孫光慧，郭叢叢，時(shí)吉來，楊博文，張珊珊

1山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，濟(jì)南 250355；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科；3濟(jì)南市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科

黎明現(xiàn)象是指糖尿病患者在晚間血糖控制良好亦無低血糖的情況下，出現(xiàn)早晨血糖異常升高的現(xiàn)象。黎明現(xiàn)象是血糖波動(dòng)的重要表現(xiàn)形式，而血糖波動(dòng)是糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變等糖尿病并發(fā)癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1-2]。研究顯示，超過半數(shù)的1型糖尿病和2型糖尿病患者存在黎明現(xiàn)象[3-4]。目前黎明現(xiàn)象的防治措施有限，口服降糖藥不能充分控制黎明現(xiàn)象，基礎(chǔ)胰島素類似物雖然可以減少黎明現(xiàn)象的發(fā)生，但仍存在夜間低血糖的風(fēng)險(xiǎn)。宣白承氣湯為清代醫(yī)學(xué)家吳鞠通的代表方劑之一，是宣肺通腑法的典型代表。該方由生石膏、生大黃、杏仁粉、瓜蔞皮組成，可宣肺降氣、清熱通腑、調(diào)理肺大腸經(jīng)氣血運(yùn)行。目前宣白承氣湯對2型糖尿病患者黎明現(xiàn)象的影響相關(guān)研究較少。核受體亞家族1組D成員1（Nr1D1）基因是生物鐘系統(tǒng)的調(diào)控基因之一，在機(jī)體的骨骼肌、脂肪、肝臟、單核細(xì)胞等中表達(dá)，與機(jī)體糖代謝密切相關(guān)。本研究觀察了宣白承氣湯聯(lián)合強(qiáng)化胰島素治療2型糖尿病患者黎明現(xiàn)象的效果，并基于與Nr1D1的相互作用，采用分子對接技術(shù)篩選宣白承氣湯治療黎明現(xiàn)象的主要成分，為治療2型糖尿病黎明現(xiàn)象藥物的開發(fā)提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年7月—2021年5月在山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院治療的2型糖尿病合并黎明現(xiàn)象的患者進(jìn)入研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國2型糖尿病防治指南（2017年版）》制訂的2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)；②符合黎明現(xiàn)象的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即空腹血糖與夜間最低點(diǎn)血糖凈增值（?glucose1）≥1.11 mmol/L[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①夜間出現(xiàn)低血糖反應(yīng)或蘇木杰現(xiàn)象；②近3個(gè)月內(nèi)應(yīng)用類固醇激素等其他激素藥物；③急性糖尿病并發(fā)癥（糖尿病酮癥酸中毒、乳酸酸中毒、高滲性非酮癥糖尿病昏迷）、急性心腦血管事件、慢性腹瀉、感染、外傷、手術(shù)等急性應(yīng)激狀態(tài)及肝腎疾病、藥物等引起的繼發(fā)性血糖升高；④患有某些能干擾認(rèn)知功能評價(jià)的疾病；⑤對本研究藥物成分過敏及目前處于或準(zhǔn)備妊娠、哺乳的婦女。共納入2型糖尿病患者60例，男32例、女28例，年齡36～ 65（52.57±6.84）歲，糖尿病病程半年至17年。根據(jù)性別、年齡、病程、HbA1c水平進(jìn)行匹配，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和觀察組各30例。兩組性別、年齡、病程等資料具有可比性。

