秦東梅，周文斌，仇 瑋，錢影臣，劉善荷，李 明，黃文斌

根據(jù)國家癌癥中心2021年發(fā)布的全國癌癥報告顯示，乳腺癌居我國女性惡性腫瘤發(fā)病首位[1]。長期以來乳腺癌的臨床治療和預(yù)后評估主要集中于對腫瘤細(xì)胞的評估，如腫瘤TNM分期、組織學(xué)類型、病理分級等。近年，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境和腫瘤的臨床生物學(xué)行為及療效密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境內(nèi)的纖維性間質(zhì)數(shù)量及其排列方式，與腫瘤的進(jìn)展和治療反應(yīng)有關(guān)[2-4]。促纖維增生反應(yīng)(desmoplastic reaction, DR)是由腫瘤性病變引起的纖維或結(jié)締組織的增生，其特征為癌細(xì)胞浸潤和伴淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤、募集新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[5]。DR組織學(xué)分類在結(jié)直腸癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管腺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌等實體腫瘤中已有報道，并發(fā)現(xiàn)DR組織學(xué)分類與腫瘤臨床生物學(xué)行為及預(yù)后有關(guān)[6-9]。目前，乳腺癌中DR組織學(xué)分類的臨床意義報道較少，且檢測方法及分析對象尚不一致，其在乳腺癌中的臨床意義尚不清楚。本文分析187例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(invasive ductal carcinoma, IDC)中DR組織學(xué)類型與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，旨在探討乳腺癌中DR的臨床意義，為乳腺癌患者的臨床生物學(xué)行為和預(yù)后評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2017年1月～2020年12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院和南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院行手術(shù)切除的212例乳腺IDC，通過電子病歷系統(tǒng)收集病理資料，剔除資料不完整及術(shù)前行輔助治療的患者，最終收集187例IDC進(jìn)行檢測。187例乳腺癌患者平均年齡55.7歲(31～90歲)；腫瘤平均最大直徑2.35 cm(0.15～9.8 cm)。組織學(xué)分級：Ⅰ級8例，Ⅱ級100例，Ⅲ級79例。脈管侵犯37例，神經(jīng)侵犯20例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者73例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者106例，8例未送檢淋巴結(jié)。根據(jù)AJCC(第8版)進(jìn)行pTNM分期：Ⅰ期61例，Ⅱ期87例，Ⅲ期31例。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 標(biāo)本均采用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，分別行HE和免疫組化EnVision法染色。一抗ER、PR、HER-2和Ki-67均為即用型抗體，購自北京中杉金橋公司。采用全自動免疫組化儀(Dako AutoLink 48)進(jìn)行染色，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2熒光原位雜交 組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，胃酶處理，2×SSC洗滌緩沖液，烤片，在玻片上加入探針，恒溫過夜雜交，室溫下置于0.1%NP-40/2×SSC漂洗，暗處自然干燥，DAPI復(fù)染劑滴加于玻片雜交區(qū)域，暗處放置10～20 min后，在熒光顯微鏡下選用合適的濾片組觀察玻片。HER-2熒光原位雜交探針，購自北京金普嘉公司。

1.3 結(jié)果判讀

1.3.1DR 根據(jù)文獻(xiàn)報道組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)將DR分為成熟型、中間型和未成熟型[10]。DR評估及分類由兩位高年資病理醫(yī)師完成，且判讀結(jié)果不一致者在雙人共攬顯微鏡下會診，共同判斷。

1.3.2免疫組化 ER、PR陽性定位于細(xì)胞核，HER-2陽性定位于細(xì)胞膜。ER、PR陽性參考《乳腺癌雌、孕激素受體免疫組織化學(xué)檢測指南》，將細(xì)胞核著色≥1%定義為陽性[11]。HER-2結(jié)果判斷參考《乳腺癌HER-2檢測指南(2019版)》[12]，即無著色或≤10%的浸潤癌細(xì)胞呈不完整的、微弱的細(xì)胞膜染色為0；>10%的浸潤癌細(xì)胞呈不完整的、微弱的細(xì)胞膜染色為1+；>10%的浸潤癌細(xì)胞呈弱～中等強(qiáng)度的完整細(xì)胞膜染色或≤10%的浸潤癌細(xì)胞呈強(qiáng)而完整的細(xì)胞膜染色為2+；>10%的浸潤癌細(xì)胞呈強(qiáng)而完整且均勻的細(xì)胞膜染色為3+。Ki-67增殖指數(shù)以20%為臨界值，<20%為低表達(dá)和≥20%為高表達(dá)。

1.3.3FISH 免疫組化檢測HER-2為2+者，將進(jìn)行HER-2 FISH檢測，F(xiàn)ISH判讀標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《乳腺癌HER-2檢測指南(2019版)進(jìn)行[12]。

