李明洋，徐遠(yuǎn)久，魯小龍，張雷，蘇惠婷，朱珊麗，張友秀

1四川大學(xué)華西廣安醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川廣安 638000；2溫州醫(yī)科大學(xué)分子病毒與免疫研究所微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室；3四川大學(xué)華西廣安醫(yī)院外圍手術(shù)室

沙眼衣原體是全球細(xì)菌性傳播感染和可預(yù)防性失明的主要病原體[1]。近年來(lái)，衣原體傳播感染性疾病的發(fā)病率迅速增加，以抗生素為主的治療策略效果不佳。疫苗作為保護(hù)和控制傳染性疾病最有效的手段，其既能誘導(dǎo)局部中和抗體以防止細(xì)胞外的病原體感染，又能誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)以靶向受感染細(xì)胞[1-2]。衣原體主要外膜蛋白（MOMP）疫苗是迄今為止發(fā)現(xiàn)的保護(hù)性最強(qiáng)的亞單位疫苗[3]。MOMP是存在于沙眼衣原體的原體和始體表面的跨膜蛋白，有四個(gè)對(duì)稱間隔的可變結(jié)構(gòu)域（VDs Ⅰ～Ⅳ），這些結(jié)構(gòu)域序列既是血清分型決定因素，也是中和抗體的體內(nèi)靶位點(diǎn)[4]。研究表明，MOMP的VD Ⅱ、Ⅳ介導(dǎo)沙眼衣原體黏附宿主細(xì)胞，具有較強(qiáng)的免疫原性，含多個(gè)潛在抗原表位，可作為重要的免疫原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[5-6]。當(dāng)沙眼衣原體持續(xù)性感染時(shí)，細(xì)胞內(nèi)沙眼衣原體部分蛋白表達(dá)發(fā)生改變，但MOMP表達(dá)量始終保持在較高水平，故MOMP很可能參與維持沙眼衣原體持續(xù)性感染狀態(tài)[7-8]。因此，開展沙眼衣原體MOMP的研究具有重要意義。2022年1月—6月，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)并分析沙眼衣原體MOMP的蛋白結(jié)構(gòu)及免疫優(yōu)勢(shì)表位，為沙眼衣原體感染的診斷及高效表位疫苗的研制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 MOMP氨基酸序列獲取及理化性質(zhì)分析 登錄瑞士生物信息學(xué)UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/），檢索E型沙眼衣原體MOMP的氨基酸序列信息。應(yīng)用EXPASY服務(wù)器（https：//www.expasy.org/tools）上的 ProtParam 工具，分析MOMP的氨基酸組成、不穩(wěn)定性指數(shù)等理化性質(zhì)。

1.2 MOMP的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 基于EXPASY服務(wù)器上的不同分析方法（SOPMA、GOR），在線預(yù)測(cè)MOMP的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲。

1.3 MOMP的B細(xì)胞表位綜合分析 基于IEDB（http：//tools.iedb.org/main/bcell/）在線預(yù)測(cè)軟件，預(yù)測(cè)MOMP蛋白的親水性參數(shù)、表面可及性參數(shù)、抗原性參數(shù)、柔韌性參數(shù)和線性表位參數(shù)。結(jié)合各預(yù)測(cè)參數(shù)并用吳玉章等建立的抗原性指數(shù)（AI）[9]綜合分析其B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位。

1.4 MOMP的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）表位綜合分析 基于Net CTL（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/）、SYFPEITHI（http：//www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）、IEDB（http：//tools.immuneepitope.org/main/）在線軟件，針對(duì)HLA-A*02：01、HLA-A*03及HLA-B*07：02類分子預(yù)測(cè)MOMP的CTL限制性表位。Net CTL篩選出 COMB＞1.0的九肽，SYFPEITHI篩選出Score＞21的九肽，IEDB篩選出IC50＜50 nmol/L的九肽。