1.2 治療方法 入組患者均給予糖尿病健康教育；早、中、晚三餐均按照糖尿病食譜飲食，時(shí)間分別為7：00、12：00、17：00；適度強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)；每天 22：00就寢；戒除煙酒，保持心態(tài)平和；在不影響本次試驗(yàn)結(jié)果的前提下，對合并有高血壓病、高脂血癥的患者常規(guī)給予降壓、降脂藥物治療。根據(jù)血糖水平調(diào)整降糖藥物劑量。治療3 d。對照組停用口服降糖藥，使用門冬胰島素[諾和諾德（中國）制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字S20100049，規(guī)格300 U/3 mL]+地特胰島素[諾和諾德（中國）制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20090101，規(guī)格300 U/3 mL]強(qiáng)化胰島素治療。觀察組在對照組基礎(chǔ)上給予宣白承氣湯治療。宣白承氣湯方中生石膏15 g、生大黃9 g、苦杏仁6 g、瓜蔞皮9 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供，水煎400 mL，每日1劑，睡前溫服。兩組均連續(xù)治療7 d。

1.3 療效觀察 記錄兩組治療前后3 d的空腹血糖（FPG）、早餐后2 h血糖（2 h PG）、?glucose1、早餐后2 h血糖與空腹血糖凈增值（?glucose2）、日內(nèi)平均血糖（MBG）、日內(nèi)血糖波動(dòng)幅度（MAGE）。

1.4 中藥作用機(jī)制分析

1.4.1 中藥主要活性成分的獲取 以“大黃”“苦杏仁”“瓜蔞”為關(guān)鍵詞，利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//www.tcmspw.com）檢索獲得三種藥物的所有化學(xué)成分，以口服生物利用度＞30%、類藥性＞0.18條件篩選宣白承氣湯的活性成分[5]。使用Cytoscape3.8.2軟件繪制中藥—活性成分—靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4.2 中藥主要活性成分與Nr1D1蛋白靶標(biāo)的分子對接 在TCMSP和PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索化合物的二維結(jié)構(gòu)信息，并通過Chem3D19.0軟件將其轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)。從PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）中下載靶蛋白Nr1D1（PDB ID：1A6Y）的3D結(jié)構(gòu)。應(yīng)用Maestro11.5軟件進(jìn)行對接。用模塊Protein preparation wizard對1A6Y結(jié)構(gòu)進(jìn)行修正化學(xué)鍵序，加氫，處理二硫鍵、金屬離子，刪除晶體結(jié)構(gòu)中水分子、雜原子等預(yù)處理；使用Ligprep模塊處理配體，對化合物分子進(jìn)行加氫等優(yōu)化預(yù)處理；在力場OPLS3下，計(jì)算pH 7.0±2.0的化合物離子狀態(tài)，搜索合理構(gòu)象作為對接起始構(gòu)象，形成可能的互變異構(gòu)體，并生成批量處理文件；使用Receptor Grid Generation模塊創(chuàng)建蛋白質(zhì)受體網(wǎng)格點(diǎn)，確定活性口袋坐標(biāo)；采用Ligand Docking模塊對接已制備好的受體與配體，在Receptor grid file中導(dǎo)入將格點(diǎn)文件，對所有化合物進(jìn)行分子對接，參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。Docking score是受體與配體對接的打分值，分值越小說明受體親和力越強(qiáng)，兩者結(jié)合越牢固，以分值＜-5作為初步篩選條件[6]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS32.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組療效比較 兩組治療后FPG、2 h PG、?glucose1、MBG、MAGE均較治療前降低，且觀察組低于對照組（P均＜0.01）。兩組治療后?glucose2較治療前相比無明顯差別（P＞0.05），但觀察組低于對照組（P＜0.05）。見表1。對照組發(fā)生低血糖1例（3.3%），觀察組發(fā)生低血糖0例（0%），觀察組低血糖發(fā)生率低于對照組（P＜0.05）。

表1 兩組治療前后FPG、2 h PG、?glucose1、?glucose2、MBG、MAGE比較（mmol/L，±s）

表1 兩組治療前后FPG、2 h PG、?glucose1、?glucose2、MBG、MAGE比較（mmol/L，±s）

注：與同組治療前相比，**P＜0.01；與對照組治療后相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

