍毛發(fā)，隨后使其處于俯臥位并固定左后肢，使用碘伏對(duì)去毛部位進(jìn)行消毒，在股骨外側(cè)上方縱行切開皮膚以及順肌紋鈍性分離股二頭肌，暴露并分離坐骨神經(jīng)。在坐骨神經(jīng)主干的中部，用手術(shù)縫合線以1 mm 的間距進(jìn)行3次結(jié)扎，結(jié)扎強(qiáng)度以引起腿部肌肉輕度顫動(dòng)為宜。結(jié)扎完畢后逐層縫合傷口，傷口再次消毒。假手術(shù)組小鼠僅做皮膚切口和肌肉鈍性分離，不做坐骨神經(jīng)結(jié)扎。

1.4 各組小鼠機(jī)械痛行為學(xué)測(cè)試采用經(jīng)典的Von-Frey絲測(cè)試法(0.07 g和0.40 g)進(jìn)行機(jī)械痛行為學(xué)測(cè)試。假手術(shù)組和CCI組小鼠分別于術(shù)前1 d(-1 d)、術(shù)后7 d進(jìn)行測(cè)試。每次測(cè)試前將小鼠隨機(jī)放置于測(cè)試位適應(yīng)30 min，安靜(不來(lái)回走動(dòng)，舔爪)后，先用0.07 g Von-Frey絲垂直作用于小鼠掌跖部無(wú)毛處(Von-Frey絲呈“S”形，作用時(shí)間6～8 s，相鄰刺激間隔至少7 s，每只腳測(cè)量10次)。0.07 g絲測(cè)試完畢30 min后開始進(jìn)行0.40 g Von-Frey絲測(cè)試。作用時(shí)間內(nèi)，小鼠縮足或舔舐被刺激側(cè)記為陽(yáng)性反應(yīng)。機(jī)械痛閾值為10次刺激中陽(yáng)性反應(yīng)的百分比，即機(jī)械縮足頻率(paw withdrawal frequency,PWF)。

