羅燦，陳昕怡，王敏*，李先平，李采霞（. 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗科，長沙 400；. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第 904 醫(yī)院（無錫市太湖醫(yī)院）生殖中心，江蘇 無錫 4044）

肺炎克雷伯菌（KPN）是常見的醫(yī)院機會致病菌，可引起肺炎、肝膿腫、泌尿系統(tǒng)感染、敗血癥、創(chuàng)傷感染、腦膜炎等感染。2017年中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)（CHINET）的數(shù)據(jù)顯示，KPN在我國臨床菌株分離率中居第二位（14.68%），僅次于大腸埃希菌（19.27%）。據(jù)文獻(xiàn)報道，氨基糖苷類藥物可以作為臨床經(jīng)驗治療KPN感染的首選用藥。以氨基糖苷類藥敏分型為代表的表型分型，簡便快速，能較好地指導(dǎo)臨床用藥。但藥敏分型僅據(jù)表型特征進(jìn)行分類，無法滿足從基因水平上發(fā)現(xiàn)菌株之間的聯(lián)系和變異來追蹤感染源的要求。對KPN進(jìn)行基因分型，了解其感染的分子流行病學(xué)是醫(yī)院感染分析的重要任務(wù)。作為KPN基因分型技術(shù)之一，RAPD分型快速、簡便、經(jīng)濟、多態(tài)性檢出率高、可自動化分析，可在DNA水平上反映生物品種鑒定、系譜分析、追溯生物同源性。本文采用RAPD技術(shù)對臨床分離的82株KPN進(jìn)行基因分型，并與氨基糖苷類藥敏分型進(jìn)行對比分析，為追溯KPN的同源性，防止KPN的克隆性傳播以及指導(dǎo)臨床KPN的治療提供依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株

收集中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院2016年8月至2017年2月住院患者臨床標(biāo)本中分離的非重復(fù)KPN 82株，分離自痰標(biāo)本、糞便標(biāo)本、尿液標(biāo)本、血液標(biāo)本、分泌物標(biāo)本和咽拭子標(biāo)本。標(biāo)本主要分布于ICU、呼吸內(nèi)科、新生兒科、神經(jīng)外科等病區(qū)。菌株均經(jīng)Phoenix 100全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定后再按第九版伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊要求確認(rèn)。

1.2 試藥和儀器

MasterMixPCR擴增試劑、DNA Marker I（100-600bp）、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；Phoenix 100全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)（美國BD公司）；PCR擴增儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；JY300C型電泳儀（北京君逸東方電泳設(shè)備有限公司）；FluorChem FC2凝膠成像系統(tǒng)（美國Alpha Innotech 公司）。

1.3 RAPD引物

引物序列RAPD 1（5'-GGGATGGAAC-3'）、RAPD 2（5'-AAGAGCCCGT-3'）、RAPD 3（5'-AACGCGCAAC-3'）和OPA 2（5'-TGCCGAGCTG-3'）均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

2 方法

2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)及鑒定

分離的肺炎克雷伯菌經(jīng)Phoenix 100全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定后再按第九版伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊要求確認(rèn)。該系統(tǒng)進(jìn)行鑒定的同時自動生成對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素的藥敏結(jié)果。按照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的氨基糖苷類藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2.2 細(xì)菌DNA提取

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取肺炎克雷伯菌DNA。

2.3 RAPD擴增

RAPD擴增反應(yīng)總體系為20 μL：DNA模板1 μL，2×Taq PCR Master MIX 10 μL，引 物2 μL，ddHO 7 μL。擴增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，32℃退火2 min，72℃延伸2 min，共45個循環(huán)，最后72℃延伸15 min。取5 μL RAPD產(chǎn)物，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳（80 V·cm×0.5 h），凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。觀察電泳條帶的數(shù)目、位置、熒光強弱進(jìn)行RAPD分型。結(jié)果判讀：條帶完全相同或1條/2條不同判定為同一克隆株。