2 h PG n FPG ?glucose1?glucose2MBG MAGE 組別觀察組治療前治療后對照組治療前治療后30 8.41±0.83 6.32±0.83**##10.22±0.97 8.19±0.58**##3.24±1.06 1.38±0.74**##1.81±0.75 1.87±0.68#8.01±0.53 6.75±0.41**##5.05±1.01 3.25±0.60**##30 1.97±1.14 2.12±0.89 8.39±0.71 7.15±0.76**10.35±1.034 9.27±1.071**3.01±1.07 1.97±0.68**8.16±0.50 7.57±0.65**4.97±1.20 4.09±1.07**

2.2 中藥作用機(jī)制分析結(jié)果 篩選得到宣白承氣湯的45種主要活性成分，其中瓜蔞11個(gè)、杏仁18個(gè)、大黃16個(gè)。將篩選出的宣白承氣湯的45種活性成分和Nr1D1蛋白靶標(biāo)進(jìn)行對接，根據(jù)對接結(jié)果（表2），Docking score絕對值大于5.0的受體化合物有15個(gè)，其中11個(gè)成分來自大黃（MOL000554、MOL002280、MOL002260、MOL002259、MOL002288、MOL002235、MOL002268、MOL000096、MOL002281、MOL002293、MOL002276），3個(gè)成分來自杏仁（MOL000492、MOL007202、MOL010921），1個(gè)成分來自瓜蔞（MOL002881），3味中藥均可通過活性成分作用于Nr1D1，以君藥大黃的作用最為顯著。Docking score最高的前5個(gè)成分均來自大黃（Docking score＜-6）。這5個(gè)成分與Nr1D1對接構(gòu)象見OSID碼圖1，其中共同的活性口袋（即主要作用的活性位 點(diǎn)）有 PHE111、ARG172、GLY174、TYR113、LYS122、ARG126、TYR113、GLY174、GLU119、PHE173、SER109和HID112。

表2 宣白承氣湯活性成分與Nr1D1分子對接結(jié)果

3 討論

本次研究結(jié)果提示，宣白承氣湯聯(lián)合強(qiáng)化胰島素治療優(yōu)于單純應(yīng)用強(qiáng)化胰島素治療，不僅可有效降低合并黎明現(xiàn)象2型糖尿病患者的FPG、減少日間血糖波動(dòng)，還可降低低血糖風(fēng)險(xiǎn)。分子對接技術(shù)可模擬分子結(jié)構(gòu)及分子間作用，尋找受體與配體間作用的最佳構(gòu)象，以化學(xué)計(jì)量形式預(yù)測結(jié)合的模式和親和力。分子對接技術(shù)能夠快速篩選發(fā)現(xiàn)藥用成分與潛在靶點(diǎn)，對于一些疾病的新靶點(diǎn)研究與新藥研發(fā)具有重要意義。本研究運(yùn)用分子對接技術(shù)，將篩選的宣白承氣湯45種化學(xué)成分與2型糖尿病黎明現(xiàn)象發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵靶點(diǎn)Nr1D1進(jìn)行對接，發(fā)現(xiàn)宣白承氣湯有15個(gè)成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)Nr1D1有良好的結(jié)合活性，其中對接活性最強(qiáng)的5個(gè)成分[沒食子酸-3-O-（6'-O-沒食子?；?葡萄糖苷、蘆薈大黃素8-O-β-D-（6'-oxayl）-葡萄糖苷、原花青素 B-5，3'-O-沒食子酸酯、大黃素甲醚雙葡萄糖苷、大黃素-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷]均來自君藥大黃。這提示大黃在治療黎明現(xiàn)象方面具有潛在優(yōu)勢。

