余 曉 莉

(洪湖市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科 洪湖 433200)

腎上腺嗜鉻細胞瘤(Pheochromocytoma，PPC)作為一種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，發(fā)病率較低，惡性腫瘤的5年生存率偏低，但早期的臨床表現(xiàn)及影像檢查較難診斷腫瘤的惡性程度，容易延誤病情，影響患者預后[1]。因此，對PPC進行研究，提高術(shù)后預后效率對PPC臨床治療具有重要意義。微小RNA-210(microRNA-210，miR-210)隸屬于miRNA，與血管新生及頸動脈寬窄程度有關(guān)，能夠在缺氧條件下穩(wěn)定表達，在心腦血管疾病及惡性腫瘤中已有大量研究[2]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(bain-derived neurotmphic factor，BDNF)作為一種神經(jīng)生長因子，與機體的應(yīng)激反應(yīng)及情緒障礙等過程相關(guān)，并參與神經(jīng)元的生長分化過程[3]。BDNF與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，因此在各種惡性腫瘤的疾病進展中被大量研究，但RNA-210和BDNF與PPC發(fā)生的相關(guān)研究不多，本研究將檢測PPC患者中miR-210和BDNF表達水平，分析miR-210和BDNF表達與患者臨床病理的關(guān)系，并評估m(xù)iR-210、BDNF表達對PPC的術(shù)后預后結(jié)局的價值，對改善PPC術(shù)后預后具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年5月-2014年12月在本院進行診治的91例PPC患者(研究組)作為研究對象，并收集患者腫瘤直徑、組織分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等資料；另收集35例同期健康志愿者(對照組)的正常腎上腺髓質(zhì)組織標本作為對照，兩組性別組成比例、年齡、BMI等方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

納入標準：(1)病理診斷為PPC患者；(2)病史資料完整者；(3)沒有腫瘤切除手術(shù)史者；(4)均簽署知情同意書。排除標準：(1)合并其他腫瘤患者；(2)有精神疾病者；(3)醫(yī)院倫理委員會審核并批準本研究；(4)中途失訪者。(倫理批號20161209)。

1.2 檢測方法

RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)提取所有研究對象的腎上腺髓質(zhì)組織中的總RNA，后反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測miR-210和BDNF表達水平。Two Step Stemaim-it miR qRT-PCR Quantitation Kit(SYBR Green)試劑盒(上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)配備qRT-PCR反應(yīng)體系(SYBR?Green Mix 7.5 μL，cDNA1μL，上下游引物(10 μM)各0.5μL，使用ddH2O 補至15μL)；擴增應(yīng)用定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，條件為95℃，60s；95℃，10s；63℃，5s；72℃，10s；32個循環(huán)。具體引物序列見表2。采用2-ΔΔCT法對miR-210和BDNF表達水平進行定量分析。

表2 qRT-PCR引物序列

根據(jù)miR-210表達水平，將PPC患者分為miR-210低表達組(miR-210低于或等于均值，45例)和miR-210高表達組(miR-210高于均值，46例)；根據(jù)BDNF表達水平，將PPC患者分為BDNF低表達組(BDNF低于或等于均值，48例)和BDNF高表達組(BDNF高于均值，43例)。

1.3 隨訪

通過復診和電話方式對患者進行隨訪，隨訪時間為患者術(shù)后1～60個月，直到隨訪時間截止或患者死亡為止。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 研究組與對照組miR-210和BDNF表達水平比較

相對于對照組，研究組患者miR-210和BDNF表達水平明顯較高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組患者miR-210和BDNF表達水平比較

2.2 miR-210和BDNF表達水平在不同臨床病理特征中的比較

miR-210和BDNF在不同臨床病理特征中的表達水平中均具有統(tǒng)計學意義，其中腫瘤直徑<3cm、中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者、良性腫瘤患者miR-210和BDNF水平均較低(P<0.05)，見表4。

表4 miR-210和BDNF表達水平在不同臨床病理特征中的比較

2.3 PPC患者miR-210和BDNF表達水平的相關(guān)性

Pearson法分析結(jié)果顯示，PPC患者miR-210和BDNF表達呈明顯正相關(guān)關(guān)系(r=0.445(P<0.05))，見圖1。

圖1 PPC患者miR-210和BDNF表達水平的相關(guān)性

2.4 miR-210和BDNF表達水平與PPC患者術(shù)后預后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析顯示，miR-210和BDNF表達均與總生存時間相關(guān)。91例患者中有61例患者5年后存活。miR-210低表達、高表達組PPC患者的5年預后生存率分別為82.8%、52.2%，miR-210低表達組的生存率明顯高于miR-210高表達組(χ2=10.854，P=0.001)，見圖2。BDNF低表達組、高表達患者的5年預后生存率分別為87.5%、44.2%，BDNF低表達組的生存率明顯高于BDNF高表達組(χ2=21.386，P=0.000)，見圖2。

圖2 miR-210、BDNF表達與PPC患者術(shù)后預后的關(guān)系

2.5 影響PPC術(shù)后預后不良的因素分析

COX分析顯示，miR-210和BDNF高表達、組織低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑≥3cm、腫瘤惡性是影響PPC預后不良的獨立危險因素(P<0.05)，見表5。