2.4 RAPD基因分型相符程度計算

RAPD分型兩兩比較最高相符程度（%）＝（對比RAPD分型所占比例最高者菌株數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)RAPD分型主要型別菌株數(shù)）×100%；氨基糖苷藥敏分型結(jié)果與RAPD分型結(jié)果最高相符程度（%）＝（氨基糖苷類藥敏分型所占比例最高者/RAPD分型主要型別相同菌株數(shù)）×100%；RAPD分型與氨基糖苷類藥敏分型結(jié)果對比最高相符程度（%）＝（每種RAPD引物所得分型結(jié)果中所占比例最高者/氨基糖苷類藥敏分型型別相同菌株數(shù)）×100%。

3 結(jié)果

3.1 KPN氨基糖苷耐藥及藥敏分型情況

82株KPN對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素的耐藥率分別為19.51%（16/82），64.63%（53/82），41.46%（34/82）（見表1）。

表1 82株KPN氨基糖苷類藥敏結(jié)果
Tab 1 Aminoglycoside resistance and antimicrobial susceptibility of 82KPN

注：R代表耐藥，M代表中介，S代表敏感。
Note：R for resistance，M for middle，S for susceptibility.

菌株數(shù) 抗菌藥物 藥敏分型阿米卡星 慶大霉素 妥布霉素16 23 21 14 41111 RSSSSSSMS RSRRSSMRR RSSRRMSMM①②③④⑤⑥⑦⑧⑨耐藥率 19.51% 64.63% 41.46%

82株KPN經(jīng)氨基糖苷藥敏分型可分為9種（①～⑨），其中①型占19.51%（16/82），②型占28.05%（23/82），③型占25.61%（21/82），④型占17.07%（14/82）（見圖1）。

圖1 82株KPN氨基糖苷藥敏分型Fig 1 Aminoglycoside typing of 82 KPN

3.2 KPN RAPD分型情況

82株KPN經(jīng)RAPD擴增條帶數(shù)目多在1～7條，形成的圖譜清晰，帶型穩(wěn)定，多態(tài)性豐富。實驗菌株用RAPD 1引物分為20（A～T）種，以C型（25.61%，21/82）為主，其次為D型（15.85%，13/82）以及B型（14.63%，12/82）；用RAPD 2分為22（a～v）種，以b型（37.80%，31/82）為主，其次為e型（7.32%，6/82）以及a型（6.10%，5/82）；用RAPD 3分為17（Ⅰ～ⅩⅦ）種，以Ⅰ型（42.68%，35/82）為主，其次為Ⅱ型（17.07%，14/82）以及Ⅳ型（8.54%，7/82）；用OPA 2分為17（[1]～[17]）種，以[4]型（28.05%，23/82）為主，其次為[3]型（18.29%，15/82）以及[2]型（13.41%，11/82）。各引物擴增產(chǎn)物電泳條帶分型結(jié)果見圖2～5。

圖2 82株KPN的RAPD 1基因分型Fig 2 RAPD 1 genotyping of 82 KPN

圖3 82株KPN的RAPD 2基因分型Fig 3 RAPD 2 genotyping of 82 KPN

圖4 82株KPN的RAPD 3基因分型Fig 4 RAPD 3 genotyping of 82 KPN

圖5 82株KPN的OPA 2基因分型Fig 5 OPA 2 genotyping of 82 KPN

3.3 KPN引物間RAPD分型比較

將RAPD 1與RAPD 2，RAPD 1與RAPD 3，RAPD 1與OPA 2，RAPD 2與RAPD 3，RAPD 2與OPA 2，RAPD 3與 OPA 2引物在82株KPN中的基因分型結(jié)果進(jìn)行兩兩比較，RAPD引物間基因分型相符程度從高到低依次為OPA 2與RAPD 2（65.22%）、RAPD 1與RAPD 3（57.14%）、OPA 2與RAPD 3（52.17%）、RAPD 2與OPA 2（48.39%）、RAPD 2與RAPD 3（35.48%）、RAPD 3與RAPD 1（34.29%）和RAPD 3與OPA 2（34.29%）等。OPA 2分型[4]型與RAPD 2分型b型相符度最高（65.22%，15/23），RAPD 1分型C型與RAPD 3分型Ⅰ型相符度次之（57.14%，12/21）。4種引物擴增結(jié)果對比見表2。

