劉海英，陳 峰，王 梅，姚 嘉

乳腺癌是威脅全球女性健康的主要惡性腫瘤，發(fā)生于乳腺上皮或?qū)Ч苌掀1-2]。其病因復雜，可能與遺傳和環(huán)境有關(guān)[3]，約90%的患者由于腫瘤復發(fā)及體內(nèi)擴散導致死亡[4]。因此，亟需尋找新的生物學標志物。微小RNAs(miRNAs)能夠通過抑制信使RNA (mRNA) 翻譯或促進mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達[5-6]。miRNAs參與調(diào)控細胞凋亡、增殖、遷移和侵襲等多種生物代謝過程[7]。研究證明，miRNA能夠調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[8-9]，包括miR-122[10-11]、miR-767[12-13]、miR-449a[14-15]和miR-133b[16-17]等。上述miRNAs能夠靶向不同的基因，調(diào)節(jié)乳腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥[18]。目前，腫瘤組織中miRNAs與靶基因的作用機制是研究的熱點。因此，本文著重探討乳腺癌組織與癌旁組織中miRNA的表達，篩選顯著差異表達的miRNAs-mRNA，并在細胞水平驗證miRNAs與靶基因的作用關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料Trizol(15596026)購自Ambion公司；DNase/RNase-Free Water(R1600)購自Solarbio公司；重組人胰島素溶液(PB180432)購自普諾賽公司；Lipofectamine 2000(VB459270)購自上海一基公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(RG027)購自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 乳腺癌細胞CCD-1095Sk、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、T-47D和ZR-75-1，購自中科院細胞庫。將細胞取出置于37 ℃水浴中，待完全融化，加入4 mL完全培養(yǎng)基，400g離心3 min，棄上清，懸浮于1 mL培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入4 mL 完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2差異表達miRNAs的篩選及靶基因確定 利用腫瘤基因組圖譜(TCGA)獲取1 034例導管和小葉腫瘤/原發(fā)性腫瘤的miRNA表達和102例正常組織的轉(zhuǎn)錄組，對數(shù)據(jù)進行整理分析。綜合文獻報道[10-17]篩選4種表達差異顯著的miRNAs。通過對miRNA進行靶基因預測，結(jié)合GO和KEGG分析確定4種miRNAs所涉及的靶基因。

1.2.3qRT-PCR檢測 取1×106個細胞加入1 mL Trizol中，提取總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用cDNA進行PCR擴增，反應程序：預變性95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s，合計40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt計算mRNA的相對含量。PCR引物由武漢天一華煜公司合成，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR實驗中各基因的引物序列

1.2.4細胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)miRNAs序列設(shè)計合成mimics、mimics-NC、inhibitor、inhibitor-NC。通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞，細胞分為對照組、mimics hsa-miR-122組、mimics hsa-miR-767組、mimics hsa-miR-449a組、mimics hsa-miR-133b組、inhibitor hsa-miR-122組、inhibitor hsa-miR-767組、inhibitor hsa-miR-449a組、inhibitor hsa-miR-133b組、mimics-NC組和inhibitor-NC組。在轉(zhuǎn)染前24 h，將5×105個細胞接種于2 mL完全培養(yǎng)基中，種于6孔板中進行細胞轉(zhuǎn)染。通過熒光拍照檢測轉(zhuǎn)染前、后4種miRNAs的表達，驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5雙熒光素酶質(zhì)粒構(gòu)建 設(shè)計X3′-UTR熒光素酶報告基因載體，分別設(shè)計野生型及突變型。進行WT-ESR1 3′-UTR、MT-ESR1 3′-UTR、WT-EGFR 3′-UTR、MT-EGFR 3′-UTR、WT-HMGB1 3′-UTR、MT-HMGB1 3′-UTR、WT-IGF-1 3′-UTR、MT-IGF-1 3′-UTR基因的合成，進行載體與目的基因的酶切，37 ℃孵育1～2 h，酶切產(chǎn)物電泳檢測以及回收，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。隨后，進行載體與目的基因的連接，16 ℃孵育過夜，進行轉(zhuǎn)化。待平板上長出菌落，隨機挑取若干個單克隆搖菌，送測序公司測序驗證，選取陽性克隆。

1.2.6轉(zhuǎn)染實驗分組 miR-122-5p mimics/inhibitor(空載體組、ESR1 3′-UTR野生型、ESR1 3′-UTR突變型)，miR-133b-5p mimics/inhibitor(空載體組、EGFR 3′-UTR野生型、EGFR 3′-UTR突變型)，miR-449a-5p mimics/inhibitor(空載體組、HMGB1 3′-UTR野生型、HMGB1 3′-UTR突變型)，miR-767-5p mimics/inhibitor(空載體組、IGF-1 3′-UTR野生型、IGF-1 3′-UTR突變型)。轉(zhuǎn)染前24 h，在100 μL完全培養(yǎng)基中接種5×103個細胞，置于96孔板中，細胞融合度達90%時進行轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)測序。

