林立營，張文 ，史要鵬，姜梅榮，張冬燕

1聊城市人民醫(yī)院口腔科聊城市人民醫(yī)院精準(zhǔn)生物醫(yī)學(xué)重點實驗室，山東聊城 252000；2聊城市東昌府區(qū)中醫(yī)院口腔科

破骨細胞是骨吸收的功能細胞，在病理狀態(tài)下（如頜骨腫瘤、囊腫和牙周炎等），破骨細胞分化增強或功能亢進，引起骨量失衡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[1]。因此，研究破骨細胞的分化和功能對于骨吸收性疾病的防治有重要意義。破骨細胞由髓系單核細胞分化而來，在核因子κB受體激活因子配體（RANKL）的作用下，破骨前體細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的IP3受體（IP3R）被激活，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣外流，導(dǎo)致細胞質(zhì)中的T細胞活化核因子1（NFATc1）去磷酸化并轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，啟動破骨細胞分化相關(guān)基因的表達[2-3]。溶酶體是破骨細胞中含量較多的細胞器，可以為骨吸收提供必需的酶及酸[4-5]。位于溶酶體膜上的空泡型質(zhì)子泵（V-ATPase）包括V0和V1兩個結(jié)構(gòu)域，其中V0的a亞基是氫離子轉(zhuǎn)運通道，a亞基包括a1～a4四個蛋白異構(gòu)體[6]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，敲低小鼠骨髓單核細胞（BMMs）中a3亞基編碼的T細胞免疫調(diào)節(jié)因子1（TCIRG1）表達，可通過抑制IP3R2表達導(dǎo)致NFATc1入核障礙，抑制大體積破骨細胞的分化[7]。氯喹能降低溶酶體的酸度[8]，也能抑制破骨細胞分化[9]。2020年4月—2022年4月，本研究觀察了氯喹對BMMs向破骨細胞分化的抑制作用，并基于TCIRG1調(diào)控探討相關(guān)機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 雄性C57BL/6小鼠20只，鼠齡4～6周，體質(zhì)量約30 g，由北京唯尚立拓科技有限公司提供。巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）和RANKL購于美國R&D公司；PDMPO購于美國AAT Bioquest公司；TCIRG1抗體購自Abcam公司；NFATc1、IP3R2抗體購自Santa Cruz公司；DAB購于美國Cell Signaling公司；腺病毒購于上海吉凱生物科技有限公司。淋巴細胞分離液、氯喹、TRAP染色試劑盒購自美國Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本Takara公司。流式細胞儀，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，倒置相差顯微鏡，電泳儀，轉(zhuǎn)印槽，電泳槽。

1.2 BMMs的獲取及分組 小鼠在麻醉下頸部脫臼處死，無菌分離肱骨和股骨。剪去小鼠長骨的干骺端，用預(yù)溫的培養(yǎng)液（α-MEM+10%FBS+2%青鏈霉素+25 ng/mL M-CSF）沖出骨髓，吹打混勻后置入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸取未貼壁的細胞至離心管，緩慢加入到等體積淋巴細胞分離液上方，室溫下以2 000 r/min離心30 min，吸取中間白膜層細胞即為小鼠BMMs。細胞經(jīng)過無菌PBS清洗離心2遍后，于含25 ng/mL M-CSF、5 ng/mL RANKL的α-MEM中培養(yǎng)。將細胞分為對照組、氯喹1組、氯喹2組，隨誘導(dǎo)液分別加入0、5、10μmol/L的氯喹。

1.3 BMMs向破骨細胞分化情況觀察

1.3.1 破骨細胞分化情況觀察 采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色。3組細胞在誘導(dǎo)96 h后停止培養(yǎng)，PBS沖洗，用4%多聚甲醛于室溫下固定20 min。之后根據(jù)試劑盒說明配制染液，37℃避光孵育30 min，鏡下隨檢。出現(xiàn)紫紅色染色為TRAP陽性細胞，即破骨細胞。