表2 4種引物間RAPD分型對比
Tab 2 RAPD typing of 4 primers

標(biāo)準(zhǔn)RAPD分型 對比RAPD分型引物 型別 株數(shù) 引物 最高相符程度/% 基因型（個數(shù)）RAPD 1 C 21 RAPD 2 23.81 a（2）b（5）c（1）d（1）e（5）l（3）i（1）j（1）r（2）RAPD 1 C 21 RAPD 3 57.14 Ⅰ（12）Ⅱ（2）Ⅲ（1）Ⅳ（3）Ⅸ（1）ⅩⅥ（1）ⅩⅦ（1）RAPD 1 C 21 OPA 2 33.33 [2]（2）[3]（4）[4]（7）[5]（1）[6]（2）[10]（1）[12]（2）[14]（2）RAPD 2 b 31 RAPD 1 22.58 B（7）C（5）D（5）E（1）J（3）N（1）O（5）P（2）S（2）RAPD 2 b 31 RAPD 3 35.48 Ⅰ（11）Ⅱ（8）Ⅲ（1）Ⅳ（5）Ⅴ（1）Ⅵ（1）Ⅶ（1）Ⅷ（1）Ⅻ（1）ⅩⅣ（1）RAPD 2 b 31 OPA 2 48.39 [1]（1）[2]（3）[3]（4）[4]（15）[5]（2）[9]（1）[10]（4）[16]（1）RAPD 3 I 35 RAPD 1 34.29 A（1）B（3）C（12）D（4）E（1）G（2）H（1）Ⅰ（2）J（2）N（1）O（4）S（2）RAPD 3 I 35 RAPD 2 31.43 A（5）b（11）d（3）e（7）h（1）i（2）j（2）m（1）n（1）o（1）q（1）RAPD 3 I 35 OPA 2 34.29 [1]（4）[2]（4）[3]（5）[4]（12）[5]（3）[6]（2）[10]（4）[16]（1）OPA 2 [4] 23 RAPD 1 26.09 B（5）C（6）D（1）E（1）H（1）J（2）M（1）N（1）O（1）P（2）S（2）OPA 2 [4] 23 RAPD 2 65.22 a（1）b（15）e（1）j（2）n（2）o（1）u（1）OPA 2 [4] 23 RAPD 3 52.17 Ⅰ1（2）Ⅱ（4）Ⅲ（1）Ⅳ（4）Ⅶ（1）Ⅷ（1）

3.4 RAPD分型和氨基糖苷藥敏分型對比分析

以RAPD分型為標(biāo)準(zhǔn)分型（見表3），RAPD 2分型b型（12株）與氨基糖苷藥敏分型②型（31株）的相符度最高（38.71%，12/31），OPA 2分型[4]型與藥敏分型③型的相符度次之（34.78%，8/23）。以藥敏分型為標(biāo)準(zhǔn)分型（見表4），對阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素 3種抗生素全耐藥型（①型）與RAPD 3分型I型的相符度最高（62.50%，10/16），對3種藥物均敏感型（②型）與RAPD 2分型b型的相符度較高（52.17%，12/23）。

表3 RAPD分型結(jié)果與藥敏結(jié)果對比(以RAPD分型為標(biāo)準(zhǔn))
Tab 3 RAPD typing and aminoglycosides typing (with RAPD typing as standard)

RAPD分型 氨基糖苷類藥敏分型引物 型別 株數(shù) 最高相符程度/% 分型（個數(shù)）RAPD 1 C 21 28.57 ①（4）②（6）③（4）④（4）⑤（1）⑥（1）⑧（1）RAPD 2 b 31 38.71 ①（6）②（12）③（6）④（5）⑤（1）⑦（1）RAPD 3 I 35 28.57 ①（10）②（10）③（9）④（4）⑥（1）⑨（1）OPA 2 [4] 23 34.78 ①（3）②（7）③（8）④（4）⑥（1）

表4 氨基糖苷類藥敏分型結(jié)果與RAPD分型結(jié)果對比(以RAPD分型為標(biāo)準(zhǔn))
Tab 4 Aminoglycosides typing and RAPD typing (with RAPD typing as standard)