1.5 MOMP的輔助性T細(xì)胞（Th）表位綜合分析基 于 SYFPEITHI、RANKPEP（http：//imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html）在線軟件，針對(duì) HLADRB1*01：01、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1501類分子預(yù)測(cè)MOMP的Th限制性表位。SYFPEITHI中篩選出Score＞21的結(jié)果，RANKPEP選取服務(wù)器默認(rèn)結(jié)果。

1.6 MOMP的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析服務(wù)器Galaxy（https：//galaxy.seoklab.org/index.html）在線建模分析MOMP的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 沙眼衣原體MOMP氨基酸序列和理化性質(zhì) 經(jīng)ProtParam軟件分析，MOMP由393個(gè)氨基酸組成，分子式C1874H2916N498O583S21，序列編號(hào)P17451，氨基酸序列：MKKLLKSVLVFAALSSASSLQALPVGNPAEPSLMID GILWEGFGGDPCDPCTTWCDAISMRMGYYGDFVF DRVLKTDVNKEFQMGDKPTSTTGNATAPTTLTARE NPAYGRHMQDAEMFTNAACMALNIWDRFDVFCTL GASSGYLKGNSASFNLVGLFGDNENQSTVKTNSVP NMSLDQSVVELYTDTAFSWSVGARAALWECGCAT LGASFQYAQSKPKVEELNVLCNAAEFTINKPKGYV GQEFPLALIAGTDAATGTKDASIDYHEWQASLALS YRLNMFTPYIGVKWSRASFDADTIRIAQPKSATAIF DTTTLNPTIAGAGDVKASAEGQLGDTMQIVSLQLNK MKSRKSCGIAVGTTIVDADKYAVTVETRLIDER AAHVNAQFRF。MOMP結(jié)構(gòu)中占比居前四位的氨基酸分別為丙氨酸（Ala）、蘇氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly），半胱氨酸（Cys）占比2.9%，易與分子間MOMP形成多聚體形式，維持空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。MOMP不穩(wěn)定性指數(shù)為25.82，蛋白性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定。MOMP總平均親水性為-0.088，為親水性蛋白[9]。

2.2 沙眼衣原體MOMP的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果 應(yīng)用Expasy服務(wù)器上的SOMPA、GOR預(yù)測(cè)MOMP的二級(jí)結(jié)構(gòu)。SOMPA顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)由39.95%的α螺旋、18.83%的伸展鏈、37.40%的無(wú)規(guī)則卷曲、3.82%的β轉(zhuǎn)角構(gòu)成；GOR顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)由29.77%的α螺旋、18.32%的伸展鏈、51.91%的無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。綜合預(yù)測(cè)MOMP二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主，出現(xiàn)在23～31 aa、34～37 aa、44～51 aa、84～89 aa、92～99 aa、148～152 aa、171～178 aa、253～264 aa、305～310 aa、324～327 aa、351～356 aa；α 螺旋出現(xiàn)在 7～14 aa、16～21 aa、69～71 aa、111～127 aa、224～233 aa、266～280 aa、330～335 aa、346～351 aa、373～392 aa；少見β轉(zhuǎn)角。

2.3 沙眼衣原體MOMP B細(xì)胞表位分析結(jié)果基于IEDB服務(wù)器上的B細(xì)胞表位在線預(yù)測(cè)工具，MOMP的親水性系數(shù)、表面可及性參數(shù)、抗原性參數(shù)、柔韌性參數(shù)和線性表位預(yù)測(cè)結(jié)果見表1、圖1[10-12]。同時(shí)結(jié)合MOMP二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲可能存在的區(qū)段及抗原指數(shù)，綜合分析推測(cè)其B細(xì)胞表位可能存在的區(qū)域是MOMP的N端GFGGDPCDPCT （42～52 aa）、 DNENQSTVKTNSVPNMSLD（161～179 aa）、TGTKDAS（259～265 aa）和NKMKSRKSCG（349～358 aa）。