1.2.7雙熒光素酶檢測 每孔細胞轉(zhuǎn)移至EP管，按1 ∶100比例稀釋，向海腎熒光素酶檢測緩沖液加入海腎熒光素酶檢測底物(100×)，每個細胞樣品加入100 μL螢火蟲熒光素酶檢測試劑。放入全功能微孔板檢測儀，計算螢火蟲熒光素酶活性F值。加入100 μL海腎熒光素酶檢測工作液，計算海腎熒光素酶活性R值。根據(jù)檢測的F值和R值，計算相對熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 差異表達miRNAs的篩選TCGA分析結(jié)果顯示：172個miRNAs顯著上調(diào)(log2FC≥1)，差異倍數(shù)最大的前十個miRNAs分別為hsa-miR-122、hsa-miR-1269b、hsa-miR-1269a、hsa-miR-105-2、hsa-miR-767、hsa-miR-105-1、hsa-miR-449a、hsa-miR-3156-1、hsa-miR-3156-3和hsa-miR-592；76個miRNAs顯著下調(diào)(log2FC≤-1)，差異倍數(shù)最大的前五個分別為hsa-miR-133b、hsa-miR-133a-1、hsa-miR-133a-2、hsa-miR-1-2和hsa-miR-1-1(表2)。經(jīng)查閱文獻，篩選4種顯著差異表達的miRNAs進行后續(xù)實驗：hsa-miR-122、hsa-miR-767、hsa-miR-449a和hsa-miR-133b。

表2 差異表達的miRNAs

2.2 多細胞系驗證差異miRNAs的表達hsa-miR-122在CCD-1095Sk、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、T-47D和ZR-75-1細胞中的表達分別為0.97±0.06、7.18±0.29、5.69±0.33、3.62±0.35、5.87±0.22、4.77±0.09(圖1A)。hsa-miR-767在CCD-1095Sk、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、T-47D和ZR-75-1細胞中的表達分別為0.93±0.06、5.99±0.39、3.65±0.23、2.84±0.24、4.90±0.58、3.09±0.20(圖1B)。hsa-miR-449a在CCD-1095Sk、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、T-47D和ZR-75-1細胞中的表達分別為0.96±0.04、3.88±0.28、5.37±0.21、5.53±0.26、3.52±0.09、4.16±0.40(圖1C)。hsa-miR-133b在CCD-1095Sk、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、T-47D和ZR-75-1細胞中的表達分別為0.99±0.01、0.19±0.01、0.23±0.01、0.21±0.01、0.39±0.03、0.28±0.01(圖1D)。

圖1 多細胞系驗證4種差異miRNAs的表達：A.hsa-miR-122在不同細胞中的表達；B.hsa-miR-767在不同細胞中的表達；C.hsa-miR-449a在不同細胞中的表達；D.hsa-miR-133b在不同細胞中的表達；1.CCD-1095Sk；2.MCF-7；3.MDA-MB-231；4.MDA-MB-468；5.T-47D；6.ZR-75-1

2.3 差異miRNAs的靶基因分析通過對miRNA進行靶基因預測，結(jié)合GO和KEGG分析，最終檢測hsa-miR-122-5p、hsa-miR-133b-5p、hsa-miR-449a-5p和hsa-miR-767-5p的靶基因分別為ESR1、EGFR、HMGB1和IGF-1。

2.4 乳腺癌中IGF-1表達與臨床病理特征的關(guān)系IGF-1的表達水平在445例<55歲患者中有199例高表達，在589例>55歲患者中有318例高表達，差異有顯著性(P<0.01)。在267例T1期中有107例高表達，在764例T2～T4期中有407例高表達，差異有顯著性(P<0.01，表3)。

表3 乳腺癌中IGF-1表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.5 轉(zhuǎn)染效率根據(jù)4種差異miRNAs的序列設(shè)計合成mimics、mimics-NC和inhibitor、inhibitor-NC。通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞，可觀察到hsa-miR-122、hsa-miR-133b、hsa-miR-449a和hsa-miR-767的轉(zhuǎn)染效率分別為81.77±1.32、80.58±1.59、80.69±2.15和80.91±2.32(圖2)，提示轉(zhuǎn)染成功，標記基因表達正常。

2.6 轉(zhuǎn)染差異miRNAs對細胞活力的影響與mimics-NC組(1.52±0.01)比較，mimics hsa-miR-122組(1.75±0.01)、mimics hsa-miR-767(1.87±0)組和mimics hsa-miR-449a(1.71±0.01)組的吸光度顯著升高(P<0.01)，mimics hsa-miR-133b組(1.21±0.01)的吸光度顯著降低(P<0.01)；與inhibitor-NC組(1.53±0.01)比較，inhibitor hsa-miR-122組(1.24±0.02)、inhibitor hsa-miR-767組(1.11±0.02)和inhibitor hsa-miR-449a組(1.27±0.02)的吸光度顯著降低(P<0.01)，inhibitor hsa-miR-133b組(1.82±0.01)的吸光度顯著升高(P<0.01，圖3)。