1.3.2 破骨細胞分化相關(guān)基因檢測 將小鼠BMMs接種于6孔板中，分組及給藥操作同“1.2”，加入RANKL、M-CSF誘導(dǎo)48 h。用TRIzol提取細胞總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，分別將3組細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR法檢測破骨細胞分化相關(guān)基因 TCIRG1、NFATc1、Dc-stamp、MMP9、Oscar、IP3R1、IP3R2、IP3R3 mRNA。目的基因引物序列見表1，以GAPDH作為內(nèi)參，實驗重復(fù)至少3次。

表1 TCIRG1、NFATc1、Dc-stamp、MMP9、Oscar、IP3R1、IP3R2、IP3R3、GAPDH基因引物序列

1.4 細胞中 TCIRG1、NFATc1、IP3R2蛋白檢測 采用Western blotting法檢測TCIRG1、NFATc1、IP3R2蛋白。將小鼠BMMs接種于6孔板中，分組及給藥操作同“1.2”，加入RANKL、M-CSF誘導(dǎo)48 h；每孔加入80μL含有1%PMSF的RIPA裂解液冰上裂解細胞30 min后收集細胞，低溫12 000 r/min離心15 min，上清即為總蛋白；高溫變性總蛋白并用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白；將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，封閉蛋白1 h，添加TCIRG1、NFATc1、IP3R2抗體4℃孵育過夜；復(fù)溫后的PVDF膜用TBS-T沖洗3遍，添加二抗常溫孵育1 h，TBS-T沖洗3次；置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)內(nèi)拍照分析。采用免疫組化染色檢測NFATc1蛋白。將小鼠BMMs以1×105/孔接種于24孔板中，分組及給藥方法參照“1.2”，用RANKL、M-CSF誘導(dǎo)三組細胞96 h后終止培養(yǎng)；洗棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定20 min后以0.5%Triton X-100通透樣本5 min；用3%山羊血清封閉1 h后滴加NFATc1抗體（1：200）封閉過夜，PBS沖洗3遍，加二抗常溫孵育1 h；用DAB進行染色，顯微鏡下觀察NFATc1蛋白表達情況及其在細胞中的定位。

1.5 細胞溶酶體酸化相關(guān)指標(biāo)檢測 將小鼠BMMs接種于6孔板中，分組及給藥操作同“1.2”，加入RANKL、M-CSF誘導(dǎo)48 h；棄培養(yǎng)液，加入含有3μmol/L PDMPO的新培養(yǎng)液在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min。PDMPO特異性聚集在溶酶體中，可被405 nm紫光激發(fā)，并且隨著pH增高，發(fā)射光越短。孵育完成后收集、清洗細胞，采用流式細胞儀（激發(fā)光405 nm，發(fā)射光421 nm）和BV510通道（激發(fā)光405 nm，發(fā)射光510 nm）檢測溶酶體酸化情況，用FlowJo7.6軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用RT-PCR法檢測ATP6 V0d2、ATP6 V1c1mRNA。細胞分組、給藥操作見“1.3.2”。引物序列見表2。