1.5 各組小鼠DRG中SIRT3蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)術(shù)后7 d使用體積分?jǐn)?shù)4%異氟烷深度麻醉小鼠后快速斷頭處死并取出L3～5腰椎DRG。每組6只小鼠，每2只共6個(gè)術(shù)側(cè)L3～5DRG合為一個(gè)測(cè)試樣，用于后續(xù)檢測(cè)(因單只動(dòng)物組織量過(guò)小，無(wú)法檢測(cè)，故合并標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè))。向每個(gè)樣本加入65 μL裂解液，使用低溫研磨儀充分研磨，1 000 r/min 4 ℃離心10 min并取上清液，使用蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度；取30 μg總蛋白進(jìn)行電泳，260 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h，含50 g/L牛血清白蛋白的TBST溶液封閉2 h，隨后使用SIRT3和β-actin一抗(均按1∶1 000稀釋)4 ℃搖床孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次后使用山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗(均按1∶10 000稀釋)孵育2 h；TBST洗膜3次；使用ECL發(fā)光試劑盒曝光成像。使用Image J軟件分析，以目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值的比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 SIRT3在DRG中神經(jīng)元的定位使用體積分?jǐn)?shù)4%異氟烷深度麻醉小鼠3 min，隨后快速打開小鼠胸腔，暴露心臟。使用輸注器于左心室進(jìn)針，并于右心耳剪口用于液體流出，使用注射用生理鹽水快速灌流至小鼠右心耳造口無(wú)血液流出，肝臟變?yōu)槿榘咨?。隨后使用預(yù)冷的40 g/L多聚甲醛溶液灌流20 min，灌流結(jié)束后取術(shù)側(cè)L3～5DRG組織，置于40 g/L多聚甲醛中4 ℃過(guò)夜固定。固定后組織常規(guī)脫水及包埋，4 μm厚切片，每個(gè)蠟塊連續(xù)切片6張，60 ℃烤片2 h備用。經(jīng)常規(guī)脫蠟至水的切片使用ddH2O清洗3遍，使用檸檬酸緩沖液(pH 6.0)進(jìn)行高溫抗原修復(fù)，使用PBS清洗3遍，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%的山羊血清封閉1 h后，分別用SIRT3(抗體按1∶200稀釋)、SIRT3+NF200(抗體按1∶500稀釋)、SIRT3+IB4(抗體按1∶500稀釋)、SIRT3+CGRP(抗體按1∶500稀釋)、SIRT3+GS(按1∶500稀釋)進(jìn)行免疫標(biāo)記(4 ℃過(guò)夜)。隨后加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗(Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG或488標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，均按1∶300稀釋)，避光室溫孵育2 h，PBS漂洗3次，10 min/次。DAPI(按1∶200稀釋)襯染胞核，使用抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。每張切片使用Imaging J軟件進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Graphpad Prism數(shù)據(jù)分析軟件。應(yīng)用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析比較不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠機(jī)械縮足頻率的差異，應(yīng)用單因素方差分析比較各組小鼠SIRT3蛋白表達(dá)水平的差異，組間兩兩比較使用Sidak′s多因素檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SIRT3在正常小鼠DRG神經(jīng)元中的定位免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，在正常小鼠DRG中，SIRT3與NF200、CGRP和IB4均有共標(biāo)(圖1A～C)，且定位于細(xì)胞質(zhì)中。SIRT3與GS不共標(biāo)(圖1D)。SIRT3與各類神經(jīng)元標(biāo)志物共標(biāo)率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：分別有95.7%的NF200陽(yáng)性神經(jīng)元(圖1E)、79%的CGRP陽(yáng)性神經(jīng)元(圖1F)和80.5%的IB4陽(yáng)性神經(jīng)元與SIRT3共標(biāo)(圖1G)；在SIRT3陽(yáng)性神經(jīng)元中，分別有46.4%、51.9%和36%的神經(jīng)元與NF200、CGRP和IB4共標(biāo)(圖1E～G)。該結(jié)果提示，SIRT3廣泛分布于小鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)的各類神經(jīng)元而非膠質(zhì)細(xì)胞中。

A～D：SIRT3分別與NF200、CGRP、IB4和GS雙標(biāo)示例；藍(lán)色為DAPI指示的細(xì)胞核；E～G：SIRT3和NF200、CGRP、IB4的免疫熒光陽(yáng)性率以及共標(biāo)率統(tǒng)計(jì)圖

2.2 假手術(shù)和CCI組小鼠機(jī)械痛閾值的比較見表1。由表1可知，CCI組小鼠術(shù)后7 d機(jī)械縮足頻率較術(shù)前升高，且高于假手術(shù)組，說(shuō)明CCI手術(shù)導(dǎo)致小鼠術(shù)側(cè)足底出現(xiàn)了顯著的機(jī)械痛覺(jué)敏化，模型建立成功。

表1 假手術(shù)和CCI組小鼠機(jī)械痛閾值的比較

2.3 2組DRG中SIRT3蛋白表達(dá)的比較術(shù)后7 d，與假手術(shù)組(1.00±0.08)相比，CCI組小鼠DRG中SIRT3蛋白(0.46±0.18)表達(dá)量降低(t=3.882,P=0.018)。

2.4 2組不同類型DRG神經(jīng)元中SIRT3的表達(dá)變化見表2和圖2。神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛小鼠DRG中SIRT3的下降主要發(fā)生于大直徑神經(jīng)元和小直徑非肽能神經(jīng)元中。