1.3.4乳腺癌分子分型 根據(jù)WHO(2019)乳腺腫瘤分類將乳腺癌分為4種分子分型[13]：(1)Luminal A型：ER陽性，PR陽性≥20%，HER-2陰性且Ki-67增殖指數(shù)<20%；(2)Luminal B型：ER陽性，HER-2陰性，Ki-67增殖指數(shù)≥20%或PR陽性<20%；另一種為ER陽性，HER-2陽性，Ki-67增殖指數(shù)及PR陽性可以任何水平；(3)HER-2過表達(dá)型：ER及PR陰性，HER-2陽性；(4)三陰型：ER、PR及HER-2均陰性。

1.3.5腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL) 根據(jù)WHO(2019)乳腺腫瘤分類將TIL分為3組：<10%為低度/無浸潤；10%～39%為中度浸潤；40%～90%為高度浸潤[13]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，DR組織學(xué)分類與IDC臨床病理學(xué)特征、分子分型、TIL的相關(guān)性分析采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DR組織學(xué)分類與乳腺IDC臨床病理特征的關(guān)系187例乳腺IDC中成熟型DR 15例，中間型DR 83例，未成熟型DR 89例。成熟型DR：間質(zhì)由細(xì)而長的纖維和纖維細(xì)胞分成多層(圖1)；中間型DR：間質(zhì)由寬而明亮的嗜酸性玻璃樣變膠原纖維和成纖維細(xì)胞組成(圖2)；未成熟型DR：纖維母細(xì)胞散亂排列于黏液樣基質(zhì)內(nèi)(圖3)。DR組織學(xué)分類與乳腺IDC病理分級呈負(fù)相關(guān)(χ2=19.150，P=0.001)，即具有成熟型DR的IDC病理分級高，而未成熟型DR的IDC則病理分級低。DR組織學(xué)分類與IDC患者年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、脈管和神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期等均無明顯相關(guān)性(P>0.05，表1)。

2.2 DR組織學(xué)分類與乳腺IDC中ER、PR、HER-2和Ki-67表達(dá)的關(guān)系ER和PR陽性定位于細(xì)胞核，HER-2陽性定位于細(xì)胞膜(圖4～6)。DR組織學(xué)分類與IDC中ER、PR陽性具有相關(guān)性，未成熟型DR在ER/PR陽性的乳腺IDC中高于ER/PR陰性者(χ2=21.601，P<0.001；χ2=21.952，P<0.001，表2)。DR組織學(xué)分類與乳腺癌HER-2、Ki-67陽性無明顯相關(guān)性(χ2=3.176，P=0.204；χ2=2.286，P=0.319)。

2.3 DR組織學(xué)分類與乳腺癌分子分型的關(guān)系187例乳腺IDC中Luminal A型68例，Luminal B型79例，HER-2過表達(dá)型13例，三陰型27例。DR組織學(xué)分類與乳腺癌分子分型密切相關(guān)，其中管腔型IDC具有較高比例的未成熟型DR(41.6%，37/89)，而三陰型乳腺癌多為成熟型DR(53.3%，8/15)(P<0.001，表3)。

2.4 DR組織學(xué)分類與乳腺IDC中TIL的相關(guān)性IDC中TIL具有不同程度浸潤(圖7～9)：DR組織學(xué)分類與TIL的浸潤程度具有相關(guān)性，成熟型DR的IDC具有高度的TIL(60%，9/15)，而未成熟型DR者TIL則為低度/無浸潤(66.3%，59/89)(P<0.001，表3)。

圖1 成熟型DR：間質(zhì)由細(xì)而長的纖維和纖維細(xì)胞分成多層 圖2 中間型DR：間質(zhì)由寬而明亮的嗜酸性玻璃樣變膠原纖維和成纖維細(xì)胞組成 圖3 未成熟型DR：黏液樣間質(zhì)內(nèi)膠原纖維束雜亂無章地分布 圖4 腫瘤細(xì)胞ER呈彌漫陽性，EnVision法 圖5 腫瘤細(xì)胞PR呈彌漫陽性，EnVision法 圖6 腫瘤細(xì)胞呈HER-2(3+)，EnVision法 圖7 TIL低度浸潤 圖8 TIL中度浸潤 圖9 TIL高度浸潤

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，位居女性惡性腫瘤病死率的首位。乳腺癌的臨床治療和預(yù)后評估主要根據(jù)腫瘤大小(T)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M)的TNM分期進(jìn)行，但臨床發(fā)現(xiàn)具有相同臨床分期或病理組織學(xué)參數(shù)相同的患者卻常有不同的腫瘤轉(zhuǎn)歸，提示腫瘤細(xì)胞并不能完全預(yù)測乳腺癌患者的治療反應(yīng)及預(yù)后。以往研究報道，使用基因工程的方法增加小鼠乳腺間質(zhì)內(nèi)I型膠原的含量后，可使其乳腺癌患病率提高3倍，發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的幾率也提高3倍[14]。有文獻(xiàn)報道腫瘤間質(zhì)百分比對三陰型和淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者具有重要預(yù)后價值[15-16]；提示腫瘤間質(zhì)即腫瘤微環(huán)境可能通過多種機(jī)制，包括細(xì)胞外基質(zhì)的重塑、炎癥細(xì)胞的招募、基質(zhì)調(diào)控通路的連接等促進(jìn)腫瘤的增殖和擴(kuò)散。