氨基糖苷類藥敏分型 RAPD分型型別 株數(shù) 引物 最高相符程度/% 基因型（個數(shù)）① 16 RAPD 1 31.25 A（1）C（4）D（5）G（1）H（1）L（1）O（1）S（1）T（1）① 16 RAPD 2 37.50 a（2）b（6）e（3）k（1）m（1）o（1）r（1）v（1）① 16 RAPD 3 62.50 Ⅰ（10）Ⅱ（1）Ⅲ（1）Ⅴ（1）Ⅸ（1）ⅩⅣ（1）ⅩⅥ（1）① 16 OPA 2 25.00 [1]（1）[2]（1）[3]（4）[4]（3）[5]（1）[6]（1）[7]（1）[10]（1）[14]（1）[16]（1）[17]（1）② 23 RAPD 1 26.09 A（1）B（4）C（6）D（3）E（2）G（1）H（1）J（1）N（1）O（1）P（1）Q（1）② 23 RAPD 2 52.17 a（4）b（12）d（1）e（3）g（1）i（1）q（1）② 23 RAPD 3 43.48 Ⅰ（10）Ⅱ（4）Ⅳ（4）Ⅴ（2）Ⅵ（1）Ⅶ（1）Ⅷ（1）② 23 OPA 2 30.43 [1]（1）[2]（4）[3]（5）[4]（7）[5]（2）[9]（1）[10]（3）③ 21 RAPD 1 28.57 A（1）B（6）C（4）D（4）F（1）I（2）O（2）R（1）③ 21 RAPD 2 28.57 b（6）e（1）f（1）h（1）i（1）j（2）l（3）n（2）o（1）q（1）s（1）t（1）③ 21 RAPD 3 42.86 Ⅰ（9）Ⅱ（3）Ⅳ（1）Ⅴ（2）Ⅹ（1）Ⅺ（1）ⅩⅤ（1）ⅩⅥ（1）ⅩⅦ（2）③ 21 OPA 2 38.10 [2]（2）[3]（2）[4]（8）[5]（1）[6]（1）[8]（1）[10]（3）[12]（2）[15]（1）④ 14 RAPD 1 28.57 B（2）C（4）D（1）I（1）J（2）K（1）M（1）O（1）R（1）④ 14 RAPD 2 35.71 b（5）d（1）e（2）i（1）n（1）p（1）q（1）r（1）u（1）④ 14 RAPD 3 35.71 Ⅰ（4）Ⅱ（5）Ⅲ（2）Ⅳ（2）Ⅻ（1）④ 14 OPA 2 28.57 [1]（2）[2]（2）[3]（3）[4]（4）[6]（1）[10]（1）[11]（1）⑤ 4 RAPD 1 25.00 C（1）D（1）J（1）L（1）⑤ 4 RAPD 2 50.00 b（1）g（1）l（2）⑤ 4 RAPD 3 25.00 Ⅴ（1）Ⅸ（1）Ⅻ（1）ⅩⅤ（1）⑤ 4 OPA 2 25.00 [2]（1）[10]（1）[12]（1）[13]（1）

4 討論

KPN是院內(nèi)感染的常見病原體之一，其引起的高感染率和高病死率已成為全球關(guān)心的公共衛(wèi)生問題。近年來KPN對不同種類抗菌藥物的耐藥率呈逐年上升的趨勢。據(jù)統(tǒng)計，在2005－2014年間，KPN對第3代頭孢菌素耐藥率從20%上升到80%～90%，氟喹諾酮類藥物耐藥率從40%上升到60%左右，其他抗菌藥物的耐藥率也有不同程度的升高。本實驗82株KPN對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素的耐藥率較高，分別為19.51%、64.63%、41.46%，與相關(guān)報道一致。氨基糖苷耐藥KPN的流行和傳播使KPN的控制變得愈加困難，對菌株的正確分型是進(jìn)行細(xì)菌流行病學(xué)及抗菌藥物研究的關(guān)鍵。判定傳播關(guān)系中病原菌的基因型是否一致仍是分子流行病學(xué)的重要任務(wù)。目前基因分型的方法主要包括RAPD、MLST、PFGE等。PFGE是分子分型方法的金標(biāo)準(zhǔn)，具有分型能力強，結(jié)果容易判斷和重復(fù)性好等優(yōu)點；MLST能夠分析不同時間不同地區(qū)臨床分離株的遺傳相關(guān)性；但兩者實驗條件要求高，操作復(fù)雜，費用昂貴。RAPD采用一條隨機通用引物，通過對基因組DNA擴增所得帶型來進(jìn)行分型，能直接對各種微生物DNA進(jìn)行分析，可作為一種快速的篩查手段和方法。