表5 影響PPC預后不良發(fā)生的因素分析

3 討論

PPC僅發(fā)生于腎上腺內(nèi)，是在病變組織中能夠產(chǎn)生并分泌兒茶酚胺，致使臨床出現(xiàn)高血壓、頭暈、心悸等癥狀[4]。PPC患者術(shù)后預后數(shù)據(jù)顯示，良性PPC患者的5年生存率大于95%，而惡性PPC患者約44%[5]。但由于PPC患者臨床癥狀沒有特異性，且單從嗜鉻細胞瘤形態(tài)上的差異也難以診斷為惡性腫瘤或良性腫瘤，因此常出現(xiàn)誤診及延誤就醫(yī)等現(xiàn)象，導致患者術(shù)后難以開展有針對性的輔助治療，影響術(shù)后生存結(jié)局[6]。因此預測PPC術(shù)后5年預后結(jié)局，以提前采取措施改善預后具有重要意義。本研究對PPC患者miR-210和BDNF表達水平進行分析，評估分析miR-210和BDNF表達水平對PPC患者的術(shù)后預后價值，以期為PPC深入研究及術(shù)后預后提供理論基礎(chǔ)。

miR-210是一種與細胞分裂、代謝、遷移侵襲有關(guān)的缺氧誘導的miRNA分子，參與線粒體代謝、DNA損傷應(yīng)答、細胞增殖凋亡等重要生理過程[7]。miR-210具有致癌性，近幾年在多種癌癥中被大量研究，如腎細胞癌、肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤疾病等。在膠質(zhì)瘤中miR-210能夠提高膠質(zhì)瘤細胞侵襲能力，表現(xiàn)為高表達且與病理分級有關(guān)[8]。miR-210表達在腎細胞癌中上調(diào)促進了腎小管上皮細胞的增殖、侵襲和遷移能力，抑制腎小管上皮細胞的凋亡[9]，并且在鼻咽癌中，抑制miR-210表達，能夠提高鼻咽癌放抗細胞的敏感性[10]。LUAN等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-210在缺氧誘導條件下在嗜鉻細胞中過表達，通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制BNIP3表達保護腎上腺嗜鉻細胞瘤(PC-12)細胞免受低氧損傷。然而，RUFF等[12]研究發(fā)現(xiàn)，較低的血清miR-210表達水平與惡性嗜鉻細胞瘤或副神經(jīng)節(jié)瘤顯著相關(guān)。以上研究結(jié)果表明，miR-210在腎上腺嗜鉻細胞瘤中的作用仍充滿爭議。本研究結(jié)果表明較之于對照組，研究組患者miR-210表達水平明顯升高，且miR-210表達水平在不同腫瘤直徑及分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤惡性程度患者中表達水平出現(xiàn)顯著差異，提示miR-210與PPC的發(fā)生和發(fā)展存在某種聯(lián)系。繪制Kaplan-Meier生存分析曲線，顯示miR-210表達與總生存時間相關(guān)，miR-210低表達、高表達組PPC患者的5年預后生存率分別為82.8%、52.2%，miR-210低表達組的生存率明顯高于miR-210高表達組，且miR-210高表達是影響PPC術(shù)后預后不良的獨立危險因素，miR-210可能通過某種機制參與PPC的發(fā)生發(fā)展，預示了miR-210有望成為PPC術(shù)后預后的生物標志物，對PPC深入研究提供基礎(chǔ)。

BDNF能夠與其受體結(jié)合參與機體的應(yīng)激反應(yīng)和情緒障礙等過程，在神經(jīng)發(fā)育中起重要作用，并與腫瘤的形成相關(guān)。異常高表達的BDNF能夠激活磷脂酰肌醇-3激酶信號通路，促進惡性腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移，因此在多種腫瘤疾病中被大量研究[13]。BDNF不僅能夠提高食管癌細胞增殖能力，還能促進其侵襲[14]。卵巢癌組織中BDNF為高表達，且與臨床分期、組織分化和卵巢癌的預后有關(guān)[15]。此外BDNF誘導嗜鉻細胞釋放去甲腎上腺素和多巴胺等，兒茶酚胺能使PPC患者產(chǎn)生頭暈等癥狀[16]。目前，針對BDNF在PPC中的相關(guān)研究較少，本研究對PPC患者中BDNF表達水平進行研究，結(jié)果顯示BDNF在研究組中的表達水平顯著高于對照組，且miR-210和BDNF表達呈顯著正相關(guān)。研究表明，下調(diào)BDNF能夠緩解通過miR-210下調(diào)引起的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)毒性[17]。而范海玲等[18]研究顯示，運動訓練干預增加miR-210、BDNF表達可共同促進腦組織VEGF表達，減輕腦缺血缺氧后神經(jīng)損傷。因此推測BDNF可能與miR-210共同參與PPC的發(fā)生發(fā)展。對BDNF表達水平與不同病理癥狀之間的比較發(fā)現(xiàn)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑≥3cm、中高分化、腫瘤惡性患者中，BDNF表達水平顯著升高，提示BDNF可能與PPC患者病情發(fā)展有密切關(guān)系。繪制Kaplan-Meier生存分析曲線，顯示BDNF表達與總生存時間相關(guān)，BDNF低表達組、高表達患者的5年預后生存率分別為87.5%、44.2%，BDNF低表達組的生存率明顯高于BDNF高表達組，且BDNF高表達是影響PPC術(shù)后預后不良的獨立危險因素，提示BDNF對PPC術(shù)后預后有一定預測價值，能為PPC的術(shù)后預后提供理論依據(jù)。

綜上所述，miR-210和BDNF在PPC患者中高表達，與PPC的發(fā)生及預后具有密切關(guān)系，且二者高表達及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑≥3cm、組織低分化、腫瘤惡性是影響PPC術(shù)后預后不良發(fā)生的獨立危險因素，有望成為PPC術(shù)后預后的生物標志物。但本研究對照組樣本量較少，且對miR-210和BDNF在PPC中的作用機制尚未明確，后續(xù)需增加樣本量對miR-210和BDNF在PPC中進行深入研究。