表2 ATP6 V0d2、ATP6 V1c1、GAPDH基因引物序列

1.6 氯喹對TCIRG1過表達BMMs向破骨細胞分化的影響觀察 將小鼠BMMs以1×105/孔接種于6孔板中，24 h后細胞進入對數(shù)生長期，以MOI=30的滴度在不同孔中分別加入含有綠色熒光蛋白（GFP）的過表達TCIRG1的腺病毒和空病毒，并將細胞置于5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)轉(zhuǎn)染。10 h后終止轉(zhuǎn)染，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，觀察GFP表達，評估轉(zhuǎn)染效率。將BMMs分為A、B、C、D組。A組轉(zhuǎn)染過表達TCIRG1的腺病毒并以10μmol/L氯喹刺激；B組轉(zhuǎn)染空病毒并以10μmol/L氯喹刺激；C組不轉(zhuǎn)染，給予10μmol/L氯喹；D組為空白組，不轉(zhuǎn)染也不添加氯喹。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Prism5.0統(tǒng)計軟件。采用Shapiro-Wilk檢驗驗證正態(tài)分布性，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組BMMs向破骨細胞分化指標(biāo)比較 氯喹1組、氯喹2組、對照組均可見TRAP染色陽性細胞，氯喹2組TRAP陽性細胞體積小于氯喹1組。見圖1。細胞分化48 h后，氯喹1組和氯喹2組細胞中NFATc1、Oscar、IP3R1、IP3R2、IP3R3 mRNA相對表達量低于對照組，氯喹2組Dc-stamp、MMP9 mRNA表達低于對照組（P均＜0.05）。見表3。氯喹1組、氯喹2組細胞中TCIRG1、NFATc1、IP3R2蛋白表達低于對照組，氯喹2組TCIRG1、NFATc1、IP3R2蛋白表達低于氯喹1組（P均＜0.05）。見表4。免疫組化染色顯示，氯喹2組細胞核中NFATc1表達減少。見圖2。

圖1 分化誘導(dǎo)96 h后三組TRAP染色陽性細胞情況

表3 分化誘導(dǎo)48 h后三組細胞NFATc1、Dc-stamp、Oscar、MMP9、IP3R1、IP3R2、IP3R3 mRNA相對表達量比較（±s）

表3 分化誘導(dǎo)48 h后三組細胞NFATc1、Dc-stamp、Oscar、MMP9、IP3R1、IP3R2、IP3R3 mRNA相對表達量比較（±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別氯喹1組氯喹2組對照組NFATc1 mRNA 0.296±0.020*0.107±0.012*1.000±0.000 Dc-stamp mRNA 0.854±0.039 0.689±0.044*1.000±0.000 Oscar mRNA 0.634±0.053*0.119±0.016*1.000±0.000 MMP9 mRNA 0.770±0.022 0.188±0.019*1.000±0.000 IP3R1 mRNA 0.364±0.024*0.248±0.010*1.000±0.000 IP3R2 mRNA 0.413±0.017*0.334±0.022*1.000±0.000 IP3R3 mRNA 0.465±0.048*0.264±0.016*1.000±0.000

表4 各組細胞中NFATc1、TCIRG1、IP3R2蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組細胞中NFATc1、TCIRG1、IP3R2蛋白相對表達量比較（±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與氯喹1組相比，#P＜0.05。

組別氯喹1組氯喹2組對照組IP3R2 0.849±0.113*0.548±0.098*#1.343±0.255 NFATc1 1.204±0.147*0.455±0.082*#2.649±0.159 TCIRG1 1.032±0.166*0.517±0.098*#2.029±0.071

圖2 各組細胞NFATc1蛋白表達情況（免疫組化染色）

2.2 各組細胞溶酶體酸化相關(guān)指標(biāo)比較 對照組、氯喹1組、氯喹2組細胞主群的熒光信號逐漸傾向于發(fā)射光短的BV421通道，提示溶酶體pH增高，酸度降低。見圖3。氯喹1組、氯喹2組TCIRG1、ATP6 V0d2、ATP6 V1c1mRNA相對表達量低于對照組，且氯喹2組低于氯喹1組（P均＜0.05）。見表5。

圖3 各組細胞誘導(dǎo)分化48 h后溶酶體酸化情況檢測結(jié)果（流式細胞術(shù)）

表5 各組細胞誘導(dǎo)分化48 h后ATP6 V0d2、ATP6 V1c1 mRNA表達比較（±s）

表5 各組細胞誘導(dǎo)分化48 h后ATP6 V0d2、ATP6 V1c1 mRNA表達比較（±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與氯喹1組相比，#P＜0.05。

組別氯喹1組氯喹2組對照組ATP6 V1c1mRNA 0.614±0.018*0.414±0.021*#1.000±0.000 ATP6 V0d2mRNA 0.516±0.022*0.219±0.016*#1.000±0.000