表1 沙眼衣原體MOMP B細(xì)胞表位的肽段位置預(yù)測(cè)結(jié)果

圖1 沙眼衣原體MOMP不同參數(shù)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.4 沙眼衣原體MOMP限制性CTL表位預(yù)測(cè)分析結(jié)果 將MOMP序列輸入3種CTL表位分析軟件（Net CTL、SYFPEITHI、IEDB），選擇HLA-A*02：01、HLA-A*03及HLA-B*07：02類分子三種MHC Ⅰ限制類型，預(yù)測(cè)出MOMP的九肽CTL限制性表位。IC50＜50 nmol/L被認(rèn)為是高親和力，且數(shù)值越低親和力越高[13]。針對(duì)每一種表型，篩選出各軟件預(yù)測(cè)分值均較高且有意義的肽段用作候選CTL表位，具體序列見表2。

表2 沙眼衣原體MOMP的候選CTL表位序列

2.5 沙眼衣原體MOMP Th表位預(yù)測(cè)分析結(jié)果 將MOMP序列輸入2種Th表位分析軟件（SYFPEITHI、RANKPEP），選擇 HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLADRB1*0801、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1501 類分子7種MHC Ⅱ限制類型，預(yù)測(cè)出MOMP的9個(gè)或15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的Th限制性表位。針對(duì)每一種表型，篩選出各軟件預(yù)測(cè)分值均較高且有意義的肽段，用作候選Th表位[14]。具體序列見表3、表4。

表3 SYFPEITHI預(yù)測(cè)沙眼衣原體MOMP的候選Th表位序列

表4 RANKPEP預(yù)測(cè)沙眼衣原體MOMP的候選Th表位序列

2.6 MOMP三維結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果 綜合上述預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇兼有多個(gè)表位的氨基酸區(qū)域P1（42～65 aa）、P2（155～185 aa）、P3（342～359 aa）作為免疫優(yōu)勢(shì)表位（圖2A）。在Galaxy WEB在線分析MOMP三級(jí)結(jié)構(gòu)，將上述預(yù)測(cè)的免疫優(yōu)勢(shì)表位P1、P2、P3標(biāo)記于MOMP三維結(jié)構(gòu)中（圖2B）。P1區(qū)段氨基酸序列為GFGGDPCDPCTTWCDAISMRMGYY，P2區(qū)段為L(zhǎng)VGLFGDNENQSTVKTNSVPNMSLDQSVVEL；P3區(qū)段為 QIVSLQLNKMKSRKSCGI。分析顯示，MOMP與其他孔蛋白相似，為桶狀三維結(jié)構(gòu)，候選表位位于桶狀結(jié)構(gòu)的表面，暴露性較好，易與抗體結(jié)合，在蛋白分子構(gòu)象上符合表位設(shè)計(jì)要求。

圖2 沙眼衣原體MOMP的免疫優(yōu)勢(shì)表位及三維結(jié)構(gòu)

3 討論

沙眼衣原體是一種專性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，主要感染泌尿生殖系統(tǒng)和眼上皮細(xì)胞。在一些受感染的女性中，沙眼衣原體遷移到上生殖道，導(dǎo)致慢性無(wú)癥狀感染。目前還沒有用于預(yù)防沙眼衣原體的商業(yè)化疫苗，部分原因在于對(duì)感染期間沙眼衣原體引發(fā)特異性免疫反應(yīng)的認(rèn)知不夠深入[2-3]。