本實驗中82株KPN采用RAPD 1引物分為20種（A～T型）；用RAPD 2分為22種（a～v型）；用RAPD 3分為17種（Ⅰ～ⅩⅦ型）；用OPA 2分為17種（[1]～[17]型）。KPN的基因多態(tài)性分布可能與菌株的來源以及RAPD技術(shù)靈敏度高有關(guān)。本實驗結(jié)果表明部分菌株表現(xiàn)為同一RAPD型，說明本院KPN確實存在一定程度的克隆性傳播。雖然4種RAPD引物都可以有效地對KPN進(jìn)行基因分型，但是4種引物的分型能力存在差異，其中RAPD 2和OPA 2的分型能力強于RAPD 1和RAPD 3。

本實驗比較了4種引物RAPD分型的相符程度。4種引物間RAPD分型結(jié)果比較中，與其他3種RAPD引物分型結(jié)果相符程度最高的為OPA 2引物，結(jié)合上文所述的RAPD 2和OPA 2的分型能力強于RAPD 1和RAPD 3，提示OPA 2為本實驗室KPN進(jìn)行RAPD分型的最優(yōu)引物?？傮w來說，4種引物間的分型相符程度并不高，原因可能是RAPD引物只能擴增與之特異結(jié)合的基因組DNA，反映部分基因組信息，造成結(jié)果片面。翟平平等用20條隨機引物對4株腸出血性大腸埃希菌進(jìn)行3輪RAPD實驗，只有5條引物擴增圖譜得到較穩(wěn)定的結(jié)果，其余引物出現(xiàn)無擴增條帶、穩(wěn)定性較差等問題。這與本實驗結(jié)果共同說明選擇合適的引物以及對RAPD反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化是保證RAPD可靠度的前提。

本實驗中RAPD擴增所得分型結(jié)果多于氨基糖苷類耐藥分型，且RAPD分型和氨基糖苷類藥敏分型結(jié)果不完全一致，這與相關(guān)報道一致。在本實驗中，同一種RAPD分型包含的菌株對應(yīng)多種氨基糖苷類藥敏表型，RAPD 2和OPA 2分型與藥敏結(jié)果相符程度較高，可能原因是在抗菌藥物的作用下，基因型相同的菌株表型發(fā)生了改變。此外，耐藥表型相同的菌株基因型不一定相同，提示氨基糖苷耐藥表型受多種遺傳因子的綜合影響。其中相符程度最高的是①型（AMK、GEN和TOB全耐藥）與RAPD 3分型I型（62.50%，10/16），其次是②型（AMK、GEN和TOB全敏感）與RAPD 2分型b型（52.17%，12/23）。這表明RAPD 3、RAPD 2分別對氨基糖苷類藥物全耐藥、全敏感的KPN進(jìn)行基因分型的特異度較高，提示在已知KPN的氨基糖苷類藥敏分型時，可選擇相應(yīng)RAPD引物進(jìn)行基因分型，以便追溯菌株同源性。

本實驗驗證了RAPD技術(shù)是一種快速敏感、結(jié)果清晰、多態(tài)性好的分型方法，建立了適用于本實驗室的KPN的RAPD分型方法，提示選擇合適的分型引物是RAPD正確分型的重要影響因素。就本實驗室而言，OPA 2是最優(yōu)引物，而對氨基糖苷類藥物全耐藥、全敏感的KPN進(jìn)行RAPD分型時應(yīng)分別選擇RAPD 3、RAPD 2引物。