目前，黎明現(xiàn)象確切的發(fā)生機(jī)制還不完全清楚。醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為，黎明現(xiàn)象是在胰島β細(xì)胞功能減退的基礎(chǔ)上，清晨內(nèi)源性葡萄糖產(chǎn)量增加和持續(xù)性胰島素抵抗共同作用的結(jié)果[7-8]，而肝臟糖異生增強(qiáng)則是內(nèi)源性葡萄糖產(chǎn)量增加的主要原因[8]。近年來生物鐘系統(tǒng)對機(jī)體糖脂代謝的調(diào)節(jié)成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，正常生理狀態(tài)下，葡萄糖耐量、糖原儲存、胰島素分泌、胰島素敏感性等均表現(xiàn)出一定的晝夜節(jié)律，肝臟糖異生也不例外，肝臟糖異生在覺醒前后達(dá)到高峰，以防止睡眠中出現(xiàn)低血糖，并為覺醒后的活動(dòng)提供能量[9]。肝臟糖異生同時(shí)受中樞生物鐘及肝臟生物鐘的調(diào)控[10]。

中樞生物鐘系統(tǒng)位于前下丘腦的視交叉上核（SCN），通過感知光照維持機(jī)體24 h的生物鐘周期性變化，為機(jī)體內(nèi)其他外圍時(shí)鐘設(shè)定了基線時(shí)間[10]。SCN將“時(shí)間信息”傳遞給其他組織器官及細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)外周組織生物鐘的同步化。SCN區(qū)GABA神經(jīng)元（SCNGABA）中富集著Nr1D1基因，該基因是生物鐘系統(tǒng)及機(jī)體代謝的中央調(diào)節(jié)器。近期相關(guān)研究證實(shí)，SCNGABA中的Nr1D1控制著肝臟胰島素的晝夜敏感性，是調(diào)控肝臟糖異生、導(dǎo)致黎明現(xiàn)象的關(guān)鍵基因。與無黎明現(xiàn)象患者相比，黎明現(xiàn)象患者Nr1D1節(jié)律表達(dá)異常，于19：00～1：00活性呈下降趨勢。敲除中樞生物鐘系統(tǒng)Nr1D1基因表達(dá)，可導(dǎo)致小鼠黎明現(xiàn)象發(fā)生[11]。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）是糖異生過程中的限速酶[12]，肝臟中過表達(dá)PCK1會(huì)導(dǎo)致糖異生亢進(jìn)、血糖升高，導(dǎo)致黎明現(xiàn)象的發(fā)生。YUAN等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Nr1D1通過與基因啟動(dòng)子中的特異反應(yīng)元件（一個(gè)RevRE位點(diǎn)）結(jié)合，直接抑制肝臟PCK1的轉(zhuǎn)錄，降低空腹血糖。這提示于該時(shí)段干預(yù)黎明現(xiàn)象患者的Nr1D1活性可能通過PCK1調(diào)節(jié)肝臟糖異生。

中醫(yī)認(rèn)為，人體是一個(gè)有機(jī)整體，其處于陰陽平衡的狀態(tài)，陰陽失調(diào)則變生疾病。外界環(huán)境的空間或時(shí)間變化會(huì)對人體生理活動(dòng)和疾病的發(fā)生有重大影響。在中醫(yī)理論中，肺朝百脈，指肺通過呼吸運(yùn)動(dòng)，調(diào)節(jié)全身氣機(jī)，促進(jìn)血液運(yùn)行；肺主治節(jié)，指肺氣具有治理調(diào)節(jié)肺之呼吸及全身之氣、血、水的作用。由此可見，肺氣對機(jī)體的影響與Nr1D1對生命生物鐘的影響有著相通之處。中醫(yī)理論認(rèn)為，一天十二時(shí)辰分別對應(yīng)十二經(jīng)脈，人體氣血按照各時(shí)辰依次流注于各經(jīng)絡(luò)臟腑，其中日落至清晨的6個(gè)時(shí)辰分別為戌時(shí)（19：00～21：00，對應(yīng)心包經(jīng)）、亥時(shí)（21：00～23：00，對應(yīng)三焦經(jīng)）、子時(shí)（23：00～1：00，對應(yīng)膽經(jīng)）、丑時(shí)（1：00～3：00，對應(yīng)肝經(jīng)）、寅時(shí)（3：00～5：00，對應(yīng)肺經(jīng)）和卯時(shí)（次晨5：00～7：00，對應(yīng)大腸經(jīng)）。根據(jù)中醫(yī)的子午氣血流注的整體觀念，血糖波動(dòng)是人體氣血流注異常的一種表現(xiàn)形式[14]。黎明現(xiàn)象發(fā)生在清晨，具有明顯的時(shí)間特征，對應(yīng)子午流注寅、卯時(shí)，是肺與大腸經(jīng)氣血流注盛時(shí)[15]。因此，肺、大腸氣血流注異?？赡苁窃斐衫杳鳜F(xiàn)象的關(guān)鍵病機(jī)。臨床經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，宣白承氣湯在晚飯至睡前服用療效較好，我們推測這可能與宣白承氣湯激活Nr1D1的活性有關(guān)，從而調(diào)暢了清晨的氣血流注，抑制黎明現(xiàn)象。