沙眼衣原體MOMP能夠與宿主蛋白相互作用并抑制吞噬體與溶酶體融合，是疫苗開發(fā)的主導(dǎo)方向。MOMP是一類富含半胱氨酸的跨膜蛋白，具有孔蛋白功能，預(yù)測(cè)有天然的三聚體結(jié)構(gòu)，拓?fù)淠Ｐ蜑棣峦敖Y(jié)構(gòu)。因此，很難獲得具有完整天然構(gòu)象表位形式的MOMP。最近報(bào)道，基于MOMP VD4區(qū)域開發(fā)的候選疫苗沙眼衣原體H522可誘導(dǎo)小鼠和人體產(chǎn)生中和抗體。但中和抗體是否足以為女性泌尿生殖道沙眼衣原體感染、發(fā)揮保護(hù)作用還有待觀察[15]。因此，設(shè)計(jì)表位疫苗最好能覆蓋沙眼衣原體的B細(xì)胞、CTL、Th表位，不僅可以解決免疫優(yōu)勢(shì)問題，還可以產(chǎn)生廣泛的免疫應(yīng)答。

B細(xì)胞被認(rèn)為是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的核心組成部分，因?yàn)槠渚哂凶R(shí)別和提供長(zhǎng)期保護(hù)免受感染性病原體或腫瘤細(xì)胞侵襲的能力，通過產(chǎn)生抗體來(lái)執(zhí)行這些功能。我們通過IEDB服務(wù)器中的BepiPred2.0算法對(duì)沙眼衣原體MOMP抗原序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)合其二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性等，從構(gòu)象及線性表位進(jìn)行評(píng)估，推測(cè)沙眼衣原體MOMP可能的B細(xì)胞表位主要集中在MOMP的N端第42～52 aa、161～179 aa、259～265 aa、349～358 aa區(qū)段。這些區(qū)段多位于無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)中，發(fā)生扭曲、折疊的幾率較高，易與抗體嵌和[16]。

T細(xì)胞免疫療法可以識(shí)別并殺死受沙眼衣原體感染的細(xì)胞，為了實(shí)施這種療法，需要考慮到等位基因MHC Ⅰ（HLA）限制性，以更好地滿足絕大部分種族群體的抗原識(shí)別[17]。我們通過不同算法的MHC Ⅰ類分子在線預(yù)測(cè)工具，選擇了HLA-A*02：01、HLA-A*03、HLA-B*07：02類分子3種MHC Ⅰ限制類型，篩選出預(yù)測(cè)分值較高且有意義的沙眼衣原體CTL表位。最終獲得4個(gè)分值較高的HLA-A*02：01限制性表位（177～185 aa、280～288 aa、282～290 aa、318～326 aa）、4個(gè)分值較高的HLA-A*03限制性表位（57～65 aa、72～80 aa、342～350 aa、347～355 aa）、1個(gè)分值較高的HLA-A*03限制性表位（27～35 aa）。

同樣，為了使預(yù)測(cè)的Th表位有更好的受眾性，我們選擇亞裔抗原頻率較高的HLA-DRB1*01：01、HLA-DRB1*1501、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLADRB1*1101類分子，共7種MHC Ⅱ限制類型[18-20]。通過RANKPEP和SYFPEITHI兩種MHC Ⅱ類分子親和肽預(yù)測(cè)工具，分別預(yù)測(cè)9個(gè)、15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的Th細(xì)胞表位。不同長(zhǎng)度的候選Th表位肽中，兩種方法預(yù)測(cè)結(jié)果范圍比較接近。SYFPEITHI預(yù)測(cè)的表位數(shù)目較多，且涵蓋大部分RANKPEP所預(yù)測(cè)的九肽，僅在HLA-DRB1*0801表型，RANKPEP單獨(dú)預(yù)測(cè)出具有意義的Th細(xì)胞表位。

總之，本研究通過生物信息學(xué)方法對(duì)沙眼衣原體MOMP免疫表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，獲得3個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)表位，位于蛋白N端的42～65 aa、155～185 aa區(qū)段和C端的342～359 aa區(qū)段，為沙眼衣原體篩選新的診斷抗原分子和候選疫苗抗原、拓寬免疫保護(hù)范圍提供了參考，但上述候選表位肽的實(shí)際應(yīng)用效果還有待于具體實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。