2.3 氯喹對TCIRG1過表達BMMs向破骨細胞分化的影響 與B、C組相比，A組出現(xiàn)了一些體積較大的TRAP陽性細胞，但是數(shù)量和體積未超過D組。見圖4。A組NFATc1、IP3R2 mRNA及蛋白表達高于B、C組，但低于D組（P均＜0.05）。見表6、表7。

圖4 A、B、C、D組細胞誘導(dǎo)96 h后TRAP染色情況

表6 A、B、C、D組細胞誘導(dǎo)分化48 h后NFATc1、TCIRG1、IP3R2蛋白表達比較（±s）

表6 A、B、C、D組細胞誘導(dǎo)分化48 h后NFATc1、TCIRG1、IP3R2蛋白表達比較（±s）

注：與D組相比，*P＜0.05；與A組相比，#P＜0.05。

組別A組B組C組D組TCIRG1 1.518±0.125*0.616±0.111*#0.549±0.138*#2.129±0.094 NFATc1 1.236±0.129*0.437±0.097*#0.407±0.104*#2.713±0.210 IP3R2 0.843±0.114*0.553±0.084*#0.521±0.071*#1.511±0.187

表7 A、B、C、D組細胞誘導(dǎo)分化48 h后TCIRG1、NFATc1、IP3R1、IP3R2、IP3R3 mRNA表達比較（±s）

表7 A、B、C、D組細胞誘導(dǎo)分化48 h后TCIRG1、NFATc1、IP3R1、IP3R2、IP3R3 mRNA表達比較（±s）

注：與D組相比，*P＜0.05；與A組相比，#P＜0.05。

組別A組B組C組D組IP3R3 mRNA 0.325±0.027*0.339±0.020*0.326±0.029*1.000±0.000 TCIRG1 mRNA 0.784±0.034*0.450±0.043*#0.498±0.038*#1.000±0.000 NFATc1 mRNA 0.583±0.016*0.220±0.018*#0.224±0.027*#1.000±0.000 IP3R1 mRNA 0.306±0.038*0.257±0.038*0.282±0.029*1.000±0.000 IP3R2 mRNA 0.513±0.019*0.334±0.035*#0.310±0.026*#1.000±0.000

3 討論

NFATc1在破骨細胞中高表達，是破骨細胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子[10]。NFATc1通常以非活化的磷酸化狀態(tài)位于破骨前體細胞的胞質(zhì)中。當(dāng)破骨前體細胞感受到來自外界的RANKL后，通過與RANK及其配體結(jié)合，經(jīng)過級聯(lián)反應(yīng)活化磷脂酶Cγ并產(chǎn)生IP3；IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的IP3R結(jié)合后誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子外流，形成鈣振蕩并激活鈣調(diào)磷酸激酶；活化的鈣調(diào)磷酸激酶作用于NFATc1，使其去磷酸化并轉(zhuǎn)位進入細胞核內(nèi)，結(jié)合到染色體特定部位，以啟動子功能啟動破骨細胞分化相關(guān)基因如Dc-stamp、MMP9、Oscar等的表達，啟動向破骨細胞分化[11-12]。研究表明，氯喹可抑制破骨細胞分化[9，13]。氯喹可抑制RANKL引起的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（TRAF3）降解，降解后的TRAF3會與NFATc1競爭結(jié)合鈣調(diào)磷酸激酶，使得去磷酸化的NFATc1相對減少從而實現(xiàn)對破骨細胞分化的抑制作用[10]。