宣白承氣湯為清代醫(yī)學(xué)家吳鞠通的代表方劑之一，由生石膏、生大黃、杏仁粉、瓜蔞皮組成。方中以生石膏入肺經(jīng)，清熱瀉火、除煩止渴，生大黃入大腸經(jīng)，攻下腑實(shí)，共為君藥；苦杏仁入肺與大腸經(jīng)，善降氣，具有降氣平喘、潤腸通便之功；瓜蔞皮入肺經(jīng)，具有清熱潤肺化痰之功，二者共為臣藥。腑實(shí)得下，則肺熱易清，肺氣清肅，則腑氣亦通。大黃是該方的君藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃有效成分大黃素、大黃酸、番瀉苷等可通過不同靶點(diǎn)降低胰島素水平、提高胰島素敏感性、糾正胰島素抵抗。其中，大黃酸可以通過減少碳水化合物吸收來減輕胰島素抵抗，通過改變糖尿病小鼠腸道菌群而糾正糖代謝紊亂[16-18]。

生石膏是宣白承氣湯的另一君藥，主要成分為含水硫酸鈣，味辛、甘，性大寒，清熱瀉火、除煩止渴。有研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+在SCN神經(jīng)元中傳遞核心生物鐘的輸入和輸出信號，是生物鐘重置的關(guān)鍵分子，對生物鐘的光反應(yīng)至關(guān)重要[19]。血糖代謝及相關(guān)激素分泌等生理過程具有晝夜節(jié)律?？诜嗫梢栽黾友錍a2+濃度[20]，加快生物鐘調(diào)整反應(yīng)速度，減少晝夜節(jié)律紊亂的影響。杏仁與瓜蔞皮是宣白承氣湯中的臣藥。劉雪峰等[21]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，杏仁多肽與杏仁多肽能有效調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血糖，對糖尿病具有輔助治療效果。王歲歲[22]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，瓜蔞皮可能通過改變糖尿病小鼠腸道微生物群而改善糖尿病小鼠的糖脂代謝，實(shí)現(xiàn)降低血糖、糾正胰島素抵抗的作用。

綜上所述，本研究基于臨床研究和分子對接的方法對宣白承氣湯輔助治療糖尿病患者黎明現(xiàn)象的效果及機(jī)制進(jìn)行了探索。研究結(jié)果顯示，宣白承氣湯聯(lián)合強(qiáng)化胰島素療效顯著，可抑制2型糖尿病患者的黎明現(xiàn)象，減少日間血糖波動(dòng)。該方以君藥大黃為主的活性成分與Nr1D1有較強(qiáng)的對接活性，其對接位點(diǎn)的信息為宣白承氣湯的臨床應(yīng)用和未來實(shí)驗(yàn)研究提供了科學(xué)依據(jù)。