圖2 轉(zhuǎn)染效率：A. hsa-miR-122轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞的綠色熒光表達；B.hsa-miR-133b轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞的綠色熒光表達；C.hsa-miR-449a轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞的綠色熒光表達；D.hsa-miR-767轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞的綠色熒光表達

圖3 轉(zhuǎn)染差異miRNAs對細胞活力的影響：與mimics-NC組比較，**P<0.01；與inhibitor-NC組比較，##P<0.01

2.7 熒光素酶檢測驗證靶基因與mimics-NC組(1.23±0.04)相比，轉(zhuǎn)染miR-122-5p(0.80±0.03)組ESR1 3′-UTR野生型MCF-7細胞的相對熒光活性比值顯著降低(P<0.000 1)。與mimics-NC組(1.73±0.03)相比，轉(zhuǎn)染miR-133b-5p組(0.96±0.03)EGFR 3′-UTR野生型MCF-7細胞的相對熒光活性比值顯著降低(P<0.000 1)。與mimics-NC組(1.35±0.07)相比，轉(zhuǎn)染miR-499a-5p組(0.77±0.03)HMGB1 3′-UTR野生型MCF-7細胞的相對熒光活性比值顯著降低(P<0.000 1)。與mimics-NC組(1.66±0.06)相比，轉(zhuǎn)染miR-767-5p組(0.62±0.03)IGF-1 3′-UTR野生型MCF-7細胞的相對熒光活性比值顯著降低(P<0.000 1，圖4)。上述結(jié)果顯示miR-122-5p、miR-133b-5p、miR-499a-5p和miR-767-5p分別與ESR1 3′-UTR、EGFR 3′-UTR、HMGB1 3′-UTR和IGF-1 3′-UTR序列靶向結(jié)合，并抑制基因的表達，其靶向結(jié)合位點與預測位點一致。

圖4 雙熒光素酶活性分析野生型和突變型：A. miR-122-5p 與ESR1的靶向關(guān)系；B.miR-133b-5p 與EGFR的靶向關(guān)系；C.miR-499a-5p與HMGB1的靶向關(guān)系；D.miR-767-5p與IGF-1的靶向關(guān)系；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1,ns.無相關(guān)性

3 討論

乳腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與相關(guān)基因突變和翻譯后的變化有關(guān)[19]。目前，乳腺癌的分子、細胞機制、診斷、預防和治療等雖然已取得重大進展，但患者的生存率無顯著改善[20]。

本組通過TCGA分析172個上調(diào)(log2FC≥1)的miRNAs，查閱文獻[10-17]篩選4種顯著差異的miRNAs，且在乳腺癌細胞CCD-1095Sk、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、T-47D和ZR-75-1中均有不同程度的表達，通過GO和KEGG分析hsa-miR-122-5p、hsa-miR-133b-5p、hsa-miR-449a-5p和hsa-miR-767-5p的靶基因分別為ESR1、EGFR、HMGB1和IGF-1。已有研究證明，ESR1可能在乳腺癌的治療和轉(zhuǎn)移性發(fā)展中發(fā)揮重要作用，患者治療后可顯著改善ESR1突變[21]。EGFR有助于癌細胞的生長、遷移和轉(zhuǎn)移的形成[22]。HMGB1在乳腺癌組織中具有較高的表達[23]，在病情進展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[24]。有研究證明，槲皮素通過抑制HMGB1的表達促進人乳腺癌細胞凋亡[25]。IGF-1能夠調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育，在乳腺癌中誘導細胞增殖和遷移，其高表達可增加乳腺癌的風險[26]。

根據(jù)4種差異miRNAs的序列設(shè)計合成mimics、mimics-NC、inhibitor、inhibitor-NC，通過雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細胞后，miR-122-5p與ESR1 3′-UTR序列靶向結(jié)合，miR-133b-5p與EGFR 3′-UTR序列靶向結(jié)合，miR-499a-5p與HMGB1 3′-UTR序列靶向結(jié)合，miR-767-5p與IGF-1 3′-UTR序列靶向結(jié)合。4種差異miRNAs均能抑制基因的表達，其靶向結(jié)合位點與預測位點一致。

本實驗通過生物信息學篩選4種差異表達的miRNAs：hsa-miR-122、hsa-miR-767、hsa-miR-449a和hsa-miR-133b。miR-122-5p、miR-133b-5p、miR-499a-5p和miR-767-5p分別與ESR1、EGFR、HMGB1和IGF-1靶向結(jié)合，并抑制基因的表達，其中IGF-1的表達水平與患者年齡、原發(fā)腫瘤分期差異有顯著性，為乳腺癌的靶點治療和基因治療提供參考。