表2 假手術(shù)組與CCI組小鼠不同類型DRG神經(jīng)元中SIRT3表達(dá)的比較 %

A～F：假手術(shù)組和CCI組小鼠DRG中SIRT3分別與NF200、CGRP以及IB4的雙標(biāo)結(jié)果

3 討論

初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元(傷害性感受器)在痛覺(jué)傳導(dǎo)通路中負(fù)責(zé)感知外界傷害性刺激類型、強(qiáng)度、位置并將其轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，其功能是保證痛覺(jué)感知可正常進(jìn)行的關(guān)鍵因素。神經(jīng)損傷、炎癥、化療等刺激均可導(dǎo)致DRG神經(jīng)元發(fā)生如離子通道表達(dá)、線粒體損傷、氧化應(yīng)激等變化而使其處于過(guò)度興奮狀態(tài)，參與多種慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展[5-8]。

DRG是初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的胞體聚集部位。SIRT3作為Sirtuin家族中主要成員之一，主要定位于線粒體，通過(guò)參與線粒體代謝，對(duì)多種細(xì)胞生理狀態(tài)起著重要調(diào)控作用[9-12]。我們的研究結(jié)果顯示SIRT3在DRG的NF200陽(yáng)性的有髓神經(jīng)元、CGRP陽(yáng)性的肽能傷害性感受器以及IB4陽(yáng)性的非肽能傷害性感受器中均有廣泛表達(dá)；在CCI誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下小鼠DRG中SIRT3表達(dá)減少，且SIRT3表達(dá)減少主要發(fā)生在大直徑神經(jīng)元和小直徑非肽能神經(jīng)元中，提示SIRT3可能通過(guò)影響這兩類神經(jīng)元的功能而參與神經(jīng)病理性疼痛。

隨著近年來(lái)針對(duì)SIRT3的研究逐漸深入，越來(lái)越多的研究成果[7,11]證明，SIRT3可通過(guò)調(diào)節(jié)能量代謝和氧化應(yīng)激而參與如糖尿病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展，SIRT3在疾病發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制也開始被深入探索。作為機(jī)體內(nèi)功能活動(dòng)最為旺盛、ATP需求量最大的細(xì)胞之一，神經(jīng)元的生存與活動(dòng)均極大地依賴于線粒體的正常活動(dòng)。線粒體功能異?？蓪?dǎo)致神經(jīng)元ROS生成增多，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[13]。有研究[14]表明，SIRT3可以通過(guò)抑制線粒體氧化應(yīng)激來(lái)控制細(xì)胞存活、代謝和應(yīng)激反應(yīng)。SIRT3敲除可使線粒體出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸酶缺陷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低，提示SIRT3可通過(guò)去乙?；せ詈粑付龠M(jìn)線粒體功能[15]。此外，SIRT3敲除小鼠表現(xiàn)出蛋白乙?；皆黾?，超氧化物歧化酶2活性降低，氧化還原穩(wěn)態(tài)被破壞[15-16]。相反，SIRT3過(guò)表達(dá)可抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的線粒體Ca2+超載，保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激損傷[17]。

在腎臟疾病中的研究[18]顯示，近端腎小管SIRT3表達(dá)下降和線粒體功能障礙是腎小管損傷與應(yīng)激的發(fā)生因素之一；在急性腦缺血過(guò)程中，SIRT3蛋白表達(dá)下降可通過(guò)破壞線粒體功能導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[19]。結(jié)合我們的研究結(jié)果，在CCI誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下，大直徑神經(jīng)元和小直徑非肽能神經(jīng)元中SIRT3陽(yáng)性細(xì)胞比例減少，我們高度假設(shè)SIRT3的減少可能參與了大直徑神經(jīng)元和小直徑非肽能神經(jīng)元的線粒體損傷，進(jìn)而介導(dǎo)小鼠的痛覺(jué)敏化。

我們將進(jìn)一步在不同的疼痛模型中上調(diào)或下調(diào)SIRT3，繼而觀察對(duì)疼痛的行為學(xué)影響，以明確SIRT3是否是參與疼痛的重要分子，以及其影響下游的分子機(jī)制。同時(shí)，我們也將進(jìn)一步針對(duì)SIRT3在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展乃至治療中的作用進(jìn)行深入研究，以期為將SIRT3作為神經(jīng)病理性疼痛的治療靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為安全可靠的臨床治療手段提供充分的依據(jù)。