研究發(fā)現(xiàn)隨著惡性腫瘤的進(jìn)展，腫瘤周圍的微環(huán)境可發(fā)生動態(tài)改變，其中最主要的變化為DR。Ueno等[17]對DR進(jìn)行組織學(xué)分類并將其應(yīng)用于直腸癌的研究中，他們根據(jù)膠原纖維的寬度和間質(zhì)是否伴黏液樣變將DR分為成熟型、中間型和未成熟型，結(jié)果顯示成熟型DR的直腸癌Dukes分期低，而未成熟型DR則Dukes分期高，DR組織學(xué)分類與患者5年生存期明顯相關(guān)。盧梅等[18]對胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤間質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤間質(zhì)成熟度與胰腺癌組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。本組對食管鱗狀細(xì)胞癌中腫瘤間質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，具有未成熟型間質(zhì)的食管鱗狀細(xì)胞癌有較高的pT分期、神經(jīng)和脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較晚的pTNM分期，且與食管癌患者的無進(jìn)展生存率有關(guān)[19]。Ahn等[4]根據(jù)乳腺癌間質(zhì)的主要成分將乳腺癌間質(zhì)分為三種主要類型：膠原為主型、成纖維細(xì)胞為主型和淋巴細(xì)胞為主型，研究結(jié)果顯示主要間質(zhì)類型與乳腺癌臨床病理參數(shù)及激素受體狀態(tài)和HER-2表達(dá)有關(guān)，膠原為主型和成纖維細(xì)胞為主型與ER表達(dá)密切相關(guān)，生存分析顯示間質(zhì)類型與無瘤生存期(disease-free survival, DFS)密切相關(guān)，膠原為主型預(yù)后相對差，表明腫瘤微環(huán)境內(nèi)的間質(zhì)不僅影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，且不同的間質(zhì)類型具有不同的生物學(xué)行為。新近研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中采用靶向腫瘤微環(huán)境的策略，使用針對賴氨酰氧化酶類似物2(一種介導(dǎo)膠原纖維交聯(lián)的酶)的抗體后，腫瘤間質(zhì)發(fā)生重構(gòu)，間質(zhì)膠原的密度顯著降低，腫瘤體積縮小，從而有助于乳腺癌的治療[14]。因此，對于間質(zhì)不成熟的乳腺癌患者，通過靶向腫瘤微環(huán)境使間質(zhì)重構(gòu)，抑制腫瘤的生長和侵襲轉(zhuǎn)移，其有可能成為輔助治療策略。

表1 DR組織學(xué)分類與乳腺IDC臨床病理特征的關(guān)系

表2 DR組織學(xué)分類與乳腺IDC中ER、PR、HER-2和Ki-67增殖指數(shù)的關(guān)系

本組發(fā)現(xiàn)DR組織學(xué)分類僅與病理分級有關(guān)，即具有成熟型DR的IDC，其病理分級高；而未成熟型DR的IDC則病理分級低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，DR組織學(xué)分類與ER、PR陽性密切相關(guān)，ER/PR陽性乳腺癌組織中DR組織學(xué)分類多為未成熟型，而與HER-2陽性無關(guān)，提示激素受體陽性乳腺癌細(xì)胞可能影響腫瘤微環(huán)境中相關(guān)成分的改變而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用。分子分型顯示未成熟型DR多見于管腔型IDC，而成熟型DR多為三陰型IDC，提示DR的組織學(xué)分類與乳腺癌的分子分型及預(yù)后有關(guān)，通過觀察評估DR組織學(xué)形態(tài)不僅能反映乳腺癌微環(huán)境的特點，還能有助于乳腺癌的分子分型預(yù)測。

TIL是機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的一種反應(yīng)，也是免疫治療療效預(yù)測的組織學(xué)特征。文獻(xiàn)雖未報道TIL水平與乳腺癌患者的總生存率和無瘤生存率有關(guān)，但幾項大型系統(tǒng)復(fù)習(xí)和薈萃分析證實，僅在三陰型和HER-2陽性乳腺癌中，TIL高與更好地DFS和總生存期相關(guān)[16,20]。本組DR組織學(xué)分類和TIL呈負(fù)相關(guān)，即成熟型DR伴高度TIL，而不成熟型DR伴低度TIL；提示DR可能通過分泌一些細(xì)胞因子招募TIL，也有可能是TIL分泌的細(xì)胞因子重塑DR，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入分析。

綜上所述，浸潤性乳腺癌中浸潤前沿DR具有不同的組織學(xué)形態(tài)，DR組織學(xué)分類與乳腺癌的分子分型和TIL密切相關(guān)，觀察DR的形態(tài)學(xué)特征并進(jìn)行組織學(xué)分類，可有助于評估和預(yù)測乳腺癌的臨床生物學(xué)行為及分子類型，為乳腺癌患者的治療及預(yù)后提供參考。

表3 DR組織學(xué)分類與乳腺癌分子分型、間質(zhì)TIL的關(guān)系