NFATc1由鈣調(diào)磷酸激酶直接激活，而鈣調(diào)磷酸激酶活化與否受細胞內(nèi)鈣振蕩信號的影響。細胞內(nèi)鈣離子主要存儲于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，IP3Rs是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上釋放鈣離子的通道，IP3Rs的表達會直接影響鈣離子釋放從而調(diào)控鈣調(diào)磷酸激酶活化。研究發(fā)現(xiàn)，氯喹可以抑制某些細胞中IP3Rs的表達，如B淋巴細胞[14]、骨骼肌細胞[15]、CD4+T 淋巴細胞[16]。IP3R有三種類型，包括IP3R1、IP3R2、IP3R3，其中IP3R1介導(dǎo)短時間的鈣振蕩，IP3R2介導(dǎo)持續(xù)性的鈣振蕩，IP3R3介導(dǎo)瞬時鈣振蕩。IP3R2介導(dǎo)的長時間持續(xù)性的鈣振蕩對破骨前體細胞分化有重要意義[17-18]。IP3Rs表達減少對減少NFATc1入核有重要意義。

本研究以氯喹作用于小鼠BMMs，并給予MCSF、RANKL誘導(dǎo)分化，結(jié)果顯示，氯喹組TRAP陽性細胞體積減小，破骨細胞分化相關(guān)基因和蛋白如TCIRG1、NFATc1、IP3R2等表達均減少，NFATc1的入核轉(zhuǎn)位抑制，與之前的研究結(jié)果一致。提示氯喹可能通過調(diào)控 TCIRG1、NFATc1、IP3R2表達，起到抑制BMMs向破骨細胞分化的作用。

TCIRG1是V-ATPase V0亞基a3蛋白的編碼基因，該基因缺陷會引起體積小且功能差的破骨細胞分化，導(dǎo)致骨質(zhì)增多，誘發(fā)骨質(zhì)硬化癥[19-20]。VATPase不僅是細胞內(nèi)液泡酸化的重要蛋白復(fù)合體[21-22]，在某些特殊的細胞類型（如腎臟細胞、內(nèi)耳細胞和破骨細胞），V-ATPase還能跟隨細胞內(nèi)囊泡膜融合到細胞膜上，調(diào)節(jié)細胞外環(huán)境的酸化[23]。VATPase的酸化功能主要依靠V-ATPase V0a亞基實現(xiàn)，a亞基是質(zhì)子轉(zhuǎn)運的通道，包括a1～a4四個蛋白異構(gòu)體[24]。其中a3蛋白在破骨細胞中的表達明顯高于其他細胞類型[25]。氯喹對溶酶體有趨化性，可以中和溶酶體的酸性。本研究結(jié)果顯示，氯喹可抑制小鼠BMMs中TCIRG1表達，降低溶酶體酸度。溶酶體酸度降低抑制破骨細胞的細胞外酸化能力，同時降低溶酶體酶活性，但其與破骨細胞分化的直接或間接相關(guān)性還需要進一步探討。

我們之前研究發(fā)現(xiàn)，敲低小鼠BMMs中的TCIRG1基因會下調(diào)IP3R2表達[7]。為探討氯喹的破骨細胞分化抑制作用與TCIRG1基因的關(guān)系，我們對TCIRG1過表達小鼠BMMs給予氯喹并刺激分化，結(jié)果顯示，與B、C組相比，A組出現(xiàn)了一些體積較大的TRAP陽性細胞，但是數(shù)量和體積未超過D組；A組NFATc1、IP3R2 mRNA及蛋白表達高于B、C組，但低于D組，提示TCIRG1過表達可以部分逆轉(zhuǎn)氯喹對破骨細胞分化的抑制作用，但氯喹對IP3R的抑制作用可能不完全通過抑制TCIRG1實現(xiàn)。我們還發(fā)現(xiàn)，過表達TCIRG1基因只對IP3R2的表達有調(diào)控作用，而對IP3R1、IP3R3表達無明顯影響，具體原因尚需進一步探討。

以上結(jié)果表明，在小鼠BMMs向破骨細胞分化的過程中，氯喹會抑制TCIRG1、IP3R2表達及NFATc1的表達和入核，從而抑制破骨細胞分化。TCIRG1過表達可以部分逆轉(zhuǎn)氯喹對破骨細胞分化的抑制作用，氯喹對破骨細胞分化的抑制作用可能部分通過調(diào)控TCIRG1、IP3R2、NFATc1而實現